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    小龍蝦黑鰓上白流蘇真菌的中國新記錄屬和新記錄種

    2021-04-07 09:32:36趙楠楊鶴同趙桂華
    水產(chǎn)養(yǎng)殖 2021年3期
    關(guān)鍵詞:白流蘇分生孢子小龍蝦

    趙楠,楊鶴同,趙桂華,2

    (1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院,江蘇 句容 212400;2.句容市潤泰生物科技有限公司,江蘇 句容 212400)

    白流蘇屬[AlbifimbriaL. Lombard & Crous(MB815924)]隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、葡萄穗霉菌科(Stachybotriaceae),該科于2014 年由Crous 等[1]建立,包括了白流蘇屬在內(nèi)的24 屬106 種[2]。

    2016 年,Lombard & Crous[2]建立了白流蘇屬(A.L. Lombard & Crous, gen. nov.)新屬,包括綠色白流蘇菌(A.viridisL.Lombard&Crous,MB815928)、側(cè)生白流蘇菌(A.lateralisL.Lombard&Crous,MB815925)、土生白流蘇菌(A. terrestrisL. Lombard & Crous,MB815926)3 個新種和瘤狀白流蘇菌[A. verrucaria(Alb. & Schwein.)L. Lombard & Crous, MB815927]一個新組合。有性世代不詳。

    在我國,小龍蝦是綠色白流蘇菌的新宿主;在實驗室條件下,對該菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和DNA進行了研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料來源

    2018 年6 月13 日,在句容市潤泰生物科技有限公司養(yǎng)殖基地(31°50′73″N,119°10′08″E)采集到患有小龍蝦黑鰓病標本,裝入標本袋,放在4 ℃低溫冷藏箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 分離培養(yǎng)

    將病蝦黑鰓放在自來水龍頭沖洗1 h 后,再放在滅菌水中洗3 次,取出后用滅菌的濾紙吸干黑鰓上的水分,用滅菌的剪刀將病鰓片剪下,在無菌條件下,轉(zhuǎn)移到含有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi),每皿放5塊鰓片組織,置于(25±2)℃的PRX-250A 型智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)(RH70%,黑暗),共分離12 皿60塊,5 d 后取出檢查,并統(tǒng)計分離結(jié)果。對不同顏色的真菌菌落分別進行純化、編號。對分離到的細菌未作進一步研究。

    1.3 形態(tài)觀察

    ①將菌株接種到PDA 平面培養(yǎng)基上7~10 d(培養(yǎng)條件同1.2)觀察菌落生長形狀。

    ②載玻片培養(yǎng):挑取該真菌的菌絲少許,接種到載玻片上的PDA 培養(yǎng)基上[3](培養(yǎng)條件同1.2),培養(yǎng)5~6 d,待產(chǎn)生分生孢子后,做成臨時玻片,在德國蔡斯(Zeiss Imagers.A1)光學顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài),測量大?。╪=30),并拍照。再根據(jù)相關(guān)資料[2]進行形態(tài)學比對、鑒定。

    1.4 DNA 提取、純化和測序

    該真菌的DNA 提取、PCR 擴增和測序反應(yīng)的試驗方法和步驟由南京金斯瑞生物科技有限公司協(xié)助完成,測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過NCBI的Blast 檢索系統(tǒng)進行序列同源性比對。測序菌株代號為177(保存菌種代號NLHf-6,即黑鰓病真菌6 號菌株)。

    2 結(jié)果

    2.1 分離結(jié)果

    在60 塊鰓片上共分離得到真菌菌落37 個,占61.7%,細菌菌落23 個,占38.3%;經(jīng)初步鑒定,真菌有5 屬7 種,其中包括綠色白流蘇菌;其他的分離結(jié)果該文不作討論。

    2.2 白流蘇屬

    AlbifimbriaL. Lombard & Crous,Persoonia36:177 (2016)

    MycoBank MB815924

    該屬為中國新的記錄屬,模式種為瘤狀白流蘇菌[A.verrucaria(Alb.&Schwein.)L.Lombard&Crous.],有性態(tài)未知。

    在PDA 培養(yǎng)基上菌落白色,生長較慢。孢梗束似子座,表生,杯狀到盤狀,卵形到長形或外表不規(guī)則形狀,周圍有白色條紋,淡橄欖綠到暗綠色的菌絲叢;分生孢子堆粘頭狀;單根分生孢子梗從表面菌絲直接產(chǎn)生,桶狀、腎形至臘腸形,無色,光滑;子座的圓胞組織發(fā)育良好,無色。剛毛單生,不分枝,具分隔,無色,表面粗糙,薄壁,直或彎曲,從分生孢子梗之間或白色條紋中的子座基部直接產(chǎn)生;分生孢子梗菌絲狀,不規(guī)則,輪生或瓶梗狀分枝,無色,光滑;產(chǎn)孢細胞瓶梗狀,無色,光滑,圓柱形至臘腸形,具明顯囊領(lǐng);分生孢子無隔膜,橢圓形、紡錘形、檸檬形到近圓形,無色,光滑[2]。

    2.3 綠色白流蘇菌

    為中國新記錄的種(圖1、圖2)。

    A. viridisL. Lombard & Crous,Persoonia36:178 (2016) Fig.1~Fig.2

    MycoBank: MB815928

    2.3.1 培養(yǎng)性狀 在(25±2)℃(RH70%,黑暗)的PDA培養(yǎng)基上菌落生長慢,平均日生長量為2.5 mm,菌落白色(圖1),具短的氣生菌絲,在孢梗束上形成淡綠色分生孢子堆;培養(yǎng)皿背面為淡土黃色。菌落邊緣具偶散生的孢梗束,后期淡土黃色分泌物會擴散到PDA 培養(yǎng)基中。

    2.3.2 形態(tài)特征 該真菌的分生孢子座表生,杯狀至盤狀,單生聚生,卵形至長形或不規(guī)則形,(110~640)μm×(53~162)μm,菌落邊緣有剛毛,剛毛生于子座基部薄壁細胞,無色,具小瘤,有分隔,不分枝,彎曲到旋轉(zhuǎn)狀,頂端鈍圓,(58~90)μm×(3~4.2)μm;分生孢子梗從子座基部產(chǎn)生,分枝,無色,光滑,長達65 μm(圖2a);產(chǎn)孢細胞瓶梗狀,圓柱形,無色,光滑,(8~14)μm ×(1~2)μm,具明顯的囊領(lǐng);分生孢子單細胞,光滑,無色,紡錘形,梭形,(7.5~8)μm×(2~3)μm(圖2b)。

    該真菌分布在印度西部的浦那(Poona)市、伊拉克、美國堪薩斯州等地,中國屬于首次記載。小龍蝦是該真菌的新宿主。

    圖1 綠色白流蘇菌在PDA 上的菌落

    圖2 綠色白流蘇菌分生孢子梗和分生孢子

    2.4 分子鑒定

    通過對該真菌菌絲的DNA 提取,用ITS1 和ITS4 的通用引物進行PCR 擴增,得到長度為567 bp 的特異性DNA 片段。擴增ITS 區(qū)全序列(圖3),結(jié)果為:

    對擴增片段進行測序,用NCBI 的Blast 在Genbank 中搜尋相似序列,結(jié)果與Genbank 中登陸號為KU845899.1,KU845897.1,KU845896.1 和KU845892.1[包括18S 核糖體RNA 基因的部分序列,ITS1(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1),5.8S 核糖體RNA 基因和ITS2 全序列,內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2 全序列和28 S 核糖體RNA 基因部分序列]的同源性均為100%,因此,可以確定小龍蝦黑鰓上的菌株為綠色白流蘇菌(A. viridis),菌株保存在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院生物工程技術(shù)中心真菌研究室,菌株編號為NLHf-6。

    圖3 ITS 1 和ITS 4 區(qū)域的PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

    2.5 相似種的比較

    根據(jù)2016 年Lombard 等[2]報道的白流蘇屬的4個種,土生白流蘇菌(A. terrestris)作為一個新組合,與其他2 個種形成了高度支持的進化枝,形態(tài)學類似于瘤狀白流蘇菌(A. verrucaria)[4]和綠色白流蘇菌。土生白流蘇菌的分生孢子(6~8)μm×(2~3)μm,平均(7×3)μm,比瘤狀白流蘇菌和綠色白流蘇[(7~8)μm ×(2~3)μm]略小一些[4],而側(cè)生白流蘇菌(A.lateralis)的分生孢子(4~6)μm×(2~4)μm,平均(5×3)μm,是分生孢子最小的種[2]。

    綠色白流蘇是小龍蝦黑鰓病鰓組織上的一種真菌,是否是病原仍需進行致病性試驗才能確定。

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