基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討銀杏葉治療高血壓病潛在作用機(jī)制

劉翠翠，楊 晨，楊 濤，朱俊豪，莊鈺金，顏 軍*，余 能

1成都大學(xué)藥學(xué)院 四川抗菌素工業(yè)研究所 藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610052；2成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；3成都晶富醫(yī)藥科技有限公司，成都 610041

高血壓是一種以體循環(huán)動(dòng)脈壓升高為特征的慢性心血管疾病，可導(dǎo)致心、腦、腎等器官損傷，同時(shí)，也將大幅增加人們患有冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的概率[1]。隨著人口老齡化加劇，我國(guó)高血壓及其導(dǎo)致的心腦血管疾病的患病率不斷增加，高血壓防治已成為我國(guó)公共衛(wèi)生的一項(xiàng)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。從高血壓臨床表現(xiàn)來(lái)看，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“肝風(fēng)”、“頭痛”、“眩暈”等病癥范疇[3]，并分為肝火亢盛、痰濕壅盛、陰虛陽(yáng)亢、陰陽(yáng)兩虛4個(gè)證型，治療時(shí)因人施治、辨證論治[4]。銀杏葉作為銀杏的藥用部位之一，其主要有效成分有黃酮類、萜內(nèi)脂類、銀杏酸類化合物[5]，具有調(diào)節(jié)血脂、改善腦血流、抑制血小板活性、抗衰老、抗凋亡等多種藥理作用[6]。目前，銀杏葉制劑已成為治療心腦血管疾病植物藥品種之一[7]，已有多種銀杏葉制劑(如：銀杏葉片、銀杏酮酯、舒血寧注射液、銀杏達(dá)莫注射液等)應(yīng)用于臨床。同時(shí)，臨床上使用西藥和銀杏葉制劑對(duì)高血壓患者聯(lián)合用藥結(jié)果顯示，兩種藥物的降壓效果優(yōu)于單純服用降壓藥，但銀杏葉制劑降壓的成分和機(jī)制尚不明確[8]。運(yùn)用“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)來(lái)揭示多分子藥物協(xié)同作用于疾病的機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)學(xué)的整體觀以及中藥及其復(fù)方多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸[9]。由此，該文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)銀杏葉治療高血壓的潛在機(jī)制與作用網(wǎng)絡(luò)展開(kāi)了研究，以便為銀杏葉制劑的臨床應(yīng)用與研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt(http://www.uniprot.org/)；靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)Swiss Target Prediction平臺(tái)(http://www.swisstargetprediction.ch/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim org)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)；DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)；DAVID平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)；微生信網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)；PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)；ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://zinc.docking.org/)；Cytoscape 3.7.2軟件；AutoDock分子模擬軟件及Pymol。

1.2 主要化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)的收集與篩選

銀杏葉成分檢索數(shù)據(jù)庫(kù)選用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；候選化合物篩選條件為化合物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中類藥性(drug-like，DL)≥0.18且口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%；運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索候選化合物靶點(diǎn)并通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt)將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因；運(yùn)用Swiss Target Prediction平臺(tái)(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)候選化合物潛在靶點(diǎn)。最后合并TCMSP與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的化合物靶點(diǎn)并剔除重復(fù)基因，即得藥物作用的靶點(diǎn)基因。

1.3 高血壓病相關(guān)基因的收集

將“hypertension”作為檢索關(guān)鍵詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)中進(jìn)行高血壓病靶點(diǎn)的檢索并刪除重復(fù)基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

1.4.1 成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

取化合物的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與高血壓相關(guān)靶點(diǎn)的交集，即得到銀杏葉治療高血壓的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。然后，在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建其成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并以節(jié)點(diǎn)表示化合物、靶蛋白，邊表示化合物-靶點(diǎn)的相互作用。運(yùn)用Cytoscape軟件的“Network Analyzer”功能分析成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩裕?jì)算節(jié)點(diǎn)的緊密度(closeness)、介度(betweenness)、連接度(degree)3個(gè)重要參數(shù)并據(jù)此分析銀杏葉治療高血壓的主要活性成分。

1.4.2 構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，將“物種”設(shè)置為“Homo sapiens”、“最低相互作用閾值”設(shè)置為“中等置信度>0.4”，其余參數(shù)均保持默認(rèn)。然后，運(yùn)用Cytoscape軟件分析PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，并篩選其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO生物過(guò)程與KEGG通路富集分析

運(yùn)用DAVID平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)銀杏葉治療高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG分析，“物種”選擇為“H.sapiens”，預(yù)測(cè)銀杏葉治療高血壓病的潛在作用機(jī)制。篩選出P<0.05的生物過(guò)程與通路，并根據(jù)富集基因的多少排序，將前20位的通路導(dǎo)入微生信網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制條形圖和氣泡圖。

1.6 成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)篩選、分析富集基因數(shù)排名前20的KEGG信號(hào)通路，得出可能與高血壓相關(guān)的信號(hào)通路，并找出富集在這些通路上的抗高血壓靶點(diǎn)，再與相應(yīng)的活性成分配對(duì)，從而構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中“degree”值排名前3的靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，同時(shí)以蛋白配體和一線降壓藥氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide)、呋塞米(Furosemide)為陽(yáng)性對(duì)照，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中下載靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)“.pdb”格式文件，在ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://zinc.docking.org/)中下載化合物3D結(jié)構(gòu)的“.mol2”格式文件。在AutoDock Tools(v1.5.6)中導(dǎo)入靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)去水、加氫、分配電荷等處理，運(yùn)用Grid模塊設(shè)置蛋白原配體為對(duì)接盒子中心，其格點(diǎn)盒子大小設(shè)定為40×40×40，將準(zhǔn)備好的蛋白文件、配體文件、化合物文件以及腳本放入相應(yīng)文件夾，利用Autodock_vina 1.1.2分子模擬軟件進(jìn)行分子對(duì)接。然后，用結(jié)合能(affinity)來(lái)評(píng)價(jià)化合物與受體的匹配情況，并使用Pymol繪制最佳匹配結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉主要活性成分的篩選

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出307個(gè)銀杏化學(xué)成分，再根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的原則，篩選出27個(gè)化合物，主要含黃酮類如山柰酚(MOL000422)、槲皮素(MOL000098)、異鼠李素(MOL000354)及木犀草素(MOL000006)和銀杏內(nèi)酯等(見(jiàn)表1)。

表1 銀杏葉活性成分及ADME參數(shù)

續(xù)表1

圖1 銀杏葉活性成分與交集靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Interaction network between active components and intersection targets in GBL注：六邊形節(jié)點(diǎn)代表活性成分；菱形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。Note:The hexagonal node represents the active component;The rhombic node represents the target.

2.2 藥物疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

運(yùn)用TCMSP、Swiss Target Prediction平臺(tái)分別檢索出470、1 328個(gè)潛在靶點(diǎn)，刪除成分間重復(fù)靶點(diǎn)后分別獲得218、354個(gè)潛在靶點(diǎn)，將其合并、剔除重復(fù)靶點(diǎn)后得到480個(gè)潛在靶點(diǎn)。然后，在OMIM、DrugBank、GeneCards三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘出了1 136個(gè)高血壓相關(guān)靶點(diǎn)。至此可知，兩個(gè)數(shù)據(jù)集的交集(190個(gè))即為銀杏葉治療高血壓的潛在靶點(diǎn)。與篩選出的27個(gè)主要活性成分匹配后得到22個(gè)具有降壓作用的活性成分。

2.3 網(wǎng)絡(luò)圖分析

2.3.1 成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將銀杏葉中可能具有降壓作用的22個(gè)活性成分及190個(gè)交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，共有212個(gè)節(jié)點(diǎn)，形成762個(gè)關(guān)系對(duì)。該成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)degree平均值為7.19，介值中心度(betweenness centrality，BC)平均值為0.009 8，緊密中心度(closeness centrality，CC)平均值為0.34，這表明銀杏葉中多成分、多靶點(diǎn)相互作用。靶點(diǎn)數(shù)排名前5的成分分別為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、異鼠李素(isorhamnetin)、金圣草(黃)素(chryseriol)，揭示這些成分可能是銀杏葉治療高血壓的有效成分，拓?fù)鋮?shù)見(jiàn)表2。

表2 銀杏葉-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

2.3.2 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置置信度≥0.4得到187個(gè)靶點(diǎn)、形成3 093個(gè)蛋白互作關(guān)系對(duì)，且有3個(gè)無(wú)蛋白相互作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。因網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)“degree”中位數(shù)為25，故以“degree”大于等于2倍中位數(shù)的值為篩選條件，即“degree≥50”，篩選出44個(gè)候選靶點(diǎn)；然后對(duì)其進(jìn)行degree、betweenness以及closeness計(jì)算分析，再篩選出大于中位數(shù)的靶點(diǎn)，得到20個(gè)關(guān)鍵的治療高血壓靶點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。將這20個(gè)靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)成分進(jìn)行匹配后，按照度值篩選前五位成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、金圣草(黃)素、異鼠李素，與之前得到的靶點(diǎn)數(shù)前五的成分一致，說(shuō)明這五個(gè)成分為銀杏葉治療高血壓的關(guān)鍵成分。

2.4 GO生物過(guò)程和KEGG通路富集分析

運(yùn)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上文中得到的20個(gè)關(guān)鍵治療高血壓靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，得到248個(gè)條目。并且，以P<0.05為篩選條件，篩選出208個(gè)有效條目。其中，182個(gè)生物過(guò)程條目、10個(gè)細(xì)胞組成條目、16個(gè)分子功能條目。圖4所示的是篩選出的最低P值的10個(gè)條目并將其升序排列的情況。結(jié)果顯示，生物過(guò)程主要涉及一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、藥物反應(yīng)(response to drug)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)及血管生成(angiogenesis)等，細(xì)胞組成中主要影響細(xì)胞外空間(extracellular space)、細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region)、小窩(caveola)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein complex)；分子功能主要包括相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等方面。

圖2 銀杏葉治療高血壓病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein protein interaction (PPI) network of GBL as a target for the treatment of hypertension

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)篩選Fig.3 PPI network screening注：藍(lán)色代表度值小于50的靶點(diǎn)；紅色代表度值大于50的靶點(diǎn)；黃色代表度值大于67、介度大于5.466、緊密度大于0.896的靶點(diǎn)。Note:The blue represents targets with degree value less than 50;The red represents targets with degree value greater than 50;The yellow represents targets with degree value greater than 67,betweenness greater than 5.466,and closeness greater than 0.896.

再對(duì)這20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析并以P<0.05為篩選條件，得到90條信號(hào)通路。然后，按P值大小升序排列，前20位的信號(hào)通路分別是乙型肝炎(Hepatitis B)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等(見(jiàn)圖5)。

圖4 銀杏葉活性成分GO生物過(guò)程分析Fig.4 Biological process analysis of active component go in GBL

圖5 銀杏葉活性成分-靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of active components target KEGG pathway in GBL

2.5 活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

從KEGG排名前20的信號(hào)通路中篩選出可能與高血壓相關(guān)的10條，并將其與銀杏葉的活性成分、作用靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，構(gòu)建“成分—靶點(diǎn)—通路”多維網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖6)。圖中度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深。由此分析可得，銀杏葉治療高血壓涉及的活性成分共21個(gè)，關(guān)鍵成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素等，靶點(diǎn)有PTGS2、ATK1、EGFR、TNF等，主要涉及乙型肝炎、TNF信號(hào)通路、甲型流感、結(jié)核、MAPK信號(hào)通路等。

圖6 銀杏葉活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Active components target signal pathway network of GBL注：菱形節(jié)點(diǎn)為活性成分；箭頭節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)；圓形節(jié)點(diǎn)為信號(hào)通路。Note:Rhombus node is the active component;Arrow node is the target;Round node is signal pathway.

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

選取“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中“degree”值排名前3的靶點(diǎn)PTGS2、ATK1、EGFR作為銀杏葉治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)，與核心活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素以及蛋白配體、一線降壓藥氫氯噻嗪、呋塞米進(jìn)行分子對(duì)接(見(jiàn)表3)。一般情況下，對(duì)接評(píng)分的絕對(duì)值越大，化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合力越強(qiáng)、構(gòu)象也越穩(wěn)定。絕對(duì)值>4.25時(shí)，說(shuō)明化合物與靶點(diǎn)可能結(jié)合；絕對(duì)值>5.0時(shí)，說(shuō)明結(jié)合能力較高；絕對(duì)值>7.0時(shí)，說(shuō)明結(jié)合能力高[10]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，化合物與靶蛋白的最低結(jié)合能都小于0，說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合。其中金圣草黃素、木犀草素、異鼠李素與PTGS2、ATK1、EFGR等結(jié)合能絕對(duì)值均大于其他化合物與一線降壓藥氫氯噻嗪、呋塞米，其中金圣草黃素、木犀草素、異鼠李素與EGFR的結(jié)合能絕對(duì)值高于蛋白配體，表明其具有強(qiáng)的結(jié)合能力。分子對(duì)接模式如圖7所示。分析表明木犀草素(a)與PTGS2共形成9個(gè)氫鍵，金圣草黃素(b)與PTGS2共形成9個(gè)氫鍵，槲皮素(c)與PTGS2共形成8個(gè)氫鍵，說(shuō)明活性成分與靶蛋白具有較強(qiáng)的親和力，且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定。綜合分析，槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素可能是銀杏葉治療高血壓的關(guān)鍵成分。

3 討論

高血壓的危險(xiǎn)因素與遺傳、年齡、體重、飲食、生活習(xí)慣等多種因素相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為證候要素以陰虛、氣虛、痰、血虛等為主，肝與腎臟是受高血壓影響的主要靶器官?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為：高血壓的發(fā)病機(jī)制與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、粘附分子和細(xì)胞因子表達(dá)的增加、水鈉潴留、免疫細(xì)胞活化和浸潤(rùn)、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的形成等有關(guān)。這些系統(tǒng)或功能長(zhǎng)期紊亂，會(huì)破壞血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)，使血管平滑肌細(xì)胞肥大、血管舒縮功能失調(diào)、外周阻力增加等而造成血壓升高[11]。

表3 銀杏葉活性成分與高血壓潛在作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

圖7 分子對(duì)接模式圖Fig.7 Molecular docking pattern注：a.PTGS2-木犀草素；b.PTGS2-金圣草黃素；c.PTGS2-異鼠李素；d.AKT1-木犀草素；e.AKT1-金圣草黃素；f.AKT1-異鼠李素；g.EGFR-木犀草素；h.EGFR-金圣草黃素；i.EGFR-異鼠李素。Note:a.PTGS2-Luteolin;b.PTGS2- Chryseriol;c.PTGS2-Isorhamnetin;d.AKT1-Luteolin;e.AKT1- Chryseriol;f.AKT1-Isorhamnetin;g.EGFR-Luteolin;h.EGFR-Chryseriol;i.EGFR-Isorhamnetin.

對(duì)銀杏葉治療高血壓的作用網(wǎng)絡(luò)與潛在機(jī)制的研究結(jié)果表明：銀杏葉中可能含有21個(gè)成分對(duì)治療高血壓有顯著效果，其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、金圣草黃素為關(guān)鍵成分，銀杏內(nèi)酯等作為協(xié)同作用成分。槲皮素和山柰酚等具有顯著的心臟相關(guān)益處，如抑制LDL氧化、非內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張劑的作用；減少粘附分子和其他炎癥標(biāo)記，在氧化應(yīng)激條件下對(duì)一氧化氮和內(nèi)皮功能的保護(hù)作用；還可預(yù)防神經(jīng)元氧化和炎性損害以及血小板的抗凝集作用[12]。已有研究表明氧化應(yīng)激是高血壓的重要促成因素，并且在高血壓腎損害中起著關(guān)鍵作用。銀杏內(nèi)酯具有抗氧化應(yīng)激作用，提高高血壓腦出血治療效果，對(duì)高血壓腦出血患者神經(jīng)功能的恢復(fù)具有積極作用[13]，同時(shí)，銀杏內(nèi)酯還可協(xié)同作用銀杏黃酮有效清除過(guò)量氧自由基[14]。此外，該文收集到的銀杏葉190個(gè)治療高血壓的靶點(diǎn)，表明銀杏葉治療高血壓不是單一成分或靶點(diǎn)的作用，而是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。

從構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)可知，銀杏葉與高血壓靶點(diǎn)存在密切相互作用，核心靶點(diǎn)有20個(gè)，主要與PTGS2、AKT1、EGFR、TNF、MMP9、MAPK1、STAT3、EGFR、MMP2、IL6等有關(guān)。研究表明，心血管疾病的病理生理和高血壓炎癥機(jī)制的發(fā)生與血管、腎臟和血管周圍脂肪組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)息息相關(guān)[15]。其中，JUN是AP-1(激活子蛋白-1)的組成之一，而AP-1可誘導(dǎo)炎癥因子白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、腫瘤壞死因子(TNF)等的表達(dá)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的增殖，血管阻力增大從而導(dǎo)致血壓升高[16]。前列腺素內(nèi)源性過(guò)氧化物合酶(PTGS2)能夠激活分布在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上的前列環(huán)素受體G蛋白，從而松弛血管平滑肌及抑制血小板聚集，降低血壓[17]。VEGFA為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)新血管生成，調(diào)節(jié)血管張力，在調(diào)節(jié)病理性血管生成中起著核心作用[18]。血管內(nèi)皮障礙相關(guān)基因MAPK1、AKT1等參與了MAPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與血管生成，并與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[19]。黃酮類成分能有效抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和VCAM-1的產(chǎn)生，并增強(qiáng)抗氧化能力[20]。同時(shí)，銀杏葉中的銀杏內(nèi)酯也可降低IL-6、TNF-α、MMP9等炎癥因子水平，改善炎癥反應(yīng)[21]。那么，銀杏葉極有可能是通過(guò)控制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而起到治療作用。

進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，GO富集分析顯示：銀杏葉治療高血壓主要通過(guò)對(duì)一氧化氮生物合成過(guò)程和平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、血管生成等生物過(guò)程發(fā)揮作用。KEGG通路富集結(jié)果顯示，乙型肝炎、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、HIF-1通路、MAPK信號(hào)通路等是銀杏葉降壓的主要通路。研究表明：HIF-1α、VEGF信號(hào)通路被認(rèn)為是治療與血管生成有關(guān)的疾病的重要靶標(biāo)[22]；HIF還可激活控制細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的基因，包括與耗氧、紅細(xì)胞生成、血管生成和線粒體代謝有關(guān)的基因[23]。這正好佐證了GO富集分析結(jié)果中影響NO的生物合成與血管生成等生物過(guò)程。同時(shí)，槲皮素能顯著抑制TLR4-NF-κB通路，減少炎癥因子釋放，從而改善心室重構(gòu)[24]；木犀草素通過(guò)激活Toll樣受體4(TLR4)、TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，降低了腦出血誘發(fā)的細(xì)胞因子的釋放[25]；銀杏內(nèi)酯可通過(guò)抑制IL-1β、TNF等信號(hào)通路，從而控制炎癥反應(yīng)、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、改善組織血流量[26]。

綜上所述，該文系統(tǒng)地分析了銀杏葉治療高血壓的作用機(jī)制，揭示了銀杏葉治療高血壓潛在的活性成分、作用網(wǎng)絡(luò)和潛在作用機(jī)制，證明了銀杏葉治療高血壓具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，為進(jìn)一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析和作用機(jī)制研究提供方向，其后期需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)通路間的關(guān)系。