規(guī)范病原學診斷路徑促進感染性眼病精準醫(yī)療

鄭美琴，鄭欽象，樓永良，陳 蔚

眼部感染可由細菌、真菌、病毒或寄生蟲引起。眼球是一個相對獨立的器官，存在天然的物理生理屏障，有其獨特的防御機制，因此即使同一種病原體感染，其臨床表現(xiàn)及預(yù)后也有顯著的不同。由于眼表與外界相接觸，存在如葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬和丙酸桿菌屬等定植菌，當眼表環(huán)境發(fā)生改變或外傷時可致菌群失調(diào)、眼表防御機制破壞并可伴隨異物入眼，最終導致眼部感染。但是由于結(jié)膜組織血供豐富，而角膜組織并無血管，因此即使同樣是眼表感染，其表現(xiàn)及預(yù)后也不盡相同。另外由于角膜和眼內(nèi)部分組織的相對免疫赦免狀態(tài)，使得感染發(fā)生時難以控制，往往容易造成嚴重視力損傷甚至致盲的后果。雖然不同類型感染有某些特征性臨床體征為臨床診斷提供線索，但病原微生物的檢查仍然是病因診斷的金標準，是實現(xiàn)感染性眼病精準治療的關(guān)鍵。

1 感染性眼病精準醫(yī)療概述

2015年，我國學者董家鴻[1]在國內(nèi)提出了“精準醫(yī)療”的理念。強調(diào)針對確定的患者和病情精確選擇和應(yīng)用適宜的診療方法，避免盲目應(yīng)用或濫用高新技術(shù)手段帶來額外的醫(yī)源性損害和醫(yī)療資源浪費，并提出基因組學等技術(shù)只是精準醫(yī)療眾多重要技術(shù)元件之一，并不是實現(xiàn)精準醫(yī)療的充分必要條件。感染性疾病醫(yī)療體系正是這一理念的充分體現(xiàn)，不斷發(fā)展的傳統(tǒng)病原微生物實驗診斷技術(shù)仍然是病原學診斷的金標準，快速崛起的病原微生物基因擴增技術(shù)、蛋白組學及基因組學分析等技術(shù)成為不可或缺的補充。眼部感染根據(jù)累及的部位不同可引起多種眼病。感染發(fā)生后，因組織結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)及預(yù)后也各不相同。感染性眼病的治療原則是根據(jù)感染類型結(jié)合感染部位給予對應(yīng)的抗微生物藥物治療。如細菌感染所致外眼感染(如結(jié)膜炎、角膜炎)，可以通過頻繁的抗菌藥物滴眼治療，在細菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏結(jié)果報告前，選擇廣譜抗菌藥物來控制感染；病毒感染，大多數(shù)需要全身聯(lián)合局部抗病毒用藥。眼內(nèi)的感染，由于會導致嚴重的視力損傷，一般需要靜脈和玻璃體注射使藥物突破血-眼屏障，如感染控制不佳需行玻璃體切除術(shù)。盡早明確病原體對真菌性感染所致眼病(如角膜炎和眼內(nèi)炎)尤為重要，可在有效給予抗真菌藥物治療的同時，避免激素的誤用。規(guī)范的病原學檢測是感染性疾病精準醫(yī)療最基本的體現(xiàn)。病原學檢測傳統(tǒng)方法主要是形態(tài)學、免疫學以及病原體分離培養(yǎng)和藥敏試驗等。由于傳統(tǒng)病原學檢測需要技術(shù)人員具有豐富的實驗操作經(jīng)驗，同時眼部標本又具有量少且類型復(fù)雜等特點，容易導致漏診甚至誤診。有文獻[2]報道眼內(nèi)液直接鏡檢細菌、真菌的陽性率一般為22%～36%，培養(yǎng)的陽性率也僅為34%～60%，且培養(yǎng)時間為數(shù)天至數(shù)周，導致錯過最佳治療時機。因此靈敏度高、特異性強、快速準確的方法學對眼部感染性疾病的病原學檢測尤為重要。分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，使得感染性疾病通過分子生物學技術(shù)鑒定病原成為可能，如新冠肺炎疫情期間，分子生物學檢測已成為不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)[3]。分子檢測主要包括普通聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR、實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting system,RT-qPCR)和宏基因組測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)等技術(shù)[4]。分子檢測和基因組測序能更及時、準確地鑒定病原體，并分析病原體的來源，甚至進行抗菌藥敏感性的分析，從而提高感染性疾病的診斷速率及準確性，促進了感染性眼病精準醫(yī)療的發(fā)展。近年興起的眼內(nèi)液檢測在促進眼部精準醫(yī)療的發(fā)展中發(fā)揮了積極的作用[5]。由于眼球是封閉的球體，存在血-眼屏障(包括血-房水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障)。正常情況下，眼內(nèi)液中的蛋白成分與血漿中的蛋白成分不同，出于免疫赦免的需要，免疫球蛋白的含量更低，且能采集到的樣本量也極少(如房水，通常只能采集到100 μl以內(nèi))，因此臨床上需要有更高靈敏度和高通量的檢測方法、試劑用于眼內(nèi)液的檢測，同時對避免假陽性的出現(xiàn)提出了更高的要求。然而，當血-眼屏障破壞時，血清中的蛋白成分(包括各種抗體)可以滲漏至眼內(nèi)，如果此時檢測眼內(nèi)液的抗體成分出現(xiàn)陽性，則會導致臨床誤診。因此，引入更完善的評價體系，如通過計算Goldmann-Witmer(GM)系數(shù)，有助于判斷該特異抗體是眼內(nèi)感染產(chǎn)生還是因為滲漏而導致的假陽性。眼內(nèi)液檢測的意義還體現(xiàn)在當涂片和培養(yǎng)陰性時，利用分子生物學檢測其中病原體的數(shù)量和種類等，作為傳統(tǒng)方法學的有效補充，使其成為眼內(nèi)炎病原學診斷不可或缺的組成部分。此外，激光共聚焦檢查在診斷角膜疾病中得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)具有非侵入性、高分辨率的優(yōu)點，理論上其分辨率可達1 μm[6]，放大倍率達200～500倍，具有增強的圖像對比度和穿透性，即使混濁的角膜也可觀察其顯微結(jié)構(gòu)。共聚焦顯微鏡在棘阿米巴、真菌、諾卡菌和微孢子蟲感染的角膜炎中具有較高的敏感性和特異性，尤其是對典型的真菌菌絲和棘阿米巴包囊的診斷。當病變僅累及角膜深基質(zhì)感染的病灶，常規(guī)的刮片技術(shù)不容易獲取標本時，共聚焦顯微鏡檢查更顯示出優(yōu)勢，并且能即刻出具報告，有助于盡早得到輔助診斷的依據(jù)。但是，當病變進展以及使用抗真菌藥物后可使菌絲變得“不典型”或發(fā)生混合感染時，可影響診斷的準確性。

2 感染性眼病病原學檢測質(zhì)量控制要點

盡早進行微生物鑒定對眼部感染性疾病的治療、減少并發(fā)癥及疾病預(yù)后非常重要，而標本采集的規(guī)范與否，直接影響病原菌的檢出率。但由于眼部結(jié)構(gòu)的特殊性，導致能采集的標本量特別少，且大多數(shù)眼科醫(yī)師缺乏實驗室的基本技術(shù)，導致標本處理不規(guī)范，同時多數(shù)檢驗科醫(yī)技人員對眼部標本特點不熟悉，難以規(guī)范合理地處置眼部來源的標本。因此，感染性眼病病原學檢測標本的采集和預(yù)處理成為整個質(zhì)量控制的關(guān)鍵。我們知道，來自眼瞼、結(jié)膜、角膜、淚道等與外界相通的部位，有正常菌群定居，而眼球內(nèi)、眶內(nèi)軟組織等傳統(tǒng)認為屬于無菌的部位。因此，為了獲取準確的病原學依據(jù)，需要根據(jù)病變部位的特點采集合適的標本并采用合理的處置方式。

2.1眼部感染病原學檢測標本采集基本原則 標本采集應(yīng)在病程早期、急性期，且盡可能在使用抗菌藥物之前，建議采集雙側(cè)眼標本(即使單側(cè)眼發(fā)病)進行涂片鏡檢及培養(yǎng)等檢測[7]，或者健康眼僅采集分泌物行涂片鏡檢。各種分泌物的采集推薦使用預(yù)先用無菌生理鹽水或其他符合眼科使用要求的培養(yǎng)基沾濕的無菌拭子，由培訓過的專業(yè)人員進行操作，并注意避免眼瞼、睫毛及周圍皮膚表面正常菌群的污染，以免造成病原菌與正常菌群相混淆致使臨床誤診。眼內(nèi)標本如房水、玻璃體、異物等由培訓過的手術(shù)醫(yī)師進行。由于大多數(shù)眼部標本的取材量少，建議進行床邊接種和制備涂片并立刻送檢(15 min內(nèi)),必要時也可以在被檢測的液體標本中加入0.5～1.0 ml無菌生理鹽水或營養(yǎng)肉湯，并在結(jié)果報告單中注明樣本已經(jīng)稀釋。標本送檢時須精確標明眼別、具體取材部位、標本類型、用藥情況、采樣人、采樣時間等信息[8]。

2.2常見眼部標本采集及預(yù)處理規(guī)范 眼部感染可由細菌、真菌、病毒、寄生蟲等引起，但已有數(shù)據(jù)表明細菌仍然是眼部感染的主要病原體[9]，因此標本的采集及預(yù)處理措施通常仍以細菌學檢查為主，同時盡可能兼顧其他病原體檢測的需求。

2.2.1 結(jié)膜囊分泌物等眼表標本采集質(zhì)量控制[8]

對于結(jié)膜囊分泌物的采集，一方面需要考慮采樣舒適度，提高患者的配合度，同時又需要考慮采集到盡可能多的分泌物，因此推薦使用接觸面積大、釋放率高的植絨拭子，并用預(yù)濕潤的拭子由內(nèi)眥部開始從內(nèi)到外旋轉(zhuǎn)輕拭結(jié)膜囊和瞼結(jié)膜表面(注意不遺漏內(nèi)眥部)，避免接觸睫毛和瞼緣。為提高培養(yǎng)陽性率，要求采樣時盡可能不用麻醉劑。標本采集完成后，直接用無菌拭子在玻片上涂抹制成涂片。取另一拭子以滾動的方式涂布接種于普通巧克力瓊脂平板/哥倫比亞血瓊脂平板、厭氧血瓊脂平板(必要時)。特殊情況下需將拭子接種于增菌培養(yǎng)基，則需報告時注明。其他眼表標本參照執(zhí)行。

2.2.2 結(jié)膜/角膜刮取物采集規(guī)范[8]采集刮取物時，既考慮到采樣時需要一定的深度又要盡可能避免因采樣導致角膜穿孔，因此推薦使用無菌15號手術(shù)圓刀片或者適用的刮匙等。在刮取前，先滴表面麻醉滴眼液(盡可能使用無防腐劑的制劑)，對角結(jié)膜進行表面麻醉。接著用手指或開瞼器撐開眼瞼，若病變處分泌物過多，可先用滅菌濕棉簽去除分泌物，然后選擇角膜潰瘍進行緣或基底部刮取標本。刮取完成后，滴用抗菌滴眼液。采集盡可能多的標本后即時接種，或?qū)⒐稳∥镏糜谵D(zhuǎn)運試管(帶轉(zhuǎn)運拭子和運送培養(yǎng)基)，并確保標本浸入液體轉(zhuǎn)運介質(zhì)中[10]。置于轉(zhuǎn)運介質(zhì)中的標本推薦經(jīng)研磨或充分震蕩后，再接種于普通巧克力瓊脂平板/哥倫比亞血瓊脂平板、厭氧血瓊脂平板(必要時)以及制作涂片做形態(tài)學檢查(推薦標本直接接種及涂片)。

2.2.3 房水及玻璃體采集規(guī)范[8]房水采集用1 ml無菌注射器，于角鞏膜緣平行虹膜平面穿刺入前房，抽取房水約0.1 ml。玻璃體采集包括以注射器抽取法和玻璃體切割法。要求注射器抽吸法需抽取不少于0.2 ml的標本；玻璃體切割法采集量不少于0.5 ml(如果是含灌注液的大體積標本，需采集最初的灌注液不少于1.0 ml，并在申請單上注明用藥情況)。采集完成后立即行床旁接種及涂片制作，房水/玻璃體液分別用注射器加至液體增菌培養(yǎng)基(專用培養(yǎng)基或兒童血培養(yǎng)瓶)及真菌培養(yǎng)基內(nèi)(標本量足夠時建議增加厭氧培養(yǎng))，同時制作涂片送檢，或加入轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基中盡快(2 h內(nèi))送至實驗室處理，特殊情況下不得超過24 h[6]。以上標本如果需要進行分子生物學實驗，則要求將采集的拭子盡快轉(zhuǎn)運。當環(huán)境溫度≥25 ℃時，用于DNA檢測的標本，應(yīng)2～8 ℃轉(zhuǎn)運，該條件下可以保存≤10 d，如不能完成核酸提取，需盡快轉(zhuǎn)移到≤-70 ℃儲存；用于RNA檢測的標本，需立即冰上轉(zhuǎn)運，且應(yīng)在1～4 h內(nèi)提取核酸；需凍存的標本則用干冰轉(zhuǎn)運[3]。

3 感染性眼病相關(guān)實驗室檢測應(yīng)用

3.1傳統(tǒng)微生物診斷方法 目前傳統(tǒng)的微生物學方法如眼科標本的顯微鏡涂片檢查、病原菌培養(yǎng)仍然是多數(shù)醫(yī)院的首要選擇方式。顯微鏡檢查可以通過革蘭染色、吉姆薩染色、氫氧化鉀濕片、六氨銀染色、熒光染色或其他特殊染色等對細菌類型、真菌菌絲、阿米巴包囊進行快速的初步診斷，為疾病的初步診斷提供有效的病原學依據(jù)，并指導臨床醫(yī)師制定初步的治療方案。對于細菌學檢查，革蘭染色毫無疑問是首選，但如果懷疑是真菌感染，可以根據(jù)實際標本類型及實驗室條件選用氫氧化鉀濕片、熒光染色、吉姆薩染色以及六氨銀染色等特殊染色，各有其優(yōu)勢。近年隨著熒光顯微鏡的普及，熒光染色被應(yīng)用到真菌的檢測和診斷中。已有資料表明，熒光染色后真菌的形態(tài)特征十分清晰，不易漏診[11]。最近的文獻報道，真菌熒光染色在角膜刮取物及切取的角膜組織中陽性率明顯高于病理常用的過碘酸希夫染色，分別為79.6%和60.5%[12](特異度均為100%)，認為真菌熒光染色法可以快速準確地診斷真菌性角膜炎。對于阿米巴、沙眼衣原體以及病毒包涵體檢測，考慮到吉姆薩染色對細胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示清晰，而瑞氏染色對胞質(zhì)和中性顆粒的著色較好，建議首選瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液進行染色后鏡檢。實際工作中考慮到眼部感染仍以細菌最常見，因此對來源于臨床癥狀不典型患者的標本，建議首選為革蘭染色。培養(yǎng)鑒定結(jié)果及藥物敏感試驗，有助于臨床醫(yī)師更精細化認識不同微生物感染特點，對早期治療效果欠佳及混合感染者尤為重要[13]。微生物藥物敏感性的變遷也對臨床抗菌藥物使用提供指導，減少細菌耐藥的產(chǎn)生，以最大可能減少感染性眼病的并發(fā)癥。然而微生物的培養(yǎng)和藥物敏感試驗需要3～7 d，如何在更短時間內(nèi)進行微生物的鑒定對臨床提供更早的診斷依據(jù)，是未來的研究方向。近年快速發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)，雖然縮短了菌種鑒定時間，但目前主要用于臨床培養(yǎng)陽性菌株的菌種鑒定，難以直接檢測原始樣本中的病原微生物，并未縮短培養(yǎng)時間[4]。但該技術(shù)在微生物藥敏和流行學分型中的發(fā)展和應(yīng)用值得更多關(guān)注[14]。

3.2普通PCR及相關(guān)技術(shù)在感染性眼病中的應(yīng)用

盡管微生物培養(yǎng)和鑒定是眼部感染性疾病診斷的金標準，但仍受到微生物生長緩慢和生存能力較低的限制，且采樣前的抗微生物藥物使用會產(chǎn)生假陰性結(jié)果，特別是混合感染的鑒定，傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定受到更多限制。普通PCR、DNA序列分析、基因芯片、變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)、RT-qPCR、環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等技術(shù)都可以用于病原體核酸定性或定量檢測。雖然不同的檢測方法和不同的檢測試劑在檢測限、可報告范圍及特異性等方面都有差別，但是鑒于多重PCR、基因芯片等技術(shù)可在同一反應(yīng)體系中檢測數(shù)種微生物[3]，這對于只有微量眼部標本來說更有其實際意義。利用細菌普遍存在16S核糖體DNA，真菌普遍存在18S和28S核糖體DNA，設(shè)計廣譜PCR，并對其進行DNA擴增，增強了檢測的敏感性，可快速鑒定細菌性或真菌性眼內(nèi)炎，且當采用特殊設(shè)計的巢式PCR時，還可用于鑒別革蘭染色陽性菌和陰性菌[2]。利用18S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)及18S rDNA-ITS序列分析技術(shù)，通過早期的鑒定來引入抗真菌治療，使感染性眼病得到更早的針對性治療。對眼部感染常見的巨細胞病毒、EB病毒、單純皰疹病毒和帶狀皰疹病毒等的檢測同樣具有明確診斷的重要意義。多重PCR和DNA微陣列(DNA芯片)技術(shù)的應(yīng)用，不僅提高了感染性眼病病原學鑒定的特異度、靈敏度、時效率，而且相對低成本、高通量，更適合大量樣本的分析與鑒定。當然也應(yīng)該注意到由于分子生物學技術(shù)靈敏度高，檢測容易受到眼表或環(huán)境中微生物序列的干擾而引起誤報，同時由于一個反應(yīng)體系只對某一種或一組特定可疑微生物進行反應(yīng)，對于新的菌株或突變的鑒定可能無法進行，仍存在不足之處。

3.3高通量測序技術(shù)在感染性眼病中的應(yīng)用 mNGS基于宏基因組學和高通量測序技術(shù)，可檢測并分析各種樣本中細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等所有已知及未知的病原體，特別是未知新發(fā)病原體。該技術(shù)規(guī)避了絕大多數(shù)病原體不能培養(yǎng)或難培養(yǎng)的缺點，可直接檢測臨床樣本中的病原體核酸，解決了新發(fā)或突變、復(fù)雜或混合感染、罕見病原體鑒定難的問題。基因測序通過臨床樣品分析中獲得的序列與數(shù)據(jù)庫中包含的序列進行比較，只需幾小時即可獲得精確的結(jié)果。有研究[15]表明基因組學診斷真菌性角膜炎是高度敏感的，比培養(yǎng)更省時，并且對于樣本量較少的眼表樣本是理想的。通過全基因組測序，可以獲知待測微生物的基因及相關(guān)調(diào)控信息，為研究該微生物特有的生物學特征(致病機制、共生機制、獨有的代謝機制)提供分子生物學基礎(chǔ)，并可通過比較基因組分析，為研究微生物種內(nèi)及種間的功能差異、進化關(guān)系提供理論指導。同時，全基因組測序能夠分析眼表的整個菌群，為某些疑難病例提供更多、更全面的分析，從而明確診斷，進行有效治療。Suzuki等[16]通過16S rRNA基因測序，對人類瞼板、結(jié)膜囊和眼瞼皮膚的微生物群進行首次全面的分析，確定了不同人群、不同部位的微生物群落特點。Kang等[17]首次使用宏基因組鳥槍法(shotgun)測序及生物信息學分析對角膜外傷后患者及健康對照的眼表菌群進行比較發(fā)現(xiàn)，外傷性角膜潰瘍患者眼表菌群的均勻度、豐富度和群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著改變，在種水平，包括熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、西拉亞棲熱菌顯著增加，不規(guī)則根瘤菌、肺炎鏈球菌、膿腫分枝桿菌等9種菌顯著減少，且物種間的相互作用強度明顯降低，同時檢測到17種與抗生素相關(guān)的耐藥基因。最新研究[18]表明眼表微生物生態(tài)系統(tǒng)中，表皮葡萄球菌與化膿性鏈球菌之間存在著競爭性作用。更多的研究表明，眼表微生態(tài)的變化與多種疾病之間存在潛在關(guān)聯(lián)，不僅與結(jié)膜炎[19]、細菌性角膜炎[20]、真菌性角膜炎[21]、瞼緣炎[22]、沙眼[23]等感染性眼病有關(guān)，與隱形眼鏡佩戴[24]、干眼[25]、瞼板腺功能障礙[26]等具有潛在感染可能性的眼病也有一定的關(guān)系。最近Deng等[27]通過mNGS方法提出環(huán)境的改變可能導致眼表微生物群的改變，特別是優(yōu)勢菌種的改變，為今后識別可能重塑眼表免疫的病理微生物群提供了豐富的資源?？梢娧郾砦⑸锝M的組成分析對于理解各種眼科疾病的病理生理至關(guān)重要。mNGS對感染性疾病病原學診斷相比于其他檢測技術(shù)有不可比擬的優(yōu)勢，但仍具有核酸檢測的局限性，檢測結(jié)果的解釋需密切結(jié)合臨床信息。測序技術(shù)在病原學診斷中的價值，還體現(xiàn)在通過特定病原體致病機制研究帶來的意義。Liu等[28]研究表明，葡萄球菌毒素基因SE1634在眼內(nèi)炎表皮葡萄球菌中顯著上調(diào)，提示與眼內(nèi)炎的發(fā)病直接相關(guān)。Eguchi等[29]通過分析分離自眼部的棒狀桿菌16S rRNA序列發(fā)現(xiàn)，只要gyrA基因83號位置上單個氨基酸的替代足以產(chǎn)生對諾氟沙星耐藥。Yuan等[30]通過對眼源性芽孢桿菌全基因組序列分析，確定了與眼內(nèi)感染顯著相關(guān)的plcA-2、InhA-3、InhA-4、hblA-5以及fliD等5個關(guān)鍵毒力基因。類似的研究結(jié)果提示，進行某些特定基因的檢測對于判斷分離菌是否為致病菌、是否需要采取某些特定治療措施以及預(yù)后判斷方面，有潛在的應(yīng)用價值，尤其是當分離到眼表的定植菌以及環(huán)境菌時，將更有意義。轉(zhuǎn)錄組測序，是近年發(fā)展起來的利用新一代測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)。通過轉(zhuǎn)錄組學分析技術(shù)，可以對病原體入侵宿主以及宿主的防御抵抗進行轉(zhuǎn)錄組學研究。Coburn等[31]通過RNA-Seq(RNA sequencing)比較了離體玻璃體中和LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基及腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion medium，BHI)肉湯中培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶在玻璃體中表達最高，提示該酶是感染期間中性粒細胞活性的潛在抑制劑。Rajamani等[32]通過系統(tǒng)生物學分析揭示了與視網(wǎng)膜炎癥有關(guān)的基因，包括白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、核因子-κB(nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、JUN基因(v-jun avian sarcona virus 17 oncogene homolog，JUN)和趨化因子CXC(chemokine CXC)等。更多關(guān)于病原體與宿主關(guān)系的研究，不僅有利于闡明感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的分子機制，更為將來采取有針對性的治療手段及靶向藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。但由于某些病原體核酸提取困難等原因一定程度上限制了此類技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

3.4眼內(nèi)液檢測在眼內(nèi)炎癥診療中的意義 眼內(nèi)液是眼球內(nèi)液體的總稱，包括房水、玻璃體液、視網(wǎng)膜下液、脈絡(luò)膜上腔積液等[5]。由于眼球結(jié)構(gòu)的特殊性，無論生理還是病理情況下，血液指標均不能反映眼內(nèi)真實情況，而只能通過眼內(nèi)液檢測來反映眼內(nèi)微環(huán)境的變化。因此眼內(nèi)液檢測對于鑒定感染性眼病的病因和判斷免疫指標的變化，某種程度上具有不可替代性。臨床上采集并送實驗室進行相關(guān)指標檢測的主要標本類型為房水和玻璃體液。檢測內(nèi)容主要包括病原學鑒定以及部分免疫、炎癥相關(guān)指標，主要方法包括傳統(tǒng)細胞形態(tài)學、微生物分離鑒定、分子生物學、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、流式細胞術(shù)以及用于眼部真菌感染輔助診斷的G試驗(1,3-β-D葡聚糖檢測)/GM試驗(半乳糖甘露醇聚糖抗原檢測)等。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)鑒定時，眼內(nèi)炎臨床診斷假陰性率較高，且房水的陽性率更低于玻璃體液，但利用PCR技術(shù)可以顯著提高陽性率。有研究[33]結(jié)果顯示PCR可將陽性率提高60%以上，這意味著有明確病原學診斷依據(jù)并能按照指南進行診療的比例得到明顯提高。眼內(nèi)液中各種蛋白的檢測在眼部疾病診斷和鑒別診斷中發(fā)揮了積極的作用。早期利用ELISA技術(shù)對眼內(nèi)液進行病原體抗原、抗體的檢測已經(jīng)讓眼科醫(yī)師獲益。隨著流式細胞術(shù)的發(fā)展，細胞因子微球檢測技術(shù)(cytometric bead array,CBA)得到廣泛應(yīng)用，使一份標本(25～50 μl)檢測多種因子(30種)成為可能，吸引了更多眼科醫(yī)師對眼內(nèi)液細胞因子研究的關(guān)注。在眼內(nèi)炎領(lǐng)域中，目前應(yīng)用較多的是利用細胞因子的變化區(qū)分感染性質(zhì)：如結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8升高，而IL-10不升高或升高幅度<10倍，提示革蘭陽性細菌感染；當IL-6、IL-8和(或)IL-10均升高10倍以上，且IL-6>IL-10，提示革蘭陰性細菌感染；當IL-10、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)不同程度升高時提示感染為結(jié)核性的可能性較大。當遇到單純的IFN-γ升高，提示真菌感染，如果增加G試驗/GM試驗，則有助于區(qū)分是否為曲霉菌感染。病毒感染時，根據(jù)病毒種類不同，IL-10、IL-1β、IL-6、IFN-γ、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)等不同程度升高。當出現(xiàn)嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)、IL-12p70、IL-6、MCP-1、IFN-γ不同程度升高時，提示寄生蟲感染，如能檢測到特異性抗體，對眼部寄生蟲感染診斷的意義更大。如眼弓形蟲病的診斷，除了臨床表現(xiàn)以外，弓形蟲抗體滴度或PCR檢測成為重要指標[34]，而且需要同時檢測眼內(nèi)液及血清中弓形蟲抗體，通過計算GW系數(shù)判斷是否為眼內(nèi)原位感染。當以GW>2時判斷為陽性，其特異度為97.8%；當以GW>3時判斷為陽性，其特異度可達到100%。這里需要特別指出，結(jié)果判斷必須以眼內(nèi)液中該抗體陽性為前提條件。隨著眼內(nèi)液采集設(shè)備、技術(shù)的不斷進步，臨床醫(yī)師收集眼內(nèi)液用于檢測分析的適應(yīng)證會逐漸擴大，眼內(nèi)液的檢測與應(yīng)用將成為眼科精準醫(yī)學的代表領(lǐng)域之一。

4 小結(jié)和展望

眼部感染是眼科最常見的疾病之一，雖可預(yù)防、可治療，但如果治療不當會造成失明等嚴重后果，對個人及家庭帶來巨大的精神、經(jīng)濟損失。因此感染性眼病的診斷必須快速、精準、有效。病原學檢測不僅依賴于取材、處理、培養(yǎng)和鑒定等規(guī)范的操作，而且需要將傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學技術(shù)、流式細胞術(shù)等，并利用激光共聚焦顯微鏡等活體檢查技術(shù)，聯(lián)系臨床信息綜合分析，才能獲得高質(zhì)量的結(jié)果，從而為感染性眼病精準醫(yī)療提供依據(jù)。鑒于眼部標本的特殊性，選用標本用量少、靈敏度高、特異性好、高通量的實驗室檢測技術(shù)更有實際意義。mNGS等技術(shù)的應(yīng)用有助于進一步加深對眼部微生態(tài)的了解，不僅在疑難病例診斷、未知病原體的檢測等方面有不可替代的優(yōu)勢，并為將來開發(fā)基于益生菌的眼部感染治療藥物提供可靠的數(shù)據(jù)與理論支撐。轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)為進一步闡明感染發(fā)生機制及靶向藥物研究奠定了基礎(chǔ)。