基于對(duì)NOD小鼠頜下腺RORγt、Foxp3及其mRNA調(diào)節(jié)探討白芍總苷治療干燥綜合征的作用機(jī)制

吳國(guó)琳，王 慶，盧雯雯，熊福林，高 麗，卞 華*

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，杭州 310003；2浙江省立同德醫(yī)院，杭州 310012；3南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽(yáng) 473004

干燥綜合征(sjogren’s syndrome，SS)是一種常見(jiàn)的風(fēng)濕免疫性疾病，多發(fā)生于中青年女性，其發(fā)病率列風(fēng)濕免疫性疾病第二位。常見(jiàn)臨床癥狀為口干、眼干、關(guān)節(jié)疼痛、乏力等，嚴(yán)重者可影響生活質(zhì)量。目前SS尚無(wú)確切的病因和發(fā)病機(jī)制，一般認(rèn)為是在遺傳、病毒感染和性激素異常等多種因素作用下，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，通過(guò)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)造成淋巴細(xì)胞侵犯唾液腺和淚腺等外分泌腺而發(fā)病[1]。有研究證實(shí)T輔助細(xì)胞17(Thl7)/Treg細(xì)胞偏移及其免疫失衡與SS發(fā)病密切相關(guān)，而Th17/Treg之間的動(dòng)態(tài)平衡可通過(guò)其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體γt(retinoidrelated orphan receptor，RORγt)/叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead transcription factor 3，F(xiàn)oxp3)介導(dǎo)[2]。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從中藥白芍中提取的一種糖苷類(lèi)物質(zhì)，是白芍的主要化學(xué)成分[3]，在臨床應(yīng)用治療SS能改善患者口干、眼干等癥狀，有較好臨床療效，且安全性較高[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究白芍總苷對(duì)SS模型小鼠頜下腺Th17、Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR γt mRNA、FoxP3 mRNA的表達(dá)水平的影響，探討白芍總苷治療SS的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇8周齡的雌性非肥胖型糖尿病(non obese diabetes，NOD)小鼠24只，SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：20130016000707。在無(wú)菌的恒定溫度和濕度條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(批件號(hào)(2018)實(shí)動(dòng)快審第(048)號(hào))。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.3 g/粒，批號(hào)20180718)用蒸餾水稀釋成含生藥量15 g/mL。硫酸羥氯喹片(由上海中西制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.1 g/片，批號(hào)：180812)，用蒸餾水稀釋成含生藥量3 mg/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)；兔抗鼠RORγt、FoxP3多克隆抗體(美國(guó)SANTA CRUZ公司生產(chǎn))；RORγt、FoxP3原位雜交檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

將24只NOD小鼠隨機(jī)分為4組，即模型組、白芍總苷組、羥氯喹組以及聯(lián)合組，每組各6只，另外選6只BALB/c小鼠為正常對(duì)照組。每組小鼠的給藥量按動(dòng)物與人等效劑量換算表計(jì)算。

白芍總苷組每日定時(shí)按照300 mg/kg劑量分別灌胃TGP稀釋液0.4 mL，羥氯喹組每日按60 mg/kg劑量灌胃硫酸羥氯喹稀釋液0.4 mL,聯(lián)合組每日灌胃TGP 0.4 mL+羥氯喹0.4 mL。模型組和正常組灌胃等體積的生理鹽水0.4 mL。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠在喂養(yǎng)并給藥8周后，頸椎脫臼處死后，立即摘取雙側(cè)頜下腺組織進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。觀察及檢測(cè)指標(biāo)如下。

2.2.1 頜下腺組織病理觀察

將摘取的小鼠頜下腺組織放置于4%多聚甲醛中固定，然后包埋、切片、HE染色后，在光鏡下觀察組織的病理變化，分析各組小鼠頜下腺的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度，并根據(jù)Chisholm- Mason組織學(xué)評(píng)分方法將各組小鼠頜下腺病變輕重程度進(jìn)行量化分析，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2.2.2 RT-PCR法檢測(cè)頜下腺組織RORγt mRNA、FoxP3 mRNA的表達(dá)

2.2.2.1 檢測(cè)步驟

以GAPDH為內(nèi)參，用Trisol試劑盒提取頜下腺總RNA，然后取1 μL進(jìn)行RT-PCR分析。GAPDH引物序列：上游5′-AAGGGTGGAGCCAAAAGGG-3，下游5′-TGGGGGTAGGA ACACGGAA-3；RORγt引物序列：上游5′-AAGCAGGAGCAATGGAAGTCG-3，下游5′- GAGAACCAGGGCCGTGTAGAG-3；FoxP3引物序列為：5′-GAGAAAGCGGATACCA AATGA -3，下游5′-GAGACAGAGATGGGCAAGAAG-3。本實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 5 min，再將反應(yīng)條件變?yōu)?4 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，然后循環(huán)擴(kuò)增40次，于60 ℃檢測(cè)熒光值。RORγt mRNA、FoxP3 mRNA及內(nèi)參GAPDH分別在兩個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，除探針和引物外，兩管中加入的RNA模板和其他反應(yīng)試劑均一致。

表1 SS模型小鼠頜下腺病理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2.2 結(jié)果判斷

通過(guò)ABI Stepone plus熒光定量PCR儀測(cè)定并取其循環(huán)閾值均值(CT值)，結(jié)果采用相對(duì)定量分析法，即2-△△CT法進(jìn)行mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，以各組△CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)以模型組做為未處理組，與其他各組進(jìn)行比較。具體計(jì)算公式如下：

△CT=目的基因CT值(實(shí)驗(yàn)組)-該組內(nèi)參基因CT值

△△CT=(目的基因CT值—內(nèi)參基因CT值)實(shí)驗(yàn)組-(目的基因CT值—內(nèi)參基因CT值)模型組

△CT值越小表示RORγt mRNA、FoxP3 mRNA在頜下腺組織中的表達(dá)越高，而2-△△CT值越高，表明樣本中RORγt mRNA、FoxP3 mRNA相對(duì)于模型組表達(dá)量越大。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組和羥氯喹組各有1只小鼠死亡，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)是因灌胃不當(dāng)損傷食管引起。

3.1 各組小鼠頜下腺組織形態(tài)學(xué)觀察

3.1.1 光鏡下頜下腺病理觀察

頜下腺病理觀察顯示(見(jiàn)圖1)，正常組頜下腺腺泡大小基本均一，腺泡及導(dǎo)管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)中未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組頜下腺腺泡大小不等，部分有破壞，間質(zhì)有中度或重度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)局部腺體萎縮及纖維組織增生。白芍總苷組、羥氯喹組以及聯(lián)合組小鼠頜下腺病理顯示腺泡大小不一，可見(jiàn)少量腺泡和導(dǎo)管結(jié)構(gòu)破壞，有散在的單個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且聯(lián)合組少于白芍總苷組和羥氯喹組。

圖1 各組小鼠頜下腺病理(HE 10×40)Fig.1 Submandibular gland pathology of mice in each group(HE 10×40)注：A：正常組；B：模型組；C：羥氯喹組；D：白芍總苷組；E：聯(lián)合組。Note:A:The normal group;B:Model group;C:HCQ group;D:TGP group;E:Combined group.

3.1.2 各組小鼠頜下腺組織病理評(píng)分比較

表2 各組頜下腺組織病理評(píng)分比較

病理評(píng)分顯示(見(jiàn)表2)，正常組小鼠頜下腺組織病理評(píng)分顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，模型組小鼠頜下腺組織病理評(píng)分明顯高于其他組，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)合組低于白芍總苷組和羥氯喹組，統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異(P<0.05)。

3.2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表達(dá)比較

3.2.1 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量△CT比較

由表3中可以看出，正常組小鼠頜下腺組織RORγt mRNA的△CT值顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組，模型組高于其他各組，且與正常組和聯(lián)合組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而聯(lián)合組低于模型組、羥氯喹組和白芍總苷組，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組頜下腺RORγt mRNA、Foxp 3 mRNA表達(dá)量△CT比較

各組小鼠頜下腺組織Foxp3 mRNA的△CT值比較發(fā)現(xiàn)，模型組明顯低于其他組，且與正常組和聯(lián)合組相比統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異(P<0.05)，聯(lián)合組雖然高于羥氯喹組和白芍總苷組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2.2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量2-△△CT值比較

從圖2中看出，各組小鼠頜下腺組織RORγt mRNA表達(dá)量的2-△△CT值從高到低一次為：模型組>羥氯喹組>白芍總苷組>聯(lián)合組>正常組；各組小鼠頜下腺組織FoxP3 mRNA表達(dá)量的2-△△CT值從高到低依次為：正常組>聯(lián)合組>白芍總苷組>羥氯喹組>模型組。

4 討論

SS的病因和發(fā)病機(jī)制雖然不明，但與機(jī)體自身免疫耐受被打破導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)失衡有重要關(guān)系。近年來(lái)，輔助性T細(xì)胞(Th)的分化及其免疫平衡在SS發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注，一般認(rèn)為，Th17/Treg之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用，若此種平衡失調(diào)可引起全身或局部免疫應(yīng)答異常，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。輔助性T細(xì)胞的分化方向取決于調(diào)控其分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究證實(shí)，RORγt的表達(dá)激活促進(jìn)前體細(xì)胞分化為T(mén)hl7細(xì)胞，是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，維持Thl7細(xì)胞的分泌功能，對(duì)致病性Thl7細(xì)胞的分化起關(guān)鍵性作用。而Foxp3是控制Treg細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)pSS患者唇腺中Foxp3 mRNA表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3參與了pSS的發(fā)病[5]。在SS的發(fā)病過(guò)程中，Thl7效應(yīng)增強(qiáng)可能促進(jìn)SS的發(fā)展及惡化，而調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞可抑制過(guò)度亢進(jìn)的Thl7，以維持機(jī)體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)，但Thl7/Treg免疫失衡可能促發(fā)或加劇SS的發(fā)生發(fā)展[6]，提示轉(zhuǎn)錄因子RORγt/FoxP3介導(dǎo)Thl7/ Treg之間的免疫平衡與SS發(fā)病密切相關(guān)。

圖2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量2-△△CT值Fig.2 Relative expression levels of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in submandibular glands of mice in each group 2-△△CT values

目前SS無(wú)有效治療方法，治療目標(biāo)是緩解癥狀和預(yù)防并發(fā)癥。而中西藥協(xié)同治療SS可有助于緩解SS患者口干、眼干、乏力、關(guān)節(jié)痛等癥狀，促進(jìn)淚腺和唾液分泌功能，提高患者生活質(zhì)量，避免西藥不良反應(yīng)，減少?gòu)?fù)發(fā)率，其優(yōu)勢(shì)已被廣泛認(rèn)可[7]。TGP治療SS有明顯的臨床療效，TGP聯(lián)合HCQ治療pSS效果顯著，且副作用較少[8]。

NOD小鼠是目前最為理想的干燥綜合征實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,廣泛應(yīng)用于SS的發(fā)病機(jī)制及療效研究[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白芍總苷能減輕NOD小鼠頜下腺淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)程度，可預(yù)防自發(fā)性涎腺炎的發(fā)生[10]，也能促進(jìn)NOD小鼠頜下腺水分子通道蛋白-5(AQP-5)的表達(dá)，改善口干多飲等癥狀，并能調(diào)節(jié)小鼠血清及頜下腺組織的Thl/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)[11,12]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組NOD小鼠頜下腺病理?yè)p害明顯較正常組嚴(yán)重，經(jīng)藥物干預(yù)后均得到不同程度的改善，且聯(lián)合組明顯優(yōu)于單純羥氯喹組和白芍總苷組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組NOD小鼠頜下腺RORγt mRNA的表達(dá)明顯高于正常組，而Foxp3 mRNA的表達(dá)明顯低于正常組，經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組能明顯降低頜下腺RORγt mRNA的表達(dá)，最接近于正常組，效果優(yōu)于羥氯喹組和白芍總苷組。聯(lián)合組頜下腺Foxp3 mRNA的表達(dá)低于模型組、羥氯喹組和白芍總苷組，且與模型組相比有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白芍總苷能改善干燥綜合征NOD小鼠頜下腺的病理?yè)p害，并能有效下調(diào)RORγt mRNA的表達(dá)，上調(diào)Foxp3 mRNA的表達(dá)，由此我們推測(cè)，白芍總苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA、FoxP3mRNA的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)其相應(yīng)介導(dǎo)的Thl7/Treg之間的免疫平衡而起到治療SS的作用，將為今后進(jìn)一步深入研究白芍總苷的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供新思路。