烏鱉黑色素理化性質(zhì)及其抗氧化活性研究

項(xiàng)錦敏，趙瓊瑜，遠(yuǎn) 航，彭振輝，宋 偉

浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波 315100

黑色素是目前所知唯一能保護(hù)生物體免受輻射傷害的天然內(nèi)源性生物聚合體，具有很強(qiáng)的生理活性，能夠有效的消除自由基[1]，對(duì)人體具有提高機(jī)體免疫力[2]、防止衰老[3,4]、抑制病毒[5]等功能。因此，黑色素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域。目前，天然黑色素的開(kāi)發(fā)研究主要集中在植物、真菌類材料。動(dòng)物中黑色素與蛋白質(zhì)、脂肪等緊密相連、不易分離。因此，動(dòng)物來(lái)源的黑色素研究局限在烏骨雞[6]、泥鰍[7]、大鯢[8]、海參[9]等少數(shù)烏質(zhì)性狀動(dòng)物材料中。

“清溪烏鱉”(Pelodiscussinensis，以下簡(jiǎn)稱“烏鱉”)是從中華鱉的體色變異個(gè)體經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁得到的新品種[10]，是浙江省特有地方品種，其典型形態(tài)特征是全身體色烏黑，富含黑色素，具有很高的食藥用價(jià)值[11]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從形態(tài)特征[10]、養(yǎng)殖性能[12]、營(yíng)養(yǎng)成分[13]、同工酶[14]、細(xì)胞水平和DNA分子水平[15]等方面對(duì)烏鱉種質(zhì)資源進(jìn)行研究。有關(guān)烏鱉中黑色素的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本文以烏鱉肌肉為原材料采用“脫脂-酶解-酸解”三步法制備烏鱉黑色素，探討其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及抗氧化活性，以期為烏鱉綜合利用以及高值化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：烏鱉，體重約為500 g，購(gòu)于浙江清溪鱉業(yè)有限公司。

試劑：黑色素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；木瓜蛋白酶，酶活力≥2 000 U/mg(生工生物工程(上海)股份有限公司)；甲醇、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮、二甲基亞砜、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、氫氧化鈉、溴化鉀、濃硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、乙二胺四乙酸二鈉、核黃素，AR(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，≥97.0%(HPLC)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

儀器：百萬(wàn)分之一微量天平XS3DU(梅特勒-托利多公司)；DS-1高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；Alphal-4LSCplus冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司)；5810大容量低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；DHG-9246A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；CM-700D色差計(jì)(日本柯尼卡美能達(dá)公司)；Cary100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)；Vertex 70傅立葉紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司)；VarioMicro cube元素分析儀(德國(guó)Elemtar公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 烏鱉肌肉黑色素的提取

參考Huang等[6]的方法，略作修改?；铙w宰殺后剝離肌肉，在高速組織勻漿機(jī)中打碎成肉糜，于冷凍干燥機(jī)中凍干，-20 ℃密封保存?zhèn)溆?。精密稱取一定量樣品置于索氏提取器中，按照乙醇回流脫脂8次，料液比1∶60(m∶V)條件進(jìn)行脫脂，脫脂反應(yīng)結(jié)束后，濾渣置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒重；脫脂后用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解工藝為酶底比為1∶2(m∶m)、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間5 h、料液比1∶25(m∶V)、酶解pH 5.0，酶解處理結(jié)束后，10 000 rpm離心15 min，蒸餾水沖洗離心2～3次，沉淀物置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒重；最后利用鹽酸進(jìn)行純化，純化工藝為鹽酸濃度6 mol/L、料液比3∶50(m∶V)、時(shí)間4 h、溫度90 ℃，酸化處理結(jié)束后，10 000 rpm離心15 min，蒸餾水沖洗離心2～3次，沉淀物置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒重，低溫密封保存?zhèn)溆?。此提取工藝條件下，烏鱉黑色素提取率達(dá)1.09%。提取率計(jì)算公式如下：

提取率=[“脫脂-酶解-酸解”三步法制備的烏鱉黑色素(g)/烏鱉干肉重(g)]×100%

1.2.2 烏鱉黑色素的結(jié)構(gòu)特征檢測(cè)

1.2.2.1 紫外可見(jiàn)光分光光度掃描

精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，震蕩均勻，在80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，獲得黑色素溶液。待冷卻至室溫后(避光)，紫外可見(jiàn)光分光度計(jì)測(cè)定190～800 nm范圍內(nèi)吸光值，繪制隨波長(zhǎng)變化的曲線圖。

1.2.2.2 傅里葉紅外掃描

精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品分別與0.1 g溴化鉀混合，在瑪瑙研缽中研成細(xì)粉，混合均勻后用紅外壓片機(jī)壓片。測(cè)定樣品在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜。

1.2.2.3 元素組成分析

參考Tu等[16]的方法，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 19143-2017《巖石有機(jī)質(zhì)中碳、氫、氧元素分析方法》和國(guó)標(biāo)GB/T 19145-2003《沉積巖中總有機(jī)碳的測(cè)定》的方法，采用元素分析儀測(cè)定烏鱉黑色素中的 C、H、O、N、S等元素含量。

1.2.3 烏鱉黑色素的理化性質(zhì)檢測(cè)

1.2.3.1 粉末顏色

黑色素粉末的外觀顏色通過(guò)色差計(jì)測(cè)定，色差值采用L*、a*和b*表示。

1.2.3.2 溶解性研究

溶劑選擇：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL不同溶劑(甲醇、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、二甲基亞砜、蒸餾水、1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液)于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測(cè)定其在215 nm處的吸光值。

溶解溫度：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻后分別置于25、40、60、80、100 ℃恒溫水浴中保持1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測(cè)定其在215 nm處的吸光值。

溶劑濃度：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入10 mL的0.25、0.5、1、1.5、2 mol/L的氫氧化鈉溶液，溶液搖勻后于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測(cè)定其在215 nm處吸光值。

料液比：分別精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，按照料液比(m∶V)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入1 mol/L氫氧化鈉溶液混合均勻，將溶液置于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h(避光)，待溶液冷卻至室溫后測(cè)定其在215 nm處吸光值。

時(shí)間：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL的1 mol/L的氫氧化鈉溶液，混合均勻后將溶液在80 ℃下恒溫加熱10、20、30、60、90、120 min(避光)，待溶液冷卻至室溫后(避光)，測(cè)定其在215 nm處吸光值。

1.2.3.3 穩(wěn)定性研究

時(shí)間穩(wěn)定性研究：精確稱取1 mg烏鱉黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液于80 ℃恒溫溶解1 h，待溶液冷卻至室溫，分裝8管，每管3 mL，依次編號(hào)1～8，置于暗處保存。依次測(cè)定0、1、2、3、4、8、12、24 h后黑色素溶液在215 nm處吸光值。

光照穩(wěn)定性：精確稱取5 mg烏鱉黑色素樣品和5 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入125 mL的1 mol/L 氫氧化鈉溶液于80 ℃恒溫加熱1 h，待溶液冷卻至室溫，分裝37管，每管3 mL，依次編號(hào)對(duì)照0、紫外1～12、日光1～12、黑暗1～12，分別置于環(huán)境溫度相同的暗箱、30 W白熾燈箱、30 W紫外燈箱等設(shè)施中處理。1 h內(nèi)每隔10 min各取一管不同處理組樣品，在215 nm處檢測(cè)其吸光值。

溫度穩(wěn)定性：精確稱取2 mg烏鱉黑色素樣品和2 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，加入50 mL的1 mol/L 氫氧化鈉溶液于80 ℃水浴中恒溫加熱1 h，待溶液冷卻至室溫，分裝9管，每管3 mL，依次編號(hào)1～9，每三個(gè)管子為一組(1～3、4～6、7～9)分別置于25、60、100 ℃水浴中暗處理1 h，在0、30、60 min時(shí)各取一管不同處理組樣品，在215 nm處檢測(cè)其吸光值。

1.2.4 烏鱉黑色素的抗氧化性檢測(cè)

參考Wang等[9]方法，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品用二甲基亞砜充分溶解，總抗氧化檢測(cè)中樣品配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL的溶液；其他抗氧化檢測(cè)(DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力)中樣品配制成質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL的溶液。

1.2.4.1 總抗氧化能力的測(cè)定

參考Prieto等[11]的方法。在10 mL具塞比色管中分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(烏鱉黑色素溶液或黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液)、1 mL H2SO4溶液(3 mol/L)、1 mL Na3PO4溶液(0.028 mol/L)、1 mL (NH4)2MoO4溶液(4 mmol/L)、蒸餾水定容至5.0 mL，搖勻后95 ℃加熱30 min，溶液冷水浴冷卻至室溫，695 nm測(cè)定吸光度。以蒸餾水代替烏鱉黑色素溶液和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白參比。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

參照Chen等[12]的方法，略作修改。分別準(zhǔn)確吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液、3 mL DPPH(0.1 mmol/L，無(wú)水乙醇配制)、1 mL蒸餾水于10 mL具塞比色管中充分混勻，在室溫下反應(yīng)30 min；在517 nm處測(cè)定其吸光度。按照下面公式計(jì)算DPPH清除率。

DPPH清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：A0：對(duì)照液的吸光度；A1：加入樣品溶液后的吸光度；A2：為樣品溶液本底吸光度。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

參照Beauchamp等[13]的方法，略作修改。分別取0.05 mL樣品溶液、1.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.8，50 mmol/L)、0.3 mL甲硫氨酸(130 mmol/L)、0.3 mL氮藍(lán)四唑(750 μmol/L)、0.3 mL乙二胺四乙酸二鈉(100 μmol/L)、0.3 mL核黃素(20 μmol/L)和0.25 mL蒸餾水等溶液加入到10 mL具塞比色管中并充分混勻，混勻后置暗處，于560 nm處測(cè)定其吸光度。按照下面公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

超氧陰離子自由基清除率=[A0- (A1-A2)]/

A0×100%

式中：A0：空白對(duì)照液的吸光度；A1：加入樣品溶液后的吸光度；A2：為樣品溶液本底吸光度。

1.2.4.4 羥自由基清除能力的測(cè)定

參考Liu文獻(xiàn)[17]的方法,略作改進(jìn)。試管中依次加入1 mL PBS緩沖液(pH 7.4，0.4 mol/L)、1 mL鄰菲羅啉溶液(2.5 mmol/L)、1 mL樣品溶液、1 mL硫酸亞鐵溶液(2.5 mmol/L)、0.5 mL H2O2溶液(20 mmol/L)，應(yīng)在37 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1 h后，快速記錄536 nm處的吸光度。按照以下公式計(jì)算羥自由基清除率：

羥自由基清除率=[A0- (A1-A2)] /A0×100%

式中：A0：空白對(duì)照液的吸光度；A1：加入樣品溶液后的吸光度；A2：為樣品溶液本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱉黑色素的結(jié)構(gòu)特性

2.1.1 紫外可見(jiàn)光掃描圖譜

烏鱉黑色素的紫外可見(jiàn)光譜圖如圖1所示，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在掃描范圍內(nèi)(190～800 nm)出現(xiàn)了一致的吸收變化規(guī)律，兩種黑色素在紫外區(qū)域都有強(qiáng)烈的吸收，其中在215 nm處有最強(qiáng)特征吸收峰，伴隨波長(zhǎng)的逐漸增加，吸光度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這與已報(bào)道的不同來(lái)源動(dòng)物黑色素的特征吸收峰在210 nm左右一致，如魷魚(yú)黑色素在201 nm處有特征吸收峰[15]，大鯢皮膚黑色素紫外最大吸收波長(zhǎng)為214 nm[8]，螞蟻黑色素在214 nm處有特征吸收峰[18]。

2.1.2 傅里葉紅外掃描圖譜

圖2是黑色素的傅里葉紅外光譜圖，從兩種黑色素共同的吸收峰來(lái)看，在3 400 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，是由O-H和吲哚的N-H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，是黑色素的一個(gè)特征吸收峰[16]；2 930 ～ 2 850 cm-1處附近存在相對(duì)較弱的吸收峰，推測(cè)為烷烴結(jié)構(gòu)的C-H吸收區(qū)[8,9]；在1 600 cm-1處附近由因芳香環(huán)骨架振動(dòng)引起的較強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明結(jié)構(gòu)中吲哚環(huán)占比較大，屬于黑色素典型的苯醌類結(jié)構(gòu)[16]；烏鱉黑色素在1 528 cm-1附近的吸收峰和標(biāo)準(zhǔn)品在1 380 cm-1附近的吸收峰由因吸收COO-的變形振動(dòng)或C=C/C=N變形振動(dòng)歸屬于苯并噻嗪環(huán)[16]。說(shuō)明烏鱉黑色素具有非常典型的吲哚結(jié)構(gòu)，與動(dòng)物源黑色素多屬吲哚型的觀點(diǎn)相符。

2.1.3 元素分析

Ito等[19]研究表明，合成的真黑色素和棕黑色素的S∶N分別為0.01和0.46、C∶N分別為7.76和5.75、O∶N分別為3.29和2.81。由表1可知，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)品的S∶N為 0.05和0.02，這表明烏鱉黑色素主要含有真黑色素；烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)品的C∶N為10.45和8.11，明顯高于合成真黑色素和棕黑色素的C∶N，這說(shuō)明烏鱉黑色素含有脂肪族；烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)品的O∶N分別4.09和3.61，說(shuō)明烏鱉黑色素中-COOH含量更高。這與已報(bào)道的泰和烏骨雞[16]、林蛙卵[20]等來(lái)源的黑色素的元素組成相似。

2.2 烏鱉黑色素的理化性質(zhì)

2.2.1 烏鱉黑色素外觀顏色檢測(cè)結(jié)果

色差計(jì)測(cè)定中L*表示亮度，a*表示紅/綠，b*表示黃/藍(lán)。由表2可知，烏鱉黑色素L*值較大，而a*值和b*較小，這表明烏鱉黑色素是趨近于黑色并略帶黃色的固體粉末；黑色素標(biāo)準(zhǔn)品L*值較小，并且a*值和b*趨近于0，這表明黑色素標(biāo)準(zhǔn)品是趨近于黑色的固體粉末。

表1 黑色素元素組成分析

表2 烏鱉黑色素的外觀顏色

2.2.2 烏鱉黑色素溶解性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 溶劑選擇

由表3可知，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮等常見(jiàn)的有機(jī)溶劑是不溶的，而且在無(wú)機(jī)溶劑以及水中也是不溶的。但在二甲基亞砜中微溶，在氫氧化鈉溶液中易溶解。烏鱉黑色素的溶解性與報(bào)道的烏骨雞[16]、黑螞蟻[18]、林蛙卵[20]中黑色素的溶解性十分相似。

2.2.2.2 溶解溫度

溶解溫度對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，黑色素的吸光度增加，即黑色素的溶解量增加。到達(dá)80 ℃時(shí)，黑色素的吸光度最大，之后隨著溫度的升高，黑色素的吸光度減小。100 ℃黑色素的吸光度減小可能是由于過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)的溶出，影響黑色素的溶解。

2.2.2.3 溶劑濃度

溶劑濃度對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著氫氧化鈉溶液濃度的增加，黑色素吸光度不斷增大，當(dāng)氫氧化鈉濃度增大至1.0 mol/L時(shí)吸光度達(dá)到最大值，此時(shí)黑色素的溶解量最大，此后黑色素的吸光度隨著氫氧化鈉濃度的增大而減小。黑色素溶解性隨著氫氧化鈉濃度增大先升高后降低可能是因?yàn)闈舛冗^(guò)高時(shí)造成殘留的雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)溶出，影響黑色素的溶解。

圖5 NaOH濃度對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響Fig.4 The effect of concentration of NaOH on the solubility of melanin from Chinese soft-shelled turtle

圖5 料液比對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the solubility of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.2.2.4 料液比

料液比對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著料液比的增加，黑色素的吸光值先升高后降低，當(dāng)料液比在1∶20(mg∶mL)時(shí)吸光度達(dá)到最大值，此時(shí)黑色素的溶解量最大。這可能因?yàn)殡S著液料比的增加，內(nèi)外黑色素濃度差就增大，傳質(zhì)推動(dòng)力就增大，有利于黑色素溶解在堿溶液中，當(dāng)液料比過(guò)大時(shí)黑色素中其他堿溶性雜質(zhì)的溶出增加，致使黑色素被雜質(zhì)包裹，導(dǎo)致黑色素的溶解量減少。

2.2.2.5 溶解時(shí)間

溶解時(shí)間對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著溶解時(shí)間的增長(zhǎng)烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度先升高后降低，溶解時(shí)間為60 min時(shí)吸光度最大，此時(shí)黑色素的溶解量最大，之后隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，黑色素的溶解量趨于穩(wěn)定，略有點(diǎn)下降。

圖6 溶解時(shí)間對(duì)烏鱉黑色素溶解性的影響Fig.6 The effect of time on the solubility of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.2.3 烏鱉黑色素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3.1 時(shí)間穩(wěn)定性

時(shí)間對(duì)烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響如圖7所示，從圖7可以看出，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度變小，其中在黑色素溶液放置1 h后急劇下降，4 h后下降趨于平緩。黑色素溶液放置前1 h內(nèi)烏鱉黑色素僅損失4.44%、黑色素標(biāo)準(zhǔn)品損失8.91%，表明1 h內(nèi)烏鱉黑色素具有較好的穩(wěn)定性。

圖7 時(shí)間對(duì)烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 The effect of time on the stability of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.2.3.2 光穩(wěn)定性

光照對(duì)烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響如圖8所示，從圖8可以看出，烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在不同光照條件(黑暗、日光照射、紫外照射)下處理，黑色素溶液的吸光度相對(duì)變化無(wú)顯著差異，表明黑色素的光穩(wěn)定性較好。與泰和烏骨雞[21]黑色素的光穩(wěn)定性相似。黑色素是由吲哚類單元結(jié)構(gòu)不規(guī)則聚合而成，特殊的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其具有吸收紫外線的功能，良好的光穩(wěn)定性可能也與此有關(guān)。

圖8 光照對(duì)烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 The effect of illumination on the stability of melanin from Chinese soft-shelled turtle注：1、2、3分別為烏鱉黑色素暗處理、日光處理、紫外處理；4、5、6為黑色素標(biāo)準(zhǔn)品暗處理、日光處理、紫外處理。Note:1,2,3 were melanin of Chinese soft-shelled turtle in dark treatment,sunlight treatment and UV-treatment;4,5,6 were melanin standard in dark treatment,sunlight treatment and UV-treatment.

2.2.3.3 熱穩(wěn)定性

耐熱性是考察色素開(kāi)發(fā)利用潛能的一個(gè)重要指標(biāo)。溫度對(duì)烏鱉黑色素穩(wěn)定性的影響如圖9所示，從圖9可以看出，烏鱉黑色素溶液和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在25、60、100 ℃情況下保持1 h，隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，黑色素的保存率有所下降，但在60 ℃下加熱1 h，相對(duì)色素保存率達(dá)到85.0%以上；在100 ℃加熱1 h，相對(duì)色素保存率達(dá)到80.0%以上。這表明烏鱉黑色素較為耐熱，具有一定的熱穩(wěn)定性，這與Tu等[21]和Zou等[22]的研究結(jié)果相似。

2.3 烏鱉黑色素的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化能力

通過(guò)比較不同質(zhì)量濃度(0.01～0.2 mg/mL)的烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品與磷鉬酸反應(yīng)后的吸光度大小來(lái)評(píng)價(jià)其總抗氧化能力強(qiáng)弱。吸光度越大則說(shuō)明還原能力越強(qiáng)，抗氧化性也越強(qiáng)。圖10是烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的總抗氧化力測(cè)定結(jié)果，從圖10中可以看出隨著質(zhì)量濃度的增大，兩種黑色素的總抗氧化力也都增大，黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的總抗氧化能力高于烏鱉黑色素。烏鱉黑色素的總抗氧能力與黑螞蟻[18]、烏骨雞黑色素[14]相近。

圖10 烏鱉黑色素總抗氧化能力 Fig.10 Total antioxidant activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.3.2 DPPH 自由基清除能力

烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)DPPH的清除作用如圖11所示，從圖11可以看出，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.1～2.0 mg/mL)，兩種黑色素對(duì)DPPH均有一定的清除作用，隨著質(zhì)量濃度的增大，其清除能力也增大，其中黑色素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL后，對(duì)DPPH清除率趨于平緩；烏鱉黑色素質(zhì)量濃度在2 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率達(dá)到77.28%。烏鱉黑色素清除DPPH自由基能力與烏骨雞黑色素[14]、林蛙卵黑色素[20]、黑木耳黑色素[22]等相似。

圖11 烏鱉黑色素清除DPPH自由基能力 Fig.11 DPPH radical scavenging activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用如圖12所示，從圖12可以看出，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)(0.1～2.0 mg/mL)，烏鱉黑色素對(duì)超氧陰離子的清除率隨著濃度的提高而逐漸增大，當(dāng)濃度在2.0 mg/mL時(shí)，烏鱉黑色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為44.05%，該研究結(jié)果與大鯢皮膚黑色素[8]、林蛙卵黑色素[20]、烏骨雞黑色素[14,21]等對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相似。黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)超氧陰離子的清除率隨著濃度的提高而逐漸增大，在濃度在0.5mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子的清除率增大趨于平緩，這與Chen等[23]研究結(jié)果一直。這表明烏鱉黑色素具有一定的超氧陰離子清除能力，但低于陽(yáng)性對(duì)照黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的超氧陰離子清除能力。

圖12 烏鱉黑色素清除超氧陰離子自由基能力Fig.12 Superoxide radical scavenging activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

2.3.4 羥自由基清除能力

羥自由基通常產(chǎn)生于抽氫反應(yīng)和加成反應(yīng)過(guò)程中，其可輕易通過(guò)細(xì)胞膜，并與細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[23]。烏鱉黑色素和黑色素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)羥自由基的清除作用如圖13所示，從圖13可以看出，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)(0.1 ～ 2.0 mg/mL)對(duì)羥自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，其中黑色素標(biāo)準(zhǔn)品在0.5 mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基清除率趨于平緩；烏鱉黑色素質(zhì)量濃度在2 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到48.44%，這表明烏鱉黑色素對(duì)羥自由基的清除能力低于陽(yáng)性對(duì)照組黑色素標(biāo)準(zhǔn)品的清除能力，烏鱉黑色素的羥自由基清除能力與大鯢皮膚黑色素[8]、林蛙卵黑色素[20]、烏骨雞黑色素[14,21]等黑色素的清除能力相似。

圖13 烏鱉黑色素清除羥自由基能力 Fig.13 Hydroxide free radical scavenging activity of melanin from Chinese soft-shelled turtle

3 結(jié)論

動(dòng)物中黑色素與蛋白質(zhì)的緊密相連、不易分離，要獲得比較純凈的黑色素，就必須盡可能去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。因此，本研究采用“脫脂-酶解-酸解”三步法精制烏鱉黑色素，減少多余雜質(zhì)對(duì)烏鱉黑色素結(jié)構(gòu)分析、理化性質(zhì)和抗氧化活性的影響。通過(guò)烏鱉黑色素紫外可見(jiàn)光掃描圖譜(215 nm處有特征吸收峰)、傅里葉紅外掃描圖譜(3 400 cm-1和1 600 cm-1處附近有較強(qiáng)的吸收峰，是以吲哚結(jié)構(gòu)為主體)和元素組成分析(S∶N為 0.05，以真黑色素為主)等結(jié)構(gòu)特性顯示均具有非常典型黑色素典型特征，結(jié)構(gòu)完整。這些結(jié)果表明，本試驗(yàn)獲得的烏鱉黑色素純度高、結(jié)構(gòu)完整，可完全滿足烏鱉黑色素的理化性質(zhì)和抗氧化活性等方面的研究。

烏鱉黑色素具有黑色素典型的性質(zhì)：色差計(jì)測(cè)得黑色素粉末呈黑色，略帶黃色；不溶于水、酸液和一般的有機(jī)溶劑，微溶于二甲基亞砜，溶于堿性溶液；烏鱉黑色素在一定時(shí)間段內(nèi)(1 h)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，長(zhǎng)時(shí)間存放可引起黑色素活性損失。另外，烏鱉黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，隨溶解液質(zhì)量濃度的增加而增大。其中，質(zhì)量濃度在2.0 mg/mL時(shí)，烏鱉黑色素溶液總抗氧化能力在77%左右，羥自由基清除率和DPPH自由基清除率均在40%以上，說(shuō)明烏鱉黑色素具有一定的抗氧化作用。該研究結(jié)果有利于黑色素的有效提取利用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等研究提供可靠的科學(xué)依據(jù)，從而對(duì)大幅增加烏鱉的藥用資源的附加值，發(fā)掘我國(guó)的優(yōu)秀物種資源，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。