基于GC-MS的荊芥和荊芥穗飲片揮發(fā)油中化學成分特征分析

程夢娟，耿曉桐，龔海燕*，謝彩俠*，張 娟，陳志紅，杜 宇，雷敬衛(wèi)

1河南中醫(yī)藥大學；2河南省中藥質量控制與評價工程技術研究中心，鄭州 450046；3信陽農林學院，信陽 464000

荊芥為唇形科一年生草本植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分，荊芥穗為唇形科植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥花穗[1]。荊芥及荊芥穗主產于江蘇、河北、江西、湖南、湖北等地[1,2]。荊芥與荊芥穗味辛，性微溫，歸肺、肝經，為臨床常用的發(fā)汗解表藥。2015版《中國藥典》中以揮發(fā)油含量作為評價荊芥和荊芥穗兩種飲片質量的一個指標，規(guī)定荊芥飲片中揮發(fā)油含量不得低于0.003 0 mL/g，荊芥穗飲片中揮發(fā)油含量不得低于0.004 0 mL/g[1]。揮發(fā)油含量的高低直接影響著荊芥與荊芥穗飲片質量優(yōu)劣及其藥理藥效，但由于荊芥產地較多、種質資源豐富，市場上荊芥、荊芥穗質量差異較大[2,3]，影響臨床用藥的安全性與有效性。

荊芥與荊芥穗作為臨床常用解表藥，2015版《中國藥典》對其功能主治記載皆為：“解表散風，透疹，消瘡。用于感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡瘍初起。”經查閱現有資料得知荊芥穗芳香氣烈，質輕，效用較荊芥強，生用荊芥穗取輕宣升散之性，以解表祛風，多見于治療產后感冒、早產或難產的方劑中[4,5]。荊芥與荊芥穗的臨床使用藥理藥效差異與其揮發(fā)油總含量及種類密切相關，目前關于荊芥與荊芥穗的研究主要側重于種質資源、揮發(fā)油含量及提取方法、藥理藥效等[2,3,6,7]，而關于荊芥與荊芥穗揮發(fā)油成分種類及含量差異還未見報道。本研究利用GC-MS法分析不同來源荊芥和荊芥穗飲片中揮發(fā)油含量與成分特征，為建立能客觀反映荊芥、荊芥穗藥材質量的評價體系奠定基礎，為荊芥和荊芥穗的臨床使用提供科學的理論依據。

1 實驗材料

1.1 荊芥及荊芥穗飲片

實驗樣品購自國內中藥飲片公司(見表1)，經河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授鑒定為唇形科植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分與干燥花蕾。將荊芥和荊芥穗分別粉碎，過一號篩[8-10](10目)，編號，裝袋，置干燥器內待用。

表1 荊芥與荊芥穗樣品來源及批號

1.2 儀器

1號藥典篩(浙江上虞市五四儀器篩具廠)；YF-111B高速中藥粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司)；SZ-93型Milli-Q Reference純水機(上海亞榮生化儀器廠)；ME204E型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；揮發(fā)油提取器(德陽市喬生玻璃制品有限公司)；101-3AB型電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；0410462型加熱套1(鞏義市英峪予儀器廠)；04061005型加熱套2(鞏義市英峪予儀器廠)；7000-7890A型Agilent氣-質聯用儀(美國 Agilent公司)；0.22 μm微孔濾膜(天津津騰實驗設備有限公司)。

1.3 試劑

正己烷(色譜純，默克股份兩合公司)；無水硫酸鈉(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)；蒸餾水(上海亞榮生化儀器廠)；人造沸石(天津市致遠化學試劑有限公司)。

2 實驗方法

2.1 GC-MS條件

依據相關文獻[3,11]，根據預實驗色譜圖出峰結果對分流比、程序升溫等條件進行調整，最終確定色譜條件。色譜柱：DB-5MS(30 m× 0.25 mm，0.10 μm)；進樣口溫度：200 ℃；分流比：50∶1；進樣量：1 μL；溶劑延遲3 min；程序升溫，柱溫60 ℃，保持8 min，以3 ℃/min升至110 ℃，保持7 min，再以10 ℃·min-1升至220 ℃，保持3 min。

質譜：接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；質量范圍m/z：45～550；質譜檢索庫：NIST11。

2.2 供試品溶液制備

稱取約50.0 g荊芥(荊芥穗)粉末，精密稱定，加入至1 L圓底燒瓶中，加入7倍量蒸餾水(350 mL)，沸石3粒，浸泡0.5 h，提取2.0 h，停止加熱后冷卻，取所得揮發(fā)油加入適量正己烷稀釋，加入適量無水硫酸鈉干燥，至再加入無水硫酸鈉粉末呈疏松狀，靜置10 min，過濾，正己烷定容至5 mL容量瓶，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得樣品[8-10]。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗

取S7樣品，按照“2.2”項下制備供試品溶液，按照“2.1”項下的GC-MS條件連續(xù)進樣6次，記錄胡薄荷酮的保留時間和相對峰面積，計算保留時間RSD及相對峰面積RSD，結果表明，其保留時間RSD為0.025%，相對峰面積RSD為0.68%，符合檢測要求，儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取S7樣品，按照“2.2”項下制備供試品溶液，在制備后0、2、4、6、8、12 h按照“2.1”項下的GC-MS條件分別進樣，記錄胡薄荷酮的保留時間和相對峰面積。計算保留時間RSD及相對峰面積RSD，結果表明，其保留時間RSD為0.032%，相對峰面積RSD為1.36%，符合檢測要求，樣品溶液穩(wěn)定性較好。

2.3.3 重復性試驗

取S7樣品，按照“2.2”項下制備6份供試品溶液，然后按照“2.1”項下的GC-MS條件分別進樣，記錄計算保留時間RSD及相對峰面積RSD，結果表明，其保留時間RSD為0.015%，相對峰面積RSD為3.59%，符合檢測要求，表明該測定方法具有較好的重復性。

2.4 揮發(fā)油含量及各成分相對含量計算方法

按照“2.2”項下條件分別提取10批次荊芥和10批次荊芥穗飲片的揮發(fā)油，計算揮發(fā)油得率(V/M)，每個樣品重復3次，取平均值并計算揮發(fā)油含量。按照“2.1”色譜條件進樣，以樣品共有總峰面積為1，各成分峰面積與總峰面積比值為各成分相對含量，每個樣品重復3次，取平均值。

2.5 數據統(tǒng)計分析

用面積歸一化法計算荊芥及荊芥穗飲片揮發(fā)油成分的總離子流圖中各組分的相對含量，各成分的質譜圖通過質譜譜庫檢索、人工圖譜解析、文獻核對等多種方法進行綜合分析鑒定。利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件以峰面積比大0.001為標準對峰進行過濾，以色譜峰谷間連線為基線對峰進行積分，根據保留時間將峰進行對齊，采用歸一化處理數據。利用SIMCA14.1統(tǒng)計軟件對歸一化后的數據進行多元統(tǒng)計分析，首先，進行PCA與HCA分析確定荊芥和荊芥穗揮發(fā)油成分特征是否存在差異；其次，利用Pareto標度化預處理對其進行OPLS-DA分析，進一步分析模式間的化學成分差異，并輸出得分圖和置換檢驗圖；最后，對VIP>1的成分進行t檢驗計算P值，篩選VIP>1且P<0.05的成分為差異代謝物。

3 結果與分析

3.1 荊芥及荊芥穗揮發(fā)油總含量測定結果

荊芥與荊芥穗飲片揮發(fā)油含量測定結果(見圖1)表明，10批荊芥揮發(fā)油含量在0.002 0～0.006 5 mL/g之間，平均含量為0.003 5 mL/g，10批荊芥穗總揮發(fā)油含量在0.005 0～0.015 5 mL/g之間，平均含量為0.011 6 mL/g。10批荊芥中來自江蘇的生產批號為180615的荊芥揮發(fā)油總含量最高，為0.006 5 mL/g，其中來自河南、安徽、河北，生產批號分別為180301QF、180601、316190201的三批荊芥飲片中總揮發(fā)油成分均含量低于2015版《中國藥典》規(guī)定標準[1]。10批荊芥穗中揮發(fā)油總含量均達到藥典標準，其中來自河北、生產批號為318181201的荊芥穗揮發(fā)油總含量高達0.015 5 mL/g，而同樣來自河北、生產批號為20170804的荊芥穗在10批荊芥穗中揮發(fā)油總含量最低，為0.005 0 mL/g。利用Excel對荊芥與荊芥穗揮發(fā)油含量進行t檢驗，P<0.01，表明荊芥與荊芥穗揮發(fā)油總含量差異在統(tǒng)計學上達到極顯著水平，荊芥穗揮發(fā)油含量整體高于荊芥。

圖1 荊芥、荊芥穗飲片揮發(fā)油含量Fig.1 Volatile oil content of Schizonepetae Herba and Schizonepetae Spica samples

3.2 荊芥及荊芥穗飲片揮發(fā)油成分鑒定及含量分析

利用“2.1”和“2.2”項下的方法分別對10批荊芥和10批荊芥穗揮發(fā)油成分進行GC-MS分析，記錄其揮發(fā)油總離子流色譜圖(見圖2)。總離子流圖經NIST11系統(tǒng)檢索結合文獻報導[3,11-13]得10批荊芥共有成分及10批荊芥穗共有成分(見表2、表3)。按照揮發(fā)油的構成可將其分為萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合等。由表可知10批荊芥飲片的揮發(fā)油共鑒定27種成分，其中萜類化合物21種，平均相對含量占99.2%，脂肪族化合物5種、芳香族化合物1種；10批荊芥穗飲片的揮發(fā)油共鑒定24種成分，其中萜類化合物20種，平均相對含量為99.5%，脂肪族化合物4種、芳香族化合物1種。荊芥與荊芥穗飲片的揮發(fā)油中具有各自的特有成分，其中荊芥飲片的特有成分為脂肪族類化合物1-辛烯-3-酮、環(huán)己酮，萜類化合物左薄荷腦、薄荷醇、L-α-松油醇、葎草烯，而荊芥穗飲片的特有成分為脂肪族化合物水楊酸己酯，萜類化合物(1S)-香芹醇、瓜菊醇酮。

荊芥與荊芥穗飲片揮發(fā)油的共有成分為21種，分別為脂肪族化合物1-辛烯-3-醇、3-辛酮、乙酸辛烯酯，芳香族化合物4-異丙烯基甲苯，其余均為萜類化合物，主要有薄荷酮、胡薄荷酮、檸檬烯等。為了探討兩種飲片揮發(fā)油中共有成分的分布特征，我們對兩種飲片共有成分中相對含量大于1%的胡薄荷酮、薄荷酮、異胡薄荷酮、檸檬烯、馬鞭草烯酮、香芹酮、順-p-2,8-薄荷二烯酮7個成分進行分析(見圖3)。分析發(fā)現兩種飲片揮發(fā)油成分中的胡薄荷酮與薄荷酮含量較高，雖然不同來源相同飲片中兩種成分的含量差異較大，但各樣本中胡薄荷酮與薄荷酮相對含量之和比較穩(wěn)定，除S4外均高于80%；兩種飲片揮發(fā)油中胡薄荷酮與薄荷酮兩種成分的含量整體上存在差異，其中荊芥飲片揮發(fā)油中胡薄荷酮相對含量整體低于荊芥穗，而薄荷酮的相對含量則明顯高于荊芥穗。此外，荊芥飲片中異胡薄荷酮的相對含量明顯高于荊芥穗，而檸檬烯相對含量則明顯低于荊芥穗。

圖2 荊芥J9(A)與荊芥穗樣品S7(B)的總離子流圖Fig.2 Total ion current diagram of Schizonepetae Herba J9 samples (A) and Schizonepetae Spica S7 samples (B)

表2 10批荊芥飲片揮發(fā)油共有成分

表3 荊芥穗飲片揮發(fā)油共有成分

續(xù)表3

圖3 荊芥、荊芥穗主要共有成分含量Fig.3 The content of main components of Schizonepetae Herba and Schizonepetae Spica

3.3 荊芥及荊芥穗揮發(fā)油化學成分特征分析

3.3.1 荊芥及荊芥穗揮發(fā)油化學成分的PCA及HCA分析

為了分析荊芥和荊芥穗揮發(fā)油化學成分特征的差異，我們以荊芥和荊芥穗所含揮發(fā)油共有成分種類和相對含量為對象，利用SIMCA14.1對荊芥和荊芥穗飲片揮發(fā)油成分特征進行PCA-X和HCA分析(見圖4)，由PCA得分結果可知，10批荊芥和10批荊芥穗飲片揮發(fā)油成分特征存在差異，各自聚為一類，荊芥樣本分布比較集中，而荊芥穗各樣本間差異較大，但均未表現出來源差異。HCA分析是基于ward算法的一種判別分析法，橫坐標為樣品編號、縱坐標為樣品點間距離，HCA結果顯示樣品距離在120時荊芥和荊芥穗飲片各自聚為一類。

圖4 荊芥、荊芥穗飲片揮發(fā)油共有成分PCA得分圖(A)和HCA分析圖(B)Fig.4 PCA score chart (A) and HCA analysis chart (B) of the volatile oil common constituents of Schizonepetae Herba and Schizonepetae Spica

PCA與HCA分析結果的一致性表明荊芥與荊芥穗揮發(fā)油化學成分特征存在差異，而且相同飲片不同批次之間也存在一定的差異。為了探討兩種飲片各批次樣本揮發(fā)油成分特征相似性的程度，我們利用指紋圖譜相似度評價軟件，分別以表2、表3中共有成分進行多點校正，得到兩味飲片的對照圖譜，如圖5，計算10批荊芥和10批荊芥穗飲片中揮發(fā)油總離子流色譜圖間的相似度。結果表明，10批荊芥飲片與對照圖譜相似度均大于0.900，除J6、J9外，其余樣品相似度均大于0.990；10批荊芥穗飲片與對照圖譜相似度均大于0.930，除S1、S4外，其余樣品的相似度均大于0.990，與PCA、HCA結果基本一致。

3.3.2 荊芥與荊芥穗飲片揮發(fā)油化學成分的OPLS-DA分析及差異成分篩選

為排除相同飲片不同批號間樣本差異對兩種飲片揮發(fā)油成分特征的干擾，我們對荊芥和荊芥穗兩種飲片的GC-MS成分特征進行OPLS-DA分析(見圖6)，以確定兩種飲片質量差異的可靠性。由得分圖可知，兩種飲片差異明顯，各自分布在兩個不同的象限。為避免建立的OPLS-DA模型出現過度擬合而影響分析結果的準確性，我們利用200次Permutations test分別進行置換檢驗，結果顯示置換后的R2、Q2值均高于原始的R2、Q2值，表明所建模型可靠，未出現過度擬合現象。

荊芥與荊芥穗的PCA、HCA、OPLS-DA分析結果一致表明荊芥與荊芥穗飲片的揮發(fā)油化學成分存在顯著差異，為了確定引起兩種飲片差異的主要化學成分，我們利用所建立的OPLS-DA模型篩選荊芥與荊芥穗中揮發(fā)油化學成分VIP(variable importance in projection)>1的成分(見圖7)，并進行t-test計算其P值，篩選VIP>1且P<0.05的物質為潛在的差異成分(見表4)。分析及篩選結果表明，荊芥與荊芥穗飲片揮發(fā)油化學成分中存在10個VIP>1且P<0.05的成分，其中荊芥中薄荷酮、異胡薄荷酮、β-石竹烯、1-辛烯-3醇含量顯著高于荊芥穗，而荊芥中的檸檬烯、β-蒎烯、胡薄荷酮、香芹醇、順-p-2，8-薄荷二烯醇、4-異丙烯基甲苯的含量較荊芥穗低。

4 討論

荊芥與荊芥穗飲片是荊芥植株不同部位加工后的產物，由于荊芥是多年生植物，在全國分布較廣，因此兩種飲片中揮發(fā)油的種類及含量受多種因素的影響。Cao等[14]對3個荊芥品系與2個對照進行比較試驗發(fā)現種質資源對荊芥穗與荊芥飲片中總揮發(fā)油含量及成分具有決定作用；另外，荊芥的生長環(huán)境[3,15,16]及采收期[17]等也對荊芥及荊芥穗中揮發(fā)油含量及成分產生一定影響，而且不同采收期的荊芥中莖、葉、穗比例存在差異[7]，而荊芥中各部位揮發(fā)油成分含量為穗>葉>莖[8,11]。為了比較荊芥和荊芥穗兩種飲片揮發(fā)油成分質量特征的差異，本研究以不同來源的兩種飲片為研究對象，依據2015版《中國藥典》中揮發(fā)油照測定法(通則2204)，結合文獻對浸泡方式、加水量、提取時間及粉碎程度等參數進行優(yōu)化，確定了荊芥和荊芥穗飲片中揮發(fā)油提取的最佳工藝。通過對兩種飲片中總揮發(fā)油含量及成分分析發(fā)現，荊芥和荊芥穗兩種飲片揮發(fā)油成分特征存在差異。為了分析引起荊芥和荊芥穗飲片揮發(fā)油總量差異的原因，我們觀察比較了兩種飲片及不同批次飲片的外觀形狀，發(fā)現市場上的荊芥飲片約90%為荊芥的莖，而荊芥穗則基本上90%為荊芥的穗，而荊芥穗中種子較多。而且，我們在處理樣品過程中也發(fā)現，不同產地和批次的荊芥與荊芥穗飲片的顏色也存在一定的差異，胡薄荷酮相對含量最低的J3荊芥飲片顏色與另外9個樣品有較大差異，J3粉末顏色偏綠，其余9種偏棕褐色；揮發(fā)油含量明顯偏低的S2荊芥穗飲片顏色明顯比其它幾個褐色的荊芥穗淺，而荊芥中葉片與莖的組成比例及飲片的顏色取決于荊芥品種、采收期及加工方法等多種因素，因此，荊芥和荊芥穗飲片質量的差異性及不穩(wěn)定性和藥材的采收、品種、產地環(huán)境、加工方法、儲藏環(huán)境等多種因素有關，而這種差異的多樣性和不可控性可能影響荊芥和荊芥穗飲片質量的穩(wěn)定性和臨床療效。因此，對于荊芥這類影響其質量因素較多的中藥，應以“藥材來源-化學質量-藥學性質-臨床療效”相結合的一致性評價方法，建立其藥材產地溯源的鑒別體系，進而為臨床合理使用荊芥及荊芥穗飲片提供依據。另外，為了保證荊芥及荊芥穗飲片質量的穩(wěn)定性，我們可通過轉錄組學、代謝組學等技術進一步研究相關因子對荊芥及荊芥穗揮發(fā)油成分的影響機理，為荊芥優(yōu)良種質選擇、飲片質量控制及藥效成分的合成生物學提供依據。

圖5 荊芥、荊芥穗揮發(fā)油GC-MS疊加指紋圖譜及共有模式參照圖譜Fig.5 The GC-MS superimposed fingerprints and reference fingerprints of Schizonepetae Herba volatile oil and Schizonepetae Spica volatile oil注：A、B為荊芥揮發(fā)油疊加指紋圖譜及對照圖譜；C、D為10批荊芥穗揮發(fā)油指紋圖譜及對照圖譜。Note:A and B are the superimposed fingerprints and reference fingerprints of Schizonepetae Herba volatile oil;C and D are the superimposed fingerprints and reference fingerprints of Schizonepetae Spica volatile oil.

圖6 荊芥與荊芥穗飲片揮發(fā)油成分的OPLS-DA得分圖(A)和置換檢驗圖(B)Fig.6 OPLS-DA score map (A) and displacement test chart (B) of the essential oil components of Schizonepetae Herba and Schizonepetae Spica

圖7 荊芥與荊芥穗飲片中共有化學成分VIP值Fig.7 VIP of chemical constituents in Schizonepetae Herba and Schizonepetae Spica注：橫坐標為各成分色譜峰保留時間。Note:The abscissa is the retention time of each component chromatographic peak.

表4 荊芥與荊芥穗飲片揮發(fā)油差異成分篩選與比較

藥效成分是決定中藥產生臨床功效的物質基礎，荊芥與荊芥穗同為發(fā)汗解表藥，二者均為多種復方中藥的組成藥物，但荊芥穗較荊芥發(fā)散力強，祛風解表之功更甚，為了進一步探討引起兩種飲片臨床療效差異的藥效物質特征，本研究利用GC-MS對不同批次的荊芥及荊芥穗飲片中揮發(fā)油成分特征進行分析，發(fā)現雖然兩種飲片揮發(fā)油中含有許多相同的化學成分，但共有成分的含量特征卻存在明顯差異，OPLS-DA分析從兩種飲片揮發(fā)油共有成分進行篩選到10個差異成分，其中8個成分的差異達極顯著水平，這些成分涉及到薄荷酮、胡薄荷酮及檸檬烯等，其中胡薄荷酮是《中國藥典》2015年版中控制荊芥和荊芥穗飲片質量的評價指標。本研究結果表明荊芥穗中胡薄荷酮和薄荷酮含量占總揮發(fā)油量的80%～90%，荊芥中胡薄荷酮和薄荷酮含量占總揮發(fā)油量的83%～90%，雖然荊芥和荊芥穗胡薄荷酮和薄荷酮的相對總含量差異不大，但是兩種飲片中胡薄荷酮與薄荷酮的比例差異較大，荊芥穗飲片中胡薄荷酮平均約占75%，薄荷酮約占10%，比例約為7.5∶1，荊芥中胡薄荷酮約占55%，薄荷酮約占32%，比例約為5∶3，因此，從胡薄荷酮和薄荷酮兩種成分的相對比例來看，荊芥穗飲片更偏向于胡薄荷酮型。萜類成分作為為荊芥揮發(fā)油中最主要的化學成分，是抗炎、抗病毒等重要藥理活性的物質基礎，文獻研究發(fā)現胡薄荷酮型薄荷揮發(fā)油炎癥抑制活性高于薄荷酮型薄荷揮發(fā)油[18]，也有研究表明胡薄荷酮具有高炎癥抑制活性的同時毒性也有所增加[19,20]。此外，檸檬烯在荊芥與荊芥穗中相對含量差異極其顯著，有研究顯示檸檬烯對大鼠酒精性肝損傷具有拮抗作用[21]，因此，荊芥穗與荊芥飲片臨床功效差異可能與這些成分的分布特征有關。另外，關于荊芥和荊芥穗兩種飲片揮發(fā)油中各自特有成分與相應飲片臨床功效的相關性也未見報道。

由于荊芥產地較多，本研究僅收集到部分產地的荊芥和荊芥穗飲片，而且對于飲片的藥材來源、產地環(huán)境及采收期并不清楚，研究結果也僅能說明兩種飲片揮發(fā)油成分的初步特征及差異，后期還需要收集足夠多代表性的飲片，通過對大量樣本揮發(fā)油成分特征的統(tǒng)計分析，科學準確闡釋荊芥與荊芥穗兩種飲片揮發(fā)油成分的特異性及及其與臨床療效的關系，為建立兩種飲片科學的質量控制評價體系及臨床合理用藥提供依據。