耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制及其分子檢測(cè)

李子堯，魯炳懷

肺炎克雷伯菌是一種機(jī)會(huì)性病原體，可引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染，約占所有革蘭陰性感染的1/3，如尿路感染、膀胱炎、肺炎、外科傷口感染、心內(nèi)膜炎和敗血癥，特別多見(jiàn)于免疫力低下的人群[1]。高毒力的肺炎克雷伯菌還會(huì)導(dǎo)致壞死性肺炎、化膿性肝膿腫和內(nèi)源性眼內(nèi)炎[2～4]。碳青霉烯類抗生素是廣譜β-內(nèi)酰胺類藥物，可用于治療各種肺炎克雷伯菌引起的感染，然而我國(guó)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CR-KP)的分離率呈逐年上升狀態(tài)，對(duì)CR-KP的耐藥機(jī)制的研究是非常有必要的。

1 幾種常見(jiàn)的CR-KP耐藥機(jī)制

CR-KP對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性是由不同耐藥機(jī)制共同介導(dǎo)的，主要有碳青霉烯酶的生成、孔蛋白的改變和外排泵活性的增加等。

1.1碳青霉烯酶 在青霉素發(fā)現(xiàn)并純化后不久，便鑒定出了β-內(nèi)酰胺酶，其可以降解青霉素類抗生素而產(chǎn)生耐藥[5]。β-內(nèi)酰胺酶主要集中在細(xì)菌的周質(zhì)內(nèi)，從而在β-內(nèi)酰胺類藥物到達(dá)細(xì)胞壁中的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding protein，PBP)靶位之前將其β-內(nèi)酰胺環(huán)水解。目前對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有兩種分類方法，第一種是按照其一級(jí)分子結(jié)構(gòu)的分子分類法(Ambler分類系統(tǒng))[6]，也是目前最常用的分類法；第二種是按照其結(jié)合水解和抑制功能特性的功能分類法(Bush-Jacoby分類系統(tǒng))[7]。《臨床微生物手冊(cè)》給出了β-內(nèi)酰胺酶分類，見(jiàn)表1，可供參考[8]。碳青霉烯酶是一種能水解碳青霉烯類抗生素(如厄他培南、亞胺培南與美羅培南)的β-內(nèi)酰胺酶。通常情況下，碳青霉烯酶也可以水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，如青霉素類、β-內(nèi)酰胺類-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、頭孢菌素類等。通常而言，產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌一般意味著對(duì)目前所有β-內(nèi)酰胺類藥物均耐藥。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。自從IMP-1自肺炎克雷伯菌鑒定出后，多種碳青霉烯酶陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如GES-4、VIM-1、NDM-1、OXA-48、KPC-2。其中KPC酶成為最重要的碳青霉烯酶，可由質(zhì)粒介導(dǎo)快速傳播。IMP對(duì)碳青霉烯類抗生素水解能力較弱，攜帶并不一定在藥敏試驗(yàn)中對(duì)碳青霉烯類耐藥。Ambler分類法將β-內(nèi)酰胺酶分為A、B、C和D四大類β-內(nèi)酰胺酶。碳青霉烯酶根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的差異分為3類，分別隸屬于Ambler分類系統(tǒng)中的A、B和D類β-內(nèi)酰胺酶，由bla基因編碼。A類和D類碳青霉烯酶需要絲氨酸作為他們的活化位點(diǎn)，而B(niǎo)類金屬-β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs)需要金屬鋅作為其活化中心。Ambler A類β-內(nèi)酰胺酶是最大的一類β-內(nèi)酰胺酶，其特點(diǎn)是活性部位含有絲氨酸。它能夠滅活大部分的β-內(nèi)酰胺類藥物。該類β-內(nèi)酰胺酶包括青霉素酶、頭孢菌素酶、窄譜和廣譜β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamases，ESBLs)和碳青霉烯酶。它們對(duì)克拉維酸和他唑巴坦的抑制作用的敏感性是可變的，但都可被新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑包括阿維巴坦、瑞來(lái)巴坦(relebactam)和維博巴坦(vaborbactam)所抑制[7,9]。在CR-KP中經(jīng)常觀察到的各種重要的β-內(nèi)酰胺酶[例如ESBLs(TEM、SHV、CTX-M)和KPC]都屬于這類β-內(nèi)酰胺酶。TEM型β-內(nèi)酰胺酶能夠水解早期頭孢菌素和青霉素，在肺炎克雷伯菌中比較常見(jiàn)。SHV-1具有與TEM-1相似的底物和抑制譜，幾乎普遍存在于肺炎克雷伯菌中[10]。因?yàn)榭股氐倪x擇壓力及耐藥基因在各個(gè)細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，TEM和SHV酶的基因均已發(fā)生相當(dāng)多的突變，這導(dǎo)致這兩種酶類型的高度多樣性，也增加抗生素的耐藥范圍[7,10]。目前已有報(bào)道SHV-1和SHV-11的大量產(chǎn)生降低了哌拉西林-他唑巴坦的有效性[11]。包括CTX-M在內(nèi)的其他A類ESBLs(PER酶、GES酶和VEB酶等)目前已在包括肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、腸桿菌在內(nèi)的腸桿菌病原體中得到鑒定[12,13]。大多數(shù)A類ESBLs仍然對(duì)克拉維酸敏感。但仍然有部分A類ESBLs(如TEM-30、SHV-10和TEM-50)表現(xiàn)出對(duì)各種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的敏感度降低[14]。產(chǎn)碳青霉烯酶(如KPC酶)的肺炎克雷伯菌早有報(bào)道，而且是引起CR-KP的重要原因，如KPC-1可導(dǎo)致對(duì)亞胺培南、美羅培南、阿莫西林-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、氨曲南和頭孢曲松的耐藥[15]。KPC酶的編碼基因通常位于轉(zhuǎn)座子Tn4401內(nèi)，允許其在其他革蘭陰性菌中傳播[16]。雖然在含有KPC絲氨酸碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的抑制物，但產(chǎn)KPC酶的感染仍然可以成功地用各種新的β-內(nèi)酰胺-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合所治療，包括亞胺培南-瑞來(lái)巴坦、美羅培南-維博巴坦和頭孢他啶-阿維巴坦[17]。但不幸的是，目前已有關(guān)于產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢他啶-阿維巴坦耐藥的報(bào)道[18,19]。Ambler B類β-內(nèi)酰胺酶代表了另一組臨床上重要的酶。因其活性位點(diǎn)上需要鋅離子，故而也稱為MBLs。MBLs能水解大多數(shù)β-內(nèi)酰胺，包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，但氨曲南除外，其可被乙二胺四乙酸EDTA抑制[7,20,21]。由于重要的MBLs(如IMP、VIM和NDM家族的MBLs)都可被整合到可移動(dòng)基因元件中，而伴隨著這些可移動(dòng)基因元件在細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移，碳青霉烯酶的氨基酸發(fā)生取代，產(chǎn)生碳青霉烯酶的不同變體。這導(dǎo)致碳青霉烯酶的活性及其對(duì)碳青霉烯類抗生素的親和力發(fā)生變化，所以對(duì)MBLs需要引起特別的關(guān)注[22,23]。Ambler D類β-內(nèi)酰胺酶主要由苯唑西林水解酶(oxacillin hydrolase，OXA)組成，能水解具有ESBLs樣底物特性的苯唑西林及其衍生物，幾乎所有OXA酶，除了OXA-18，都對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑耐藥[7,24]。肺炎克雷伯菌可通過(guò)攜帶有OXA-48基因的質(zhì)粒來(lái)表達(dá)獲得OXA-48[25]。同時(shí)這些質(zhì)粒中也編碼了其他ESBLs，如CTX-M，從而使肺炎克雷伯菌對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥[26]。

表1 β-內(nèi)酰胺酶分類

1.2孔蛋白 外膜蛋白通道(孔蛋白)的數(shù)量及功能的改變也是碳青霉烯類耐藥的重要機(jī)制。CR-KP中經(jīng)常觀察到主要外膜蛋白OmpK36和OmpK35的改變[27]。這些改變可能在治療過(guò)程中出現(xiàn)，增強(qiáng)了其他抵抗機(jī)制的影響，如降解酶。在治療莫西沙星敏感的肺炎克雷伯菌感染時(shí)，發(fā)生了OmpK36的缺失及Amp C β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)[28]。也有報(bào)道[29,30]稱肺炎克雷伯菌孔蛋白突變確實(shí)降低了肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯的敏感性，但不賦予其臨床耐藥性，需要β-內(nèi)酰胺酶。莢膜的生成似乎也和孔蛋白的生成有著一些聯(lián)系。KvrA是一種控制莢膜產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄抑制因子。目前已有報(bào)道證明KvrA的缺失降低了OmpK35和OmpK36孔蛋白的產(chǎn)生，從而降低了產(chǎn)KPC-3的肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南-維博巴坦的敏感性[31]。

1.3外排泵 外排泵能夠主動(dòng)將藥物擠出細(xì)胞，其編碼基因可以位于染色體上或可移動(dòng)基因元件內(nèi)。已經(jīng)被鑒定的外排泵有6個(gè)主要家族：RND家族、MFS家族、MATE家族、SMR家族、ABC家族和PACE家族[32～34]。大多數(shù)外排泵是多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，能有效地泵出多種抗生素，從而導(dǎo)致多藥耐藥性。其中RND家族外排泵在革蘭陰性菌中是特別值得關(guān)注的。這種類型的外排泵可以排出各種抗生素和結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的分子。AcrAB-TolC是典型的屬于RND超家族的多藥外排泵，通常是染色體編碼的，但也可以通過(guò)質(zhì)粒獲得。在肺炎克雷伯菌中AcrAB-TolC的過(guò)量生產(chǎn)是多重耐藥的重要特點(diǎn)，當(dāng)其缺失時(shí)，多種藥物的耐藥性也降低數(shù)倍[35,36]。而且在含有碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中，AcrAB突變表達(dá)與β-內(nèi)酰胺酶活性會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，導(dǎo)致高水平的碳青霉烯類耐藥性[37]。

2 常用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

目前，臨床上檢測(cè)CR-KP的方法仍然是以培養(yǎng)作為鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于培養(yǎng)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致臨床錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)間，降低了臨床患者的生存率。分子生物學(xué)檢測(cè)方法由于其靈敏、快速的特點(diǎn)可大大彌補(bǔ)培養(yǎng)導(dǎo)致的延誤。以下簡(jiǎn)要介紹幾種分子生物學(xué)檢測(cè)CR-KP的技術(shù)。

2.1聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)類技術(shù) 目前應(yīng)用于檢測(cè)的常用PCR的方法主要有普通PCR、實(shí)時(shí)定量PCR及多重PCR，可用于檢測(cè)KPCs、NDMs、IMPs、VIMs與OXA-48等碳青酶烯類耐藥基因。普通PCR及實(shí)時(shí)定量PCR無(wú)論是臨床還是其他地方，早已被廣泛接受。而多重PCR，相比于普通PCR及實(shí)時(shí)定量PCR，其能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的特點(diǎn)，曾引起廣泛關(guān)注，但其受到引物及靶標(biāo)設(shè)計(jì)等諸多因素影響，限制了其發(fā)展[38～41]。賽沛公司的GeneXpert分子診斷系統(tǒng)推出的Xpert Carba-R檢測(cè)試驗(yàn)盒與生物梅立埃公司的FilmArray的多重PCR分子診斷系統(tǒng)，可在大約1 h內(nèi)直接從標(biāo)本或純菌落中定性檢測(cè)和區(qū)分常見(jiàn)碳青霉烯酶基因(如blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48和blaIMP)，其靈敏度和特異度均較高[42～44]。PCR類技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是快速、靈敏，但缺陷也相當(dāng)明顯，只能用來(lái)檢測(cè)有限的已知的基因，不能發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因。

2.2基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)檢測(cè)技術(shù) MALDI-TOF MS的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，使生物分子電離，然后在電場(chǎng)作用下飛過(guò)飛行管道，檢測(cè)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間來(lái)測(cè)定離子的質(zhì)荷比(M/Z)。目前，已廣泛應(yīng)用于微生物的鑒定。MALDI-TOF MS檢測(cè)耐藥主要通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的酶，滅活抗生素產(chǎn)生的物質(zhì)或者耐藥細(xì)菌特有的物質(zhì)等[45]。相比于改良的Hodge實(shí)驗(yàn)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳等技術(shù)，其用時(shí)大幅度縮短，靈敏度及特異度均較高[45,46]。但其缺陷是目前還不能夠準(zhǔn)確地報(bào)告最低抑菌濃度[47]。MALDI-TOF MS目前已在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到應(yīng)用，未來(lái)使用MALDI-TOF MS來(lái)檢測(cè)CR-KP的方法可能會(huì)應(yīng)用于臨床。

2.3測(cè)序技術(shù) 目前應(yīng)用最廣泛的就是全基因組測(cè)序(whole genome sequencing,WGS)?；蚪M包含了細(xì)菌的全部遺傳信息，進(jìn)行WGS可以明確細(xì)菌的具體耐藥基因，預(yù)測(cè)細(xì)菌的耐藥情況，發(fā)掘潛在未知的耐藥機(jī)制[48]。但是WGS的缺陷也非常明顯，其成本高，用時(shí)長(zhǎng)等。所以目前尚未應(yīng)用于臨床的檢測(cè)，僅用于科研工作。近年來(lái)Nanopore測(cè)序技術(shù)用于耐藥菌的檢測(cè)，因其靈敏度高、用時(shí)短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，Nanopore技術(shù)也引起了關(guān)注[49]。

2.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù) LAMP技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在DNA聚合酶的作用下，60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，1 h左右即可完成核酸擴(kuò)增，效率可達(dá)109～10個(gè)數(shù)量級(jí)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[50]。檢測(cè)可以在水浴或加熱塊中進(jìn)行[51]。相比于PCR，LAMP檢測(cè)產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌的靈敏度、特異度更高而且更快[52]。但目前LAMP技術(shù)遠(yuǎn)沒(méi)有PCR技術(shù)成熟，這可能是限制其應(yīng)用于臨床的重要因素之一。

3 小結(jié)

碳青霉烯類抗生素一直是治療腸桿菌屬(如肺炎克雷伯菌)引起的嚴(yán)重感染的最主要的藥物。但近年來(lái)，碳青霉烯類抗生素的濫用造成了選擇壓力，導(dǎo)致耐藥基因突變或傳播。肺炎克雷伯菌通過(guò)β-內(nèi)酰胺酶、孔蛋白的改變和外排泵活性的增加獲得高水平的耐藥性。這強(qiáng)調(diào)了在治療過(guò)程中需要正確使用碳青霉烯類抗生素。本文僅簡(jiǎn)要對(duì)肺炎克雷伯菌的碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)。其中一部分耐藥基因可以編碼到可移動(dòng)遺傳元件上，而這些移動(dòng)元件上同時(shí)又編碼了其他的毒力及耐藥基因，這就導(dǎo)致高毒力高耐藥的肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)[53,54]。但目前對(duì)于CR-KP的診斷還仍然以培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告周期較長(zhǎng)，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床合理正確地用藥。雖然目前已經(jīng)有多種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)如PCR、MALDI-TOF MS、測(cè)序和LAMP等技術(shù)，但由于諸如設(shè)計(jì)、成本等多種原因，大部分目前尚未應(yīng)用于臨床，使得報(bào)告周期沒(méi)有明顯縮短。所以了解CR-KP的耐藥機(jī)制，改進(jìn)檢測(cè)方法，便于臨床盡早作出報(bào)告，有助于對(duì)其進(jìn)行預(yù)防及控制，防止其進(jìn)一步進(jìn)化。