miR-127-3p在動(dòng)脈粥硬化中的表達(dá)及干擾miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理的HAoSMC增殖遷移的影響

繆丹丹，張寧，宋歡歡，趙少華，金玉，柴建文

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種病因復(fù)雜的血管壁慢性疾病，平滑肌細(xì)胞作為血管壁的重要成分，可調(diào)節(jié)血管的收縮舒張功能，同時(shí)也分泌多種細(xì)胞因子，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的異常增殖和遷移是AS發(fā)病的重要因素[1,2]。研究報(bào)道m(xù)iRNAs可通過(guò)調(diào)控血脂代謝，內(nèi)皮細(xì)胞的功能，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，血管的炎癥等參與調(diào)控AS[3,4]。研究報(bào)道m(xù)iRNA-127-3p在AS患者及AS合并阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）患者血清中高表達(dá)，miR-127-3p可能是OSA患者發(fā)生AS的早期預(yù)警標(biāo)志[5]。然而miR-127-3p對(duì)AS進(jìn)展及血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響及其機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（PDGFBB）可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移[6]。因此本實(shí)驗(yàn)用PDGF-BB處理人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HAoSMC），研究miR-127-3p對(duì)HAoSMC增殖、遷移的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月至2019年12月于鄭州人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的動(dòng)脈粥硬化患者38例，所有患者均行冠狀動(dòng)脈（冠脈）造影檢查，排除肝腎疾病、各種心肌病、炎性疾病及惡性腫瘤等；從體檢中心選擇同期健康者22例作為正常對(duì)照組，所有研究對(duì)象均留取晨起空腹靜脈血5 ml，常溫下3500 r/min離心10 min分離血漿，血漿樣本于-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HAoSMC）購(gòu)自德國(guó)PromoCell公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；血小板源性生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）購(gòu)自北京博爾西科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；miRNseasy Mini Kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qingen公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；4%多聚甲醛、1%結(jié)晶紫購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、ECL發(fā)光液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；抗體購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將HAoSMC接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液一次，待細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HAoSMC隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、antimiR-NC組、anti-miR-127-3p組；對(duì)照組不作任何處理，模型組用25 μg/L PDGF-BB處理24 h；antimiR-NC組和anti-miR-127-3p組中分別轉(zhuǎn)染miR-127-3p抑制劑對(duì)照（anti-miR-NC）和miR-127-3p抑制劑（anti-miR-127-3p）后再用25 μg/L PDGFBB處理24 h。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-127-3p和NF-κB mRNA表達(dá)水平取凍存血漿，利用miRNseasy Mini Kit試劑盒提取血漿中總RNA，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。miR-127-3p和NF-κB分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，miR-127-3p上游引物序列：5'-ACACTCCAGCTG GGTCGGATCCGTCTGAGC-3'，下游引物序列：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；NF-κB上游引物序列：5'-CTGAACCAGGGCATACCTG T-3'，下游引物序列：5'-GAGAAGTCCATGTCC GCAAT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TCCTCT GACTTCAACAGCGACACC-3'，下游引物序列：5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3'。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備單細(xì)胞懸液，加入3 ml預(yù)冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A（RNase A）于37℃水浴30 min，加入400 μl碘化啶（PI），4℃避光30 min，上機(jī)檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光，重復(fù)3次。用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)，每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO150 μl，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度（OD）值。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移收集各組細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)后，取200 μl接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液后用棉簽擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯鏡下拍照并計(jì)數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量

1.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白上樣量50 μg，SDS-PAGE后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗（1:800），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入二抗（1；1200）室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中顯影、定影，成像后用Quantity One軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-127-3p在AS患者中的表達(dá)與正常對(duì)照組相比，AS患者中miR-127-3p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，表1）。

2.2 PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC增殖遷移及miR-127-3p表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，模型組miR-127-3p表達(dá)水平升高，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞OD值升高，遷移細(xì)胞數(shù)增加，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平升高，E-cadherin表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖1，表2）。

2.3 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC增殖的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-127-3p組G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞OD值降低，Ki67表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖2，表3）。

表1 miR-127-3p在動(dòng)脈粥硬化患者中的表達(dá)（±s）

表1 miR-127-3p在動(dòng)脈粥硬化患者中的表達(dá)（±s）

注： AS：動(dòng)脈粥樣硬化；與正常對(duì)照組相比，aP＜0.05

組別 n miR-127-3p正常對(duì)照組 22 1.03±0.37 AS患者 38 2.83±0.86a t值 - 9.305 P值 - 0.000

2.4 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理遷移的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-127-3p組miR-127-3p表達(dá)水平降低，遷移細(xì)胞數(shù)減少，N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高（P＜0.05，圖3，表4）。

2.5 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC中NF-κB的影響與anti-miR-NC組相比，anti-miR-127-3p組NF-κB mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05，表5）。

3 討論

AS是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，掌握其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)治療相關(guān)疾病具有重要意義[7]。VSMC與AS的發(fā)病密切相關(guān)，平滑肌細(xì)胞遷移入內(nèi)膜并增殖，攝取修飾的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞是斑塊形成的原因之一，因此，可通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞異常增殖來(lái)延緩AS的發(fā)生及發(fā)展[8]。研究表明PDGF-BB可誘導(dǎo)VSMC增殖、遷移的發(fā)生[9]。本實(shí)驗(yàn)用PDGFBB處理HAoSMC，結(jié)果顯示，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞OD值升高，遷移細(xì)胞數(shù)增加，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平升高，E-cadherin表達(dá)水平降低。說(shuō)明PDGFBB可誘導(dǎo)HAoSMC細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖、遷移。

表2 PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC增殖遷移及miR-127-3p表達(dá)的影響（±s，n=9）

表2 PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC增殖遷移及miR-127-3p表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：G1：DNA合成前期；S：DNA合成期；G2：DNA合成后期；Ki67：核增殖抗原；N-cadherin：N-鈣粘蛋白；E-cadherin：E-鈣粘蛋白；與對(duì)照組相比，aP＜0.05

組別 miR-127-3p G0-G1 S G2-M OD值 遷移細(xì)胞數(shù) Ki67 N-cadherin E-cadherin對(duì)照組 1.01±0.06 34.25±3.27 33.27±3.19 32.48±3.01 0.53±0.04 78.61±6.77 0.38±0.02 0.19±0.01 0.62±0.03模型組 2.76±0.12a 25.51±2.57a 41.88±3.87a 32.61±3.89 1.22±0.10a 155.74±9.37a 0.79±0.04a 0.75±0.03a 0.16±0.02a t值 39.131 6.304 5.150 0.079 19.219 20.017 27.504 53.126 38.274 P值 0.000 0.000 0.000 0.938 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC中Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

圖2 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC中Ki67蛋白表達(dá)的影響

表3 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC增殖的影響（±s，n=9）

表3 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC增殖的影響（±s，n=9）

注：Ki67：核增殖抗原；與anti-miR-NC組相比，aP＜0.05

組別 G0-G1 S G2-M OD值 Ki67 anti-miR-NC 25.53±2.88 41.91±4.00 32.56±3.51 1.22±0.12 0.79±0.05 anti-miR-127-3p 31.69±2.95a 35.20±3.93a 33.11±3.56 0.68±0.05a 0.44±0.03a F值 4.482 3.590 0.330 12.462 18.007 P值 0.000 0.002 0.746 0.000 0.000

圖3 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC中N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC遷移的影響（±s，n=9）

表4 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC遷移的影響（±s，n=9）

注：N-cadherin：N-鈣粘蛋白；E-cadherin：E-鈣粘蛋白；與anti-miR-NC組相比，aP＜0.05

組別 miR-127-3p 遷移細(xì)胞數(shù) N-cadherin E-cadherin anti-miR-NC 0.96±0.05 155.74±9.74 0.75±0.04 0.15±0.02 anti-miR-127-3p 0.33±0.04a 92.25±6.31a 0.28±0.02a 0.41±0.03a t值 29.517 1.222 31.529 21.633 P值 0.000 0.239 0.000 0.000

表5 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC中NF-κB的影響（±s，n=9）

表5 抑制miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理對(duì)HAoSMC中NF-κB的影響（±s，n=9）

注：NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子；與anti-miR-NC組相比，aP＜0.05

組別 NF-κB mRNA anti-miR-NC 1.00±0.07 anti-miR-127-3p 0.49±0.03a t值 20.090 P值 0.000

研究表明miRNA參與AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可作為AS的診斷生物標(biāo)志物[10]。miRNAs對(duì)心血管平滑肌細(xì)胞功能起重要的調(diào)節(jié)作用，如miR-145能夠抑制大鼠腦動(dòng)脈VSMC增殖和遷移[11]。miR-181a-5p可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC的增殖、遷移和頸動(dòng)脈損傷新生內(nèi)膜的形成[12]。以上研究表明miRNA可調(diào)控VSMC的增殖、遷移。然而miR-127-3p對(duì)VSMC的增殖、遷移的影響還尚未可知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AS患者血清中及PDGFBB處理HAoSMC中miR-127-3p表達(dá)水平升高，說(shuō)明miR-127-3p可能與AS相關(guān)。為進(jìn)一步研究miR-127-3p對(duì)PDGF-BB處理HAoSMC的影響，本實(shí)驗(yàn)干擾miR-127-3p的表達(dá)，結(jié)果顯示，G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞OD值降低，遷移細(xì)胞數(shù)減少，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高、說(shuō)明干擾miR-127-3p表達(dá)可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HAoSMC增殖和遷移。miR-127-3p可能通過(guò)調(diào)控HAoSMC增殖和遷移影響AS進(jìn)展。

研究表明核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路與VSMC的增殖、遷移相關(guān)，阻斷NF-κB信號(hào)通路可抑制VSMCs的增殖和遷移[13]。Klotho通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)Bcl-2相關(guān)的致癌基因3（BAG3）表達(dá)抑制大鼠平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移[14]。SIRT1可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制VSMC源性泡沫細(xì)胞形成[15]。以上研究表明NFκB信號(hào)通路與VSMC的增殖、遷移及泡沫細(xì)胞的形成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾miR-127-3p表達(dá)，NF-κB mRNA表達(dá)水平降低，說(shuō)明干擾miR-127-3p表達(dá)可能抑制NF-κB信號(hào)通路。

綜上所述，干擾miR-127-3p表達(dá)可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HAoSMC增殖、遷移，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。