長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中表達(dá)水平分析

鄒勇

摘要：目的：研究長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中的表達(dá)水平。方法：使用qRT-PCR檢測15例急性白血病和15例缺鐵性貧血患者的長鏈非編碼RNA CARLo 5的表達(dá)差異。結(jié)果：長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病與缺鐵性貧血患者中的表達(dá)存在差異。對比缺鐵性貧血對照組，長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中AML組的2-△CT值（x±S）為：0.3177±0.036，而對照組的2-△CT值（x±S）為：0.1041±0.0121 （ P<0.001）。 結(jié)論：長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中呈過表達(dá)狀態(tài)，可以作為急性髓性白血病的生物學(xué)標(biāo)記。長鏈非編碼RNA CARLo 5有可能成為治療急性髓性白血病的藥物靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA，生物學(xué)標(biāo)記，急性髓性白血病。

【中圖分類號】R733.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?【文章編號】1673-9026（2021）02-010-02

急性髓性白血病（AML）是較常見的血液系統(tǒng)惡性疾病，目前，化療仍然是白血病治療中最重要和最基本的治療方法和手段，但是由于缺乏標(biāo)靶的選擇性，在殺死腫瘤細(xì)胞時(shí)也會(huì)無選擇性的損傷正常的造血組織和細(xì)胞，往往在治療過程中產(chǎn)生比較大的副反應(yīng)。能夠僅殺傷白血病細(xì)胞而對正常細(xì)胞無傷害的精準(zhǔn)治療是我們夢想的治療方式，這就需要我們能找到白血病分子和正常分子之間的差異，針對差異去設(shè)計(jì)精準(zhǔn)治療方案。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。這類RNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能，無人關(guān)注，被塵封了起來。lncRNA能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[1-3]。而隨著高通量測序技術(shù)、大規(guī)模 LncRNA、 cDNA 文庫的建立 、基因芯片技術(shù)的高速發(fā)展，LncRNA被發(fā)現(xiàn)與生物進(jìn)化、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝以及人類多種重大疾病關(guān)系密切，包括腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵問題[4-7]。目前，LncRNA已經(jīng)成為了腫瘤研究的前沿和熱點(diǎn)。

LncRNA CARLo 5（cancer-associated region long noncoding RNAs 5），是一種最近確認(rèn)的長鏈非編碼RNA，位于染色體8q24，被認(rèn)為在細(xì)胞周期和腸道腫瘤發(fā)展中有重要作用。LncRNA CARLo 5在腫瘤中發(fā)生，發(fā)展中有重要的意義，但LncRNA CARLo 5具體的作用機(jī)制及下游靶分子的研究尚不清楚，而且在白血病可中尚未見有LncRNA CARLo 5相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

材料和方法

1.病例資料

收集 2016年 5 月-2018 年 5 月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科確診 15 例初診的 AML 患者為研究對象（ AML 組），同期選擇性別與年齡相符，且符合缺鐵性貧血（ iron- deficiency anemia，IDA） 國際標(biāo)準(zhǔn)的 IDA 患者15 例作為對照組（ Control） 。所有入組者所留取的標(biāo)本均為骨髓，所有入選者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

2.主要的試劑及儀器

RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司; 總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Thermofisher公司;熒光定量PCR（qRT-PCR）SYBR-Green 試劑盒購自日本 Takara 公司; 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ GAPDH） 和LncRNA CARLo 5 上下游引物購自上海生工生物工程股份有限公司，7500 熒光定量 PCR 儀：美國ABI 公司。

3.樣本收集、RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用 EDTA抗凝管收集對照組、 AML組患者骨髓液 2 ml，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后1 500 R / min 離心 5min，棄上清液后加入 1 ml TRizol充分吹打細(xì)胞沉淀，移至 1.5 ml EP 管中，標(biāo)記保存于 -80 ℃。通過經(jīng)典吸附柱法，按照說明書所述，抽提留存的骨髓標(biāo)本中的總 RNA，紫外分光光度計(jì)檢測 RNA 濃度及純度。采用美國 Thermofisher 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按其說明書步驟配置反應(yīng)體系，在普通PCR 儀提前設(shè)置好的反應(yīng)條件下將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-20℃ 保存。

4.引物設(shè)計(jì)與合成

在美國國立生物技術(shù)信息中心（ National Center for Biotechnology Information，NCBI） （ https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/） 查找 LncRNA CARLo 5、 GAPDH基因序列，由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成正反向引物，引物序列見表 1。

5.qRT-PCR

按照 SYBR Green試劑盒說明書操作，以 cDNA 為模板，反應(yīng)體系為 20 μl，加入反應(yīng)試劑進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系包括： 模板 cDNA 2 μl、SYBR 10 μl、GAPDH 或者 LncRNA CARLo 5 的正反向引物各 0.8 μl、加無菌蒸餾水至總反應(yīng)體積 20 μl。qPCR 反應(yīng)條件： 95 ℃ 、30s 預(yù)變性; 之后 95 ℃ 變性 5 s、60 ℃ 延伸 30 s，共計(jì)完成 45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè) 2 個(gè)復(fù)孔PCR擴(kuò)增結(jié)束后可獲取擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle threshold CT）值，以 GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△CT法計(jì)算LncRNA CARLo 5在實(shí)驗(yàn)組和對照組中的表達(dá)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 6.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用 t 檢驗(yàn)分析LncRNA CARLo 5表達(dá)量的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

LncRNA CARLo 5 在 AML 患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)情況

qRT-PCR 法檢測LncRNA CARLo 5 在 15 例初治 AML 患者和15 例IDA 患者中的表達(dá)。結(jié)果顯示，LncRNA CARLo 5 在 AML 患者中的表達(dá)量較IDA（ Control） 患者明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中AML組的2-△CT值（x±S）為：0.3177±0.036，而對照組的2-△CT值（x±S）為：0.1041±0.0121，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖1。

討論

急性髓性白血病占據(jù)成人急性白血病的大部分，且多發(fā)于中老年人，因出現(xiàn)不耐受常規(guī)化療、無骨髓移植的情況，預(yù)后不佳，急待副作用較小的靶向治療。

Lnc RNA是一類長度大于 200 nts的RNA，在真核細(xì)胞內(nèi)被廣泛被轉(zhuǎn)錄，曾被認(rèn)為不具備生物學(xué)功能。但目前研究認(rèn)為Lnc RNA具有非常重要的生物學(xué)功能，其雖然不翻譯，但也可以和蛋白分子一樣，作為調(diào)節(jié)分子參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、周期、分化、凋亡等各種生物學(xué)過程，也參與腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等各種病理過程。如LncRNA UCA1 通過調(diào)節(jié)CREB蛋白表達(dá)水平并激活 PI3K 信號通路參與膀胱癌細(xì)胞周期的調(diào)控，促進(jìn)了腫瘤的生長，表明 lncRNA 與腫瘤異常信號通路有關(guān)[8] ;LncRNA CCAT1被c-myc基因激活促進(jìn)了胃癌的增殖和遷移[9]，而LncRNA-HEIH通過抑制 EZH2 靶基因提高了EZH2 蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期 G0/G1 期阻滯。越來越多的文章表明，相對正常組織，LncRNA在惡性腫瘤中有明顯異常的表達(dá)，它可以作為很多腫瘤的分子標(biāo)記。

LncRNA CARLo 5是一種最近確認(rèn)的長鏈非編碼RNA，位于染色體8q24，被認(rèn)為在細(xì)胞周期和腸道腫瘤發(fā)展中有重要作用。原癌基因MYC增強(qiáng)子的rs6983267 allet能與LncRNA CARLo 5的啟動(dòng)子的激活調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合并長期作用，從而影響LncRNA CARLo 5的表達(dá)，而增加腫瘤的易感性[10]。Luo J[11]認(rèn)為LncRNA CARLo 5是一個(gè)小細(xì)胞肺癌的陽性預(yù)后因子，和其致瘤性相關(guān)。而在肝癌研究的回顧性研究中，LncRNA CARLo 5也被認(rèn)為和疾病進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[12]。而在血液腫瘤中LncRNA CARLo 5的研究罕見報(bào)道。本研究表明，LncRNA CARLo 5 在AML 高表達(dá)，下一步可擴(kuò)大病例數(shù)驗(yàn)證上述結(jié)果，并研究LncRNA CARLo 5 的表達(dá)水平與 AML 患者總生存和預(yù)后的影響。同時(shí)在白血病細(xì)胞株中深入研究 LncRNA CARLo 5 在白血病中的作用及可能的機(jī)制。

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福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科?363000