絞股藍中1個新的葫蘆烷型皂苷類化合物

婁云云，牟 龍，黃亞萍，張 健，殷志琦，潘 珂

?化學成分 ?

絞股藍中1個新的葫蘆烷型皂苷類化合物

婁云云1, 2，牟 龍2，黃亞萍2，張 健3，殷志琦2，潘 珂1*

1. 中國藥科大學中藥學院 天然藥物化學系，江蘇 南京 211198 2. 中國藥科大學中藥學院 中藥制藥系&天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009 3. 江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室，江蘇 南京 210028

對絞股藍的總皂苷提取物進行化學成分研究。綜合應用多種色譜技術(shù)進行分離純化，通過各種現(xiàn)代譜學技術(shù)對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。從絞股藍的總皂苷提取物中分離得到2個葫蘆烷型三萜皂苷類化合物，分別鑒定為葫蘆素L-2--{[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基-(1→3)]-β--吡喃葡萄糖基}-25--β--吡喃木糖苷（1）、葫蘆素L-2--[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基-(1→3)]-β--吡喃葡萄糖苷（2）?；衔?為1個新化合物，命名為絞股藍葫蘆皂苷A。

絞股藍；絞股藍屬；葫蘆烷型；三萜皂苷；絞股藍葫蘆皂苷A；葫蘆素L-2--[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基-(1→3)]-β--吡喃葡萄糖苷

絞股藍(Thunb.) Makino，別名五爪龍、七葉參、公羅鍋底，葫蘆科（Cucurbitaceae）絞股藍屬Bl.草本植物，生于海拔300～3200 m的灌叢、路旁草叢、山谷密林和山坡疏林中。主要分布于我國陜西南部和長江以南各省，以及韓國、日本、馬來西亞等地[1-2]。絞股藍作為藥食兩用植物，有著“南方人參”的美譽，不僅具有清熱解毒、止咳祛痰的功效[1]，還具有治療高脂血癥、病毒性肝炎、慢性胃腸炎等功效[2]，而且在東南亞國家長期以來被廣泛用作蔬菜、涼茶和膳食補充劑[3]?；瘜W成分研究表明，絞股藍中含有皂苷、黃酮、甾體、多糖、氨基酸等多種化學成分[4-6]。其中絞股藍皂苷被認為是絞股藍的主要生物活性成分，目前已報道200余個絞股藍皂苷，其中8個皂苷為人參皂苷，其結(jié)構(gòu)類型均為達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷[5]。周文超等[7]首次從絞股藍種子中分離純化并鑒定得到葫蘆烷型皂苷單體化合物，豐富了絞股藍皂苷的結(jié)構(gòu)類型?，F(xiàn)代藥理學研究表明，絞股藍皂苷具有調(diào)血脂、保肝、抗腫瘤、改善認知功能障礙、抗炎等廣泛藥理活性[3-4,8-11]，顯示出良好的應用前景。本研究旨在深入挖掘絞股藍總皂苷提取物中的活性成分，從中分離純化獲得2個葫蘆烷型三萜皂苷，分別鑒定為葫蘆素L-2--{[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基- (1→3)]-β--吡喃葡萄糖基}-25--β--吡喃木糖苷（cucurbitacin L-2--{[a--rhamnopyranosyl-(1→2)][a--arabinopyranosyl-(1→3)]-β--glucopyranosyl}- 25--β--xylopyranoside，1）、葫蘆素L-2--[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基- (1→3)]-β--吡喃葡萄糖苷（cucurbitacin L-2--[a--rhamnopyranosyl-(1→2)][a--arabinopyranosyl- (1→3)]-β--glucopyranoside，2）。其中化合物1為新化合物，命名為絞股藍葫蘆皂苷A，化合物2為前人報道的從絞股藍種子中分離得到的葫蘆烷型皂苷。

1 儀器與材料

島津UV-2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；魯?shù)婪駻utopol IV旋光儀（美國魯?shù)婪蚬荆?；布魯克Tensor 27型紅外光譜儀（德國布魯克公司）；布魯克Avance-300及Avance-500型核磁共振波譜儀；安捷倫Q-TOF-6520型質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；安捷倫1260 Infinity 高效液相色譜儀；LabAlliance半制備液相色譜儀（美國SSI/LabAlliance 公司），半制備柱為COSMOSIL 5C18-AR-II（日本COSMOSIL公司）；100～200目和200～300目硅膠（青島海洋化工廠）；ODS RP-18硅膠和硅膠60 F254薄層色譜板（德國Merck公司）；ODS填料（日本YMC公司）；MCI填料（日本三菱化學公司）；甲醇、乙腈（色譜級，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?，實驗用水（杭州娃哈哈集團有限公司），-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽（九鼎化學上海科技有限公司），鄰甲苯異硫氰酸酯（上海安耐吉化學有限公司），-葡萄糖、-阿拉伯糖、-鼠李糖、-木糖（德國Merck公司），其他化學試劑均為分析純。

湖南產(chǎn)地絞股藍總皂苷提取物（批號T20170203）由湖南華寶通制藥有限公司提供，為絞股藍地上部分（帶果實）總皂苷提取物，原植物由中國藥科大學中藥學院秦民堅教授鑒定為絞股藍(Thunb.) Makino，植物標本（20161108）保存于中國藥科大學中藥制藥系。

2 提取與分離

取湖南產(chǎn)地絞股藍總皂苷提取物70.0 g，每次使用10倍量的甲醇超聲提取20 min，提取5次，合并提取液，濾過，濃縮，干燥，最終得到2個部位（純甲醇不溶部位Fr. 1和純甲醇可溶部位Fr. 2）。Fr.2（50.5 g）經(jīng)10%減活硅膠（取1000 g硅膠加入100 mL水，于搖床上混勻24 h）柱色譜，以三氯甲烷-甲醇-水（100∶0∶0→0∶100∶0）梯度洗脫，得到5個流分（Fr. 2a～2e）。Fr. 2e（10.5 g）采用10倍量的甲醇超聲提取20 min，提取5次，合并提取液，濾過，濃縮，干燥，得到2個流分（純甲醇不溶組份Fr. 2e1和純甲醇可溶組份Fr. 2e2）。Fr.2e2進一步通過MCI柱色譜分離，以甲醇-水（5∶95→100∶0）梯度洗脫，得到8個流分（Fr. 2e2a～2e2h），隨后Fr. 2e2c經(jīng)ODS反相柱色譜，甲醇-水（5∶95→100∶0）梯度洗脫得到5個流分（Fr. 2e2c1～2e2c5）。Fr. 2e2c4再經(jīng)過半制備液相分離純化，乙腈-水（21∶79）等度洗脫，得到化合物1（R＝42 min，65 mg）和2（R＝53 min，30 mg）。

3 酸水解和液相分析

稱取化合物1（3.0 mg），加入2 mol/L HCl（2.0 mL）、密封，于90 ℃反應3 h。反應液冷卻后，將反應混合物用水稀釋至5 mL，用醋酸乙酯（5 mL×3）萃取，然后將水層濃縮得到單糖部分，與標準糖（-葡萄糖、-阿拉伯糖、-木糖和-鼠李糖）進行薄層比較，Rf值相同。接下來，將水解得到的單糖部分和標準糖分別溶于含有-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽（2 mg）的吡啶（1 mL）中，并在60 ℃下加熱反應1 h。接著，加入鄰甲苯異硫氰酸酯（2 mg），并將溶液在60 ℃下繼續(xù)保持1 h。對反應混合物進行HPLC分析 [Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（25∶75），體積流量1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL]。通過比較標準糖衍生物和樣品單糖衍生物的保留時間（R），確定化合物中單糖的絕對構(gòu)型（-葡萄糖11.59 min，-阿拉伯糖13.37 min，-木糖13.74 min，-鼠李糖20.93 min）。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定型粉末，易溶于甲醇、吡啶等有機溶劑。[α]20 D–53.0°(0.1, MeOH)。在紫外燈254 nm下有暗斑，香草醛-濃硫酸反應顯棕黃色，Liebermann-Burchard和Molish反應均呈陽性，酸水解及衍生化HPLC檢出-葡萄糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖和-木糖。HR-TOF-MS顯示準分子離子峰: 1 106.537 0 [M＋NH4]+（計算值1 106.537 8），提示該化合物分子式為C52H80O24，相對分子質(zhì)量為1088，不飽和度為13。UV光譜顯示其在254.5 nm處有最大吸收；IR光譜顯示該化合物含有羥基吸收峰（3398 cm?1）以及C-H鍵（2976，2932 cm?1）、C=O鍵（1691 cm?1）、C=C鍵（1646 cm–1）的伸縮振動吸收峰。

1H-NMR譜中顯示該化合物含有2個烯氫信號6.40 (1H, d,= 2.5 Hz), 5.64 (1H, brs)，1個連氧次甲基氫信號4.90 (1H, overlapped)，8個甲基單峰氫信號1.63, 1.57, 1.43, 1.40, 1.40, 1.38, 1.21, 1.01。13C-NMR譜顯示該化合物有52個碳信號，其中216.1, 214.2, 196.9為3個羰基碳信號，147.0, 137.4, 121.3, 121.3為2對烯碳信號，27.8, 27.7, 27.6, 25.8, 21.1, 20.8, 20.5, 18.8為8個甲基碳信號。以上特征信號提示化合物1的苷元結(jié)構(gòu)為葫蘆烷型三萜[12-13]。此外，1H-NMR譜中顯示5.59 (1H, d,= 7.5 Hz), 4.95 (1H, d,= 7.5 Hz), 4.89 (1H, d,= 7.5 Hz) 的糖端基氫信號，偶合常數(shù)提示苷鍵為β或α-型，且13C-NMR譜也顯示了相應的端基碳信號105.8、99.8、98.5以及糖環(huán)上其他碳信號。而6.22 (1H, brs) 的糖端基氫信號、甲基雙峰氫信號1.77 (3H, d,= 6.5 Hz)，結(jié)合其糖端基碳信號103.2和甲基碳信號19.2，進一步證實了α--鼠李糖基的存在。結(jié)合上述信息，并與本實驗分離得到的化合物2以及文獻報道的碳氫數(shù)據(jù)對照，進一步證實了化合物1中β--葡萄糖基、α--阿拉伯糖基、α--鼠李糖基和β--木糖基的存在，并且苷元2位的糖鏈與文獻中報道一致[7]。

通過HSQC將化合物1的碳氫相關信號進行歸屬，再結(jié)合1H-1H COSY、TOCSY、HMBC譜（圖1）數(shù)據(jù)確定其平面結(jié)構(gòu)。利用TOCSY譜并分別從4個糖端基氫出發(fā)，得到4個糖基的自旋偶合體系和碳氫信號歸屬。糖的連接位置和順序進一步通過HMBC譜加以確定，H5.59（H-1′）與C147.0（C-2）相關，證實葡萄糖基Glc′連接在苷元的C-2位，H6.22 (H-1′′) 與C78.4 (C-2′) 相關，H4.95 (H-1′′′)與C88.3 (C-3′) 相關，說明化合物1的C-2位糖鏈為Rha′′-(1→2)-Ara′′′-(1→3)-Glc′；H4.89 (H-1′′′′) 與C77.1 (C-25) 的相關信號證實木糖基Xyl′′′′連接在苷元的C-25位?；衔锏南鄬?gòu)型通過NOESY譜（圖2）確定。H4.90 (H-16) 與H1.21 (H-18)有相關信號，說明H-16為β構(gòu)型；H1.63 (H-21)、H1.57 (H-30) 與H3.00 (H-17) 均有相關信號，結(jié)合已報道葫蘆烷型相關衍生物關于C-20位構(gòu)型的確定及相關NOESY信號分析[13-14]，進一步證實C-20的構(gòu)型為。

圖1 化合物1的關鍵1H-1H COSY (━) 和HMBC (H→C) 相關

圖2 化合物1苷元部分的關鍵NOESY相關

綜合上述信息，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為葫蘆素L-2--{[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基-(1→3)]-β--吡喃葡萄糖基}-25--β--吡喃木糖苷，為1個新化合物，命名為絞股藍葫蘆皂苷A。結(jié)構(gòu)見圖3，NMR數(shù)據(jù)見表1。

化合物2：白色無定形粉末，易溶于甲醇、吡啶等有機溶劑；在紫外燈254 nm下有暗斑；香草醛-濃硫酸反應顯棕黃色；ESI-MS: 955 [M－H]?。1H-NMR (500 MHz, C5D5N): 6.41 (1H, d,= 2.5 Hz, H-1), 6.21 (1H, brs, H-1′′), 5.66 (1H, brs, H-6), 5.58 (1H, d,= 7.5 Hz, H-1'), 4.95 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1'''), 2.99 (1H, d,= 7.0 Hz, H-17), 1.64 (3H, s, H-21), 1.54 (3H, s, H-30), 1.42 (3H, s, H-29), 1.41 (3H, s, H-28), 1.39 (3H, s, H-27), 1.39 (3H, s, H-26), 1.21 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-19)；13C-NMR (125 MHz, C5D5N): 121.4 (C-1), 147.0 (C-2), 196.9 (C-3), 50.1 (C-4), 137.4 (C-5), 121.3 (C-6), 24.3 (C-7), 42.2 (C-8), 49.6 (C-9), 36.0 (C-10), 214.2 (C-11), 50.1 (C-12), 51.3 (C-13), 49.1 (C-14), 46.9 (C-15), 70.7 (C-16), 59.4 (C-17), 20.7 (C-18), 20.5 (C-19), 80.5 (C-20), 25.9 (C-21), 216.5 (C-22), 33.2 (C-23), 38.9 (C-24), 69.5 (C-25), 30.2 (C-26), 30.5 (C-27), 21.1 (C-28), 27.7 (C-29), 18.7 (C-30)；C2-Glc′: 98.5 (C-1′), 78.6 (C-2′), 88.3 (C-3′), 69.0 (C-4′), 78.4 (C-5′), 62.0 (C-6′)；Rha′′: 103.2 (C-1′′), 72.8 (C-2′′), 73.2 (C-3′′), 74.6 (C-4′′), 70.4 (C-5′′), 19.2 (C-6′′)；Ara′′′: 105.8 (C-1′′′), 75.0 (C-2′′′), 78.7 (C-3′′′), 71.0 (C-4′′′), 67.6 (C-5′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物2為葫蘆素L-2--[a--吡喃鼠李糖基-(1→2)][a--吡喃阿拉伯糖基-(1→3)]-β--吡喃葡萄糖苷。

圖3 化合物1的結(jié)構(gòu)

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(500/125 MHz，C5D5N)

a)重疊信號

a)overlapped

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new cucurbitane-type saponin from

LOU Yun-yun1, 2, MU Long2, HUANG Ya-ping2, ZHANG Jian3, YIN Zhi-qi2, PAN Ke1

1. Department of Natural Medicinal Chemistry, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China 2. Department of TCMs Pharmaceuticals & State Key Laboratory of Active Components and Efficacy of Natural Medicines, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China 3. Laboratory of Translational Medicine, Jiangsu Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

To further study the chemical constituents from the total saponin extract of Jiaogulan ().The chemical constituents ofwere separated and purified by chromatographic methods and structurally elucidated by means of various spectroscopic techniques.Two cucurbitane-type saponins were isolated from the total saponin extract of, and identified as cucurbitacin L-2--{[a--rhamnopyranosyl-(1→2)] [a--arabinopyranosyl-(1→3)]-β--glucopyranosyl}-25--β--xylopyranoside (1), cucurbitacin L-2--[--rhamnopyranosyl- (1→2)] [a--arabinopyranosyl-(1→3)]-β--glucopyranoside (2).Compound 1 is a new compound named cucurbitane-gypenoside A.

(Thunb.) Makino;; cucurbitane-type; triterpenoid saponin; cucurbitane-gypenoside A; cucurbitacinL-2--[a--rhamnopyranosyl-(1→2)] [a--arabinopyranosyl-(1→3)]-β--glucopyranoside

R284.1

A

0253 - 2670(2021)07 - 1872 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.002

2020-11-23

江蘇省高校青藍工程資助項目；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目成果（202010316044S）；2020年江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃（KYCX20_0676）

婁云云，男，碩士，研究方向為天然藥物化學。E-mail: 17805936864@163.com

潘 珂，副教授。E-mail: kpan@cpu.edu.cn

[責任編輯 王文倩]