CBX家族成員作為獨(dú)立指標(biāo)對肺癌患者生存預(yù)后的評估價(jià)值

白玉潔 喻 晶 陳海丹 李冬青

(1. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系 微生物教研室， 湖北 武漢 430071； 2. 湖北省腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 湖北 武漢 430065； 3. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 脊柱外科， 湖北 宜昌 443003)

肺癌是最兇險(xiǎn)的腫瘤之一，5年生存率約為10%～20%[1,2]遠(yuǎn)低于其他類型的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增肺癌患者210萬例，死亡180萬人[3]。雖然目前已有成熟的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、糖類抗原(carbohydrate antigen 125，CA125)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)、胃泌素前體釋放肽片段(pro-gastrin-releasing peptide，Pro-GRP)、細(xì)胞角蛋白 19 片段(CYFRA21-1)等用于腫瘤的篩查及治療效果評價(jià)，但肺癌臨床分型多，分子特征復(fù)雜，現(xiàn)有的肺癌腫瘤標(biāo)志物對各型肺癌患者總生存率(overall survival，OS)的評價(jià)能力尚有不足。

Chromobox家族蛋白(CBX)是一類表觀遺傳調(diào)控復(fù)合物，它通過修飾染色質(zhì)對目標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制[4]。已知人類基因組中有8種CBX蛋白，都參與異染色質(zhì)的調(diào)控、基因表達(dá)和發(fā)育程序。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，CBX蛋白被分為兩類：HP1組(包括CBX1、CBX3和CBX5)和Pc組(包括CBX2、CBX4、CBX6、CBX7和CBX8)。CBX成員的表達(dá)水平與肺癌患者OS顯著相關(guān)，但不同家族成員之間并沒有一致性。因此，本研究擬通過生物信息學(xué)的手段，對已有的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行深入地發(fā)掘和歸納，以助于明確CBX蛋白對肺癌預(yù)后評估的意義。

1 材料和方法

1.1 利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析CBX的mRNA表達(dá)水平

ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/main.html)收錄了 715個(gè)數(shù)據(jù)集和86 733個(gè)樣本的芯片數(shù)據(jù)，用于DNA或RNA序列分析，功能十分強(qiáng)大[5]。本研究從該數(shù)據(jù)庫中獲得了8個(gè)CBX成員在不同腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)類型：mRNA)。用t檢驗(yàn)比較腫瘤組織及其相鄰正常對照組之間轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異。以P值為0.01，差異倍數(shù)為1.5，基因排名前10%為閾值。

1.2 利用UALCAN分析肺腺癌組織中8個(gè)CBX家族成員的mRNA表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)是一個(gè)用于分析腫瘤組學(xué)數(shù)據(jù)的web資源。它提供基于基因表達(dá)的潛在基因圖譜，以方便用戶獲取基因表達(dá)的信息[6]。本研究利用UALCAN分析了肺腺癌組織中8個(gè)CBX家族成員的mRNA表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，P<0.01為顯著差異。

1.3 利用Human Protein Atlas分析人正常組織和肺腺癌組織中CBX的表達(dá)

Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/)包含了近20種常見腫瘤的免疫組化數(shù)據(jù)[7]。用戶可以獲取目標(biāo)蛋白在特定腫瘤類型中的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)。本研究利用了該網(wǎng)站的免疫組化圖像數(shù)據(jù)，比較了不同CBX家族成員在人正常組織和肺腺癌組織中的表達(dá)情況。

1.4 利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析不同CBX基因mRNA表達(dá)對肺腺癌預(yù)后的價(jià)值

Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)能夠評估54 000 個(gè)基因(mRNA、miRNA、蛋白質(zhì))對21種腫瘤生存率的影響，包括乳腺癌(6 234例)、卵巢癌(2 190例)、肺癌(3 452例)和胃癌(1 440例)。數(shù)據(jù)來源包括GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫。該工具基于薈萃分析，可發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證生存生物標(biāo)志物(survival biomarkers)[8]。本研究應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter分析不同CBX基因mRNA表達(dá)對肺腺癌預(yù)后的價(jià)值。在Kaplan-Meier繪圖儀(K-M繪圖儀)上，根據(jù)mRNA水平的中位數(shù)將腫瘤患者分為CBX高表達(dá)組和CBX低表達(dá)組，并用K-M生存曲線進(jìn)行驗(yàn)證。在K-M繪圖儀網(wǎng)頁上可以找到有關(guān)危險(xiǎn)病例數(shù)、mRNA表達(dá)水平中位數(shù)、風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)、95%置信區(qū)間(confidence interval，95%CI)和P值等信息，當(dāng)P<0.05時(shí)，則視為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 多種腫瘤的腫瘤組織和正常組織的CBX mRNA表達(dá)有顯著差異

ONCOMINE數(shù)據(jù)庫資料顯示，在20種腫瘤中，CBX家族成員mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)與正常組織有差異。其中，肺癌尤其是肺腺癌這一類型組織的CBX1、CBX3、CBX4和CBX5的mRNA表達(dá)顯著高于正常組織(見圖1和表1)，而肺癌組織CBX7的mRNA表達(dá)顯著低于正常組織 (見圖1)。

2.2 CBX家族各個(gè)成員在原發(fā)性肺腺癌組織中mRNA表達(dá)水平不同

UALCAN數(shù)據(jù)庫資料也同樣顯示，與正常肺組織相比，原發(fā)性肺腺癌組織的CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(圖2A～2E，2H)，而CBX6和CBX7 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(圖2F，2G)。

2.3 CBX家族的不同成員在原發(fā)性肺癌組織中蛋白表達(dá)水平的差異

Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫資料顯示，CBX2、CBX4、CBX5、CBX6和CBX8蛋白在正常肺組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在肺癌組織中觀察到低和中等表達(dá)(圖3B，3D～3F，3H)。此外，CBX1和CBX3蛋白在正常肺組織中呈低表達(dá)或中等表達(dá)，而在肺癌組織中呈中等表達(dá)或高表達(dá)(圖3A，3C)。然而，無論是在正常肺組織或肺癌組織中，CBX7蛋白的表達(dá)都很低(圖3G)。

2.4 CBX mRNA表達(dá)水平與肺腺癌患者的AJCC-TNM臨床分期顯著相關(guān)

采用UALCAN分析顯示，CBX家族成員的mRNA表達(dá)與患者個(gè)體腫瘤分期顯著相關(guān)。隨著腫瘤病理分期的增加(1期～4期)，CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8的mRNA的表達(dá)也趨于更高(圖4A～4E、4H)。CBX6，CBX7的mRNA表達(dá)水平隨著腫瘤分期的增加而趨于降低(圖4F、4G)，其中，CBX7 mRNA降低幅度更為顯著。

注：數(shù)據(jù)來源：UALCAN； Normal：正常組織； Primary tumor：肺腺癌組織； n：病例數(shù)圖2 不同CBXs家族成員在肺腺癌組織及癌旁正常肺組織中的mRNA表達(dá)

注：數(shù)據(jù)來源Human Protein Atlas；Normal：正常組織；Cancer：肺癌組織；藍(lán)色虛線區(qū)域：CBXs蛋白表達(dá)陽性圖3 CBXs家族各成員在肺癌組織和正常肺組織中的典型免疫組化圖像

注：數(shù)據(jù)來源：UALCAN；Normal：正常組織；n：病例數(shù)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 CBXs家族各成員的mRNA在肺腺癌不同臨床分期中的表達(dá)水平

2.5 CBX家族成員的mRNA表達(dá)與肺癌患者OS顯著相關(guān)

CBX2、CBX4和CBX8 mRNA表達(dá)高的患者OS較短，(圖5B，CBX2：HR =1.55，95%CI：1.31～1.83，P<0.01；圖5D，CBX4：HR=1.22，95%CI：1.08～1.39，P<0.01；圖5H，CBX8：HR=1.18，95% CI：1.04～1.34，P<0.05)。CBX7 mRNA高表達(dá)的肺癌患者OS良好，呈顯著相關(guān)(圖5G，HR=0.57，95%CI：0.5～0.65，P<0.01)。然而，CBX1，CBX3，CBX5和CBX6的 mRNA表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后無關(guān)(圖5A，CBX1：HR=0.89，95%CI：0.78～1.01，P=0.063; 圖5C，CBX3：HR=1，95%CI：0.88～1.14，P=0.99；圖5E, CBX5：HR=0.89，95%CI：0.79～1.02，P=0.085；圖5F，CBX6：HR=0.98，95%CI：0.86～1.11，P=0.75)。

注：數(shù)據(jù)來源：Kaplan-Meier Plotter；Logrank檢驗(yàn)對肺癌患者進(jìn)行生存分析，比較CBXs高表達(dá)組和低表達(dá)組患者OS；橫坐標(biāo)：生存時(shí)間；縱坐標(biāo)：生存率；紅線：CBXs高表達(dá)組；黑線：CBXs低表達(dá)組；low和high后面的數(shù)字代表橫坐標(biāo)各時(shí)間段相對應(yīng)的患者例數(shù)。ID：各基因?qū)?yīng)的探針號； HR：風(fēng)險(xiǎn)比，HR>1，危險(xiǎn)因素；HR<1，保護(hù)因素圖5 CBXs家族成員mRNA表達(dá)對肺癌患者預(yù)后的影響

3 討論

目前，影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物檢查是無創(chuàng)篩查肺癌，評價(jià)及監(jiān)測治療效果的主要方法。然而，普通CT對早期肺癌或者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶敏感性較低。血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1和NSE均對肺癌的診斷有一定的提示作用，亦可作為術(shù)后、化療后檢測腫瘤是否復(fù)發(fā)的指標(biāo)，但會(huì)因?yàn)榱夹阅[瘤、妊娠、慢性炎癥性疾病或其他因素而出現(xiàn)假陽性，其結(jié)果往往不太可靠[9]。因此，尋找更合適的、非侵襲性生物標(biāo)志物來預(yù)測肺癌發(fā)生或評估預(yù)后，對肺癌的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。多項(xiàng)研究證實(shí)，CBX在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10-12]，但CBX家族中不同的成員在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用卻不太相同，龐雜繁冗的數(shù)據(jù)模糊了CBX作為肺癌生物標(biāo)志物的意義。因此，本研究對有關(guān)CBX和肺癌的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，闡明了不同基因型CBX在肺腺癌中的表達(dá)情況及預(yù)后價(jià)值。

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在肺癌患者中，CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8均存在mRNA過度表達(dá)，但其中僅有CBX1、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8蛋白過度表達(dá)，而CBX2蛋白并沒有過表達(dá)，這可能是其轉(zhuǎn)錄后修飾受到限制。其次，部分CBX mRNA表達(dá)與肺癌患者的個(gè)體腫瘤分期顯著正相關(guān)，表達(dá)越高，腫瘤分期越晚。此外，高表達(dá)的CBX2、CBX4和CBX8與肺癌患者的短OS顯著相關(guān)，提示預(yù)后差；而高表達(dá)的CBX7與肺癌患者的良好OS顯著相關(guān)，提示預(yù)后相對良好。

除了肺癌，CBX成員在其他腫瘤中也顯示出其與患者的OS、腫瘤分期的顯著相關(guān)性，與本研究中有關(guān)CBX與肺腺癌關(guān)系的趨勢基本一致。部分研究還探討了相關(guān)的機(jī)制，例如，在前列腺癌的治療中，根據(jù)患者的Gleason分級(一種廣泛使用的組織分級方法)決定選取何種治療方案，而前列腺癌組織的CBX1表達(dá)水平增高與患者Gleason評分密切相關(guān)[13]。其機(jī)制可能為，前列腺癌組織的CBX1表達(dá)水平受到抑制后，癌細(xì)胞生長周期被阻滯在G1期，從而抑制癌細(xì)胞的生長[13]。在乳腺癌中，CBX1的過度表達(dá)也提示乳腺癌分化不良和患者預(yù)后差[14]。此外，乳腺癌和白血病細(xì)胞中也存在CBX2的過度表達(dá)現(xiàn)象，并且CBX2水平也與腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展和患者短OS顯著相關(guān)[15]，CBX2基因還能增強(qiáng)白血病細(xì)胞的致瘤性和自我更新能力[16]。CBX3在人結(jié)直腸癌中過度表達(dá)，它通過直接調(diào)控CDKN1A分子，促使組蛋白H3K9啟動(dòng)子甲基化，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[17]。在肝細(xì)胞癌中，CBX4在肝癌組織中高表達(dá)，并且和多種臨床參數(shù)有關(guān)，包括甲胎蛋白水平、腫瘤大小、病理分化、患者OS和無復(fù)發(fā)生存率(recurrence-free survival，RFS)[18, 19]。在本研究中也我們發(fā)現(xiàn)，CBX4在肺腺癌中具有類似的效應(yīng)。同時(shí)，CBX8作為一個(gè)癌基因可以上調(diào)EGR1和miR-365-3p，從而激活A(yù)KT/β-catenin通路，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，而沉默CBX8基因表達(dá)則抑制了上述效應(yīng)[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CBX8和上述CBX成員一樣，其mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高，并且CBX8的mRNA表達(dá)與患者的腫瘤分期顯著相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，CBX6在肝癌臨床樣本和肝癌細(xì)胞系中上調(diào)，并且CBX6的表達(dá)與較大的腫瘤(直徑≥5 cm，P=0.011)和多發(fā)性腫瘤(n≥2，P=0.018)顯著相關(guān)；生存分析表明，與低表達(dá)CBX6的患者相比，CBX6表達(dá)水平高的患者RFS和OS顯著縮短，多變量分析證實(shí)CBX6表達(dá)增加是肝癌患者的獨(dú)立不利預(yù)后因素；功能研究表明，CBX6在體外和體內(nèi)均能顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長；其機(jī)制研究表明S100A9/NF-κB/MAPK通路是介導(dǎo)CBX6功能的重要途徑[21]。CBX6的過度表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展，并預(yù)示著肝細(xì)胞癌預(yù)后不良。另外有研究在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，CBX6在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)量與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)[22]。在GBM細(xì)胞系中過表達(dá)CBX6，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖受到抑制[22]。上述研究提示，CBX6在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)出不同的功能。

有趣的是，CBX7低表達(dá)預(yù)示肺癌患者有更好的生存率。CBX7是腫瘤相關(guān)研究中最具特征的CBX蛋白[23]。研究顯示CBX7可通過抑制PTEN/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[24]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，采用qRT-PCR、IHC以及Log-rank分析等方法對浸潤性乳腺癌進(jìn)行多變量分析，結(jié)果表明只有EZH2過表達(dá)和CBX7低表達(dá)與乳腺癌短無轉(zhuǎn)移生存率(metastase-free survival，MFS)顯著相關(guān)， EZH2過表達(dá)和CBX7低表達(dá)同時(shí)存在可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素[25]。CBX7亦可通過DKK-1介導(dǎo)的Wnt信號通路抑制乳腺腫瘤的發(fā)生。這些研究都提示，在部分腫瘤中(包括本研究關(guān)注的肺腺癌)，CBX7可能是一種重要的腫瘤抑制因子[26]。但是，該觀點(diǎn)在甲狀腺癌和胰腺癌中卻不成立，因?yàn)镃BX7表達(dá)缺失的甲狀腺癌和胰腺癌組織具有高度惡性表型[27]。此外，還發(fā)現(xiàn)上調(diào)CBX7表達(dá)可提高人類肺癌細(xì)胞對伊立替康治療的敏感性，提示其可能是提高化療療效的一個(gè)潛在措施[28]?？傊P(guān)于CBX7的生物功能，在不同腫瘤中具有明顯差異，提示CBX7可能同時(shí)存在抑癌或致癌功能，這取決于腫瘤類型、腫瘤微環(huán)境和各種蛋白之間的相互作用。

綜上，檢測患者肺組織CBX mRNA水平可以作為肺腺癌患者生存期預(yù)測的生物學(xué)指標(biāo)，尤其以CBX2、CBX4和CBX8更有意義，它們的高表達(dá)與肺癌患者的短OS顯著相關(guān)，提示預(yù)后差；而CBX7表達(dá)水平高與肺癌患者的良好OS顯著相關(guān)，提示預(yù)后相對良好。同時(shí)，CBX7高表達(dá)還提示患者采用伊立替康治療時(shí)會(huì)有更好的療效。CBX1、CBX3、CBX5和CBX6的mRNA表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后無關(guān)。因此，在CBX蛋白家族中，聯(lián)合檢測CBX2、CBX4、CBX7和CBX8 表達(dá)水平，對肺癌患者生存預(yù)后有更好的評估價(jià)值，亦可作為個(gè)體化治療的潛在靶點(diǎn)。本研究分析的結(jié)果將有助于更好地理解肺癌分子生物學(xué)的復(fù)雜性和異質(zhì)性，并為后續(xù)深入研究提供方向。