分子生物技術(shù)在川貝母鑒別中的應(yīng)用展望

喻瑩 陳建偉 陳志禹

摘 要 川貝母是中國最常用的化痰止咳貴重藥草，貝母屬植物種類繁多，各種屬來源復(fù)雜，川貝母與其混偽品之間鑒別困難，近年來分子生物技術(shù)在川貝母鑒定中開始了大規(guī)模的應(yīng)用研究，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、SSR、PCRISSR、qPCR、DNA條形碼、SNP、PCR-AFLP等技術(shù)的應(yīng)用，并且展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 分子生物技術(shù) 川貝母 鑒別

中圖分類號：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）05-0073-04

*基金項目：寧波市自然科學(xué)基金項目“realtime PCR用于檢定川貝母摻偽情況的定量研究”（2018A610429）

Prospect of the application of molecular biotechnology in identification of Fritillaria cirrhosa*

YU Ying1**， CHEN Jianwei2***， CHEN Zhiyu2

（1. Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310053， China； 2. Ningbo Institute for Drug Inspection， Zhejiang Ningbo 315000， China）

ABSTRACT Bulbus Fritillariae cirrhosae is phlegm cough precious herbs that is the most commonly used in China. There are many different kinds of plants of the genus Fritillaria and the sources of various genus are complex. The identification between Bulbus Fritillariae cirrhosae and the adulterants are difficult. Molecular biotechnology has begun a large-scale study in identification of Bulbus Fritillariae cirrhosae in recent years， such as PCR-RFLP， PCR-RAPD， SSR， PCR-ISSR， qPCR， DNA barcoding， SNP， PCR-AFLP and other technologies and shows a good application prospect.

KEY WORDS molecular biotechnology； Bulbus Fritillariae cirrhosae； identification

川貝母是百合科貝母屬多年生草本植物，有淸熱潤肺，化痰止咳，散結(jié)消癰的功能。我國的藥用貝母屬植物超過50種，中國藥典2015年版[1]共收錄5大類貝母：川貝母、平貝母、伊貝母、浙貝母和湖北貝母，其中川貝母基原植物有： 川貝母（F. cirrhosa D. Don）、暗紫貝母（F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）、甘肅貝母（F. przewalskii Maxim）、梭砂貝母（F. delavayi Franch）、太白貝母 （F. taipaiensis P. Y. Li）或瓦布貝母（F. unibracteata Hsiaoet K. C. Hsia var. wabuensis）。由于需求量大而資源少，優(yōu)質(zhì)川貝母價格昂貴，市場上存在用其他低價的近緣品種（如小平貝和伊貝母）充當(dāng)川貝母出售的現(xiàn)象。中國藥典2015年版規(guī)定的川貝母鑒別法主要有顯微鑒別法、薄層色譜法以及PCR-RFLP法。近年來分子生物技術(shù)的應(yīng)用，使其鑒定手段從傳統(tǒng)形態(tài)表征擴(kuò)展到了遺傳物質(zhì)DNA：核糖體上的ITS保守區(qū)序列、葉綠體上的psbA-tmH序列等，可定量、準(zhǔn)確地對川貝母進(jìn)行鑒別。本文就分子生物技術(shù)在川貝母鑒別中的應(yīng)用及展望作一簡單綜述。

1 PCR-RFLP技術(shù)

PCR-限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，擴(kuò)增產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生不同長度的DNA條帶，可通過條帶灰度反應(yīng)摻偽比例大小。早在2005年，Wang等[2]將RFLP技術(shù)應(yīng)用于伊犁貝母的鑒別中，后逐漸應(yīng)用于湖北貝母、平貝母、浙貝母、伊貝母等鑒別中，反應(yīng)體系也逐漸優(yōu)化。徐傳林等[3]對PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)：采用DNA快速提取試劑盒提取DNA；PCR擴(kuò)增（預(yù)變性4 min，變性30 s，復(fù)性30 s，延伸30 s，最終再延伸5 min；循環(huán)次數(shù)為30次）；酶切（時間為2 h；DNA酶為SmaⅠ限制酶）；且PCR擴(kuò)增、電泳、酶切步驟中RSD均小于10%，證明反應(yīng)穩(wěn)定性高。此方法不同實驗室靈敏度可達(dá)50%以上[4]，適用范圍廣，結(jié)果穩(wěn)定，技術(shù)較成熟，已被收錄于中國藥典2015年版川貝母鑒別項下。但藥典采用的PCR-RFLP法無法進(jìn)行定量檢測，并且由于PCR法過于靈敏，摻入少量川貝母即可出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。趙仲麟等[5]的實驗表明真品川貝母擴(kuò)增產(chǎn)物含有SamⅠ酶切位點，在100～250 bp之間存在明確的2條酶切條帶，而偽品中由于沒有SamⅠ酶切位點而不能被切出該片段。此外，還進(jìn)行了相對定量分析研究，含量10%及以上的真品川貝母能被穩(wěn)定檢測出。針對PCR-RFLP的貝母鑒別技術(shù)研究較多，相對其他分子鑒別技術(shù)，技術(shù)較成熟。

2 PCR-RAPD技術(shù)

PCR-隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，PCR-RAPD）標(biāo)記技術(shù)是利用一系列（8～10個堿基）不同的隨機(jī)引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過凝膠電泳分離來檢測DNA片段多態(tài)性的技術(shù)。PCR-RAPD技術(shù)可以揭示高度的多態(tài)性，并且不需要設(shè)計引物，對模板DNA濃度要求較低。該方法簡單明了，適合在中醫(yī)藥行業(yè)中應(yīng)用。Xin等[6]利用RAPD技術(shù)對貝母種質(zhì)資源的一個0.65 kb的DNA分子標(biāo)記進(jìn)行了鑒定。根據(jù)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物開發(fā)了代表序列特征擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）的DNA標(biāo)記。將SCAR標(biāo)記成功用于川貝母種間鑒別。SCAR標(biāo)記具有大規(guī)模分析的優(yōu)點，成本低，重復(fù)性高，且易于使用，對比PCRRFLP鑒別法，不需要高質(zhì)量DNA，無需預(yù)備性工作，不需設(shè)計引物。

3 SSR篩選

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記，是一類由數(shù)個核苷酸為重復(fù)單位組成的重復(fù)序列。SSR篩選具體操作步驟包括：RNA提取及測序、SSR檢測、PCR擴(kuò)增、電泳、結(jié)果分析。將篩選出的川貝母的SSR序列，作為特異性序列，與偽品進(jìn)行鑒別。早些年的研究曾嘗試用通用分子標(biāo)記來鑒別近源種貝母，但系統(tǒng)發(fā)育信號不足。張婕等[7]通過高通量測序在川貝母中檢測到3 817個SSR位點，SSR出現(xiàn)頻率為8.49%，平均每10.37 kb序列出現(xiàn)1個SSR位點，其中重復(fù)類型最多的為三核苷酸和二核苷酸，所占比分別為56.51%和27.06%，為川貝母的遺傳標(biāo)記和指紋圖譜的開發(fā)提供了重要依據(jù)。

4 PCR-ISSR技術(shù)

PCR-內(nèi)部簡單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）是將錨定的微衛(wèi)星DNA（即SSR序列的3端或5端加上2～4個隨機(jī)核苷酸）作為引物，對重復(fù)序列之間的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。此方法不需要測序及設(shè)計引物，與RAPD方法類似。詹羽姣等[8]采用ISSR技術(shù)對新疆貝母進(jìn)行遺傳多樣性分析，其中多態(tài)性條帶為195條，占97.99%，遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）分別為74.74%和0.301 4 cm，同樣可將ISSR應(yīng)用于川貝母的鑒別。ISSR還可與RAPD單獨或聯(lián)合應(yīng)用于川貝母的遺傳關(guān)系分析。

5 qPCR技術(shù)

實時熒光定量PCR技術(shù)（realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）是以免疫學(xué)原理為基礎(chǔ)的一種新型技術(shù)。與其他不同的是，對目的基因擴(kuò)增結(jié)果不是通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷，而是通過熒光標(biāo)記的特異性探針（通常為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)），對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時監(jiān)控反應(yīng)過程，再計算Cq值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以對樣本含量定量計算。此技術(shù)在川貝母研究中的應(yīng)用較少，僅國內(nèi)有數(shù)篇報道[9-12]。王成等[9]以TaqMan為探針，通過篩選、特異性測試、擴(kuò)增條件優(yōu)化和方法靈敏度測試，形成一套川貝母物種特異性實時熒光PCR方法。在此基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)引物終濃度1.2 μmol/L、探針終濃度0.6 μmol/L時，可檢測川貝母含量低至0.05%的樣品。qPCR的實驗結(jié)果可通過Cq值和擴(kuò)增曲線圖來直觀表示，可以實時監(jiān)測反應(yīng)過程，且反應(yīng)特異性強(qiáng)、操作簡單、用時少、準(zhǔn)確率高，有很好的應(yīng)用前景。表1將RFLP、RAPD、ISSR、qPCR之間進(jìn)行了對比。

6 DNA條形碼

DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段。DNA條形碼技術(shù)以PCR-RFLP技術(shù)為基礎(chǔ)，將樣品經(jīng)過DNA提取→引物設(shè)計→PCR擴(kuò)增→電泳→序列測定→多重序列對比及聚類分析的步驟，將DNA條形碼與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比。其中序列分析是最重要的環(huán)節(jié)，首先進(jìn)行序列比對和人工矯正，通過軟件計算種內(nèi)和種間K2P距離，然后根據(jù)計算結(jié)果建立NJ樹，最后根據(jù)遺傳距離就能對樣本進(jìn)行分類和鑒定。其中ITS2序列是近幾年的研究熱點，ITS2是rRNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分，它的序列變化較大，具有重復(fù)率、特異性高的特點。但I(xiàn)TS2不能將川貝母篩選到“種”，也容易造成實驗污染。其他高效的DNA條形碼序列還包括葉綠體基因組的psbA-trnH，rbcL，matK，psbK-psbI，atpF-atpH等，可以將川貝母與其混偽品有效地區(qū)分，成為近幾年研究的熱點。DNA條形碼還可作為SSR、SNP等技術(shù)的實驗基礎(chǔ)，應(yīng)用廣泛。Zhong等[13]將DNA條形碼技術(shù)與HPLC指紋圖譜相結(jié)合，先是應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)（ITS2具有最高的種間差異，種內(nèi)距離為0.000 0～0.008 5 cm，種間距離為0.002 1～0.005 3 cm，平均距離為0.003 0 cm）識別出貝母屬，后通過HPLC指紋圖譜及主成分圖進(jìn)行聚類分析，將川貝母與其他類貝母區(qū)分開，為川貝母質(zhì)量控制和鑒定提供依據(jù)。DNA條形碼技術(shù)的準(zhǔn)確率極高，且操作難度低，但DNA測序成本較高，且無法定量檢測出摻偽含量。

7 單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）主要是指在基因水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。可通過比對兩種或多種基因組全序列進(jìn)行川貝母的鑒別。SNP標(biāo)記技術(shù)不需要凝膠電泳，代之以DNA芯片技術(shù)，不再以DNA長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記。蘭青闊等[14]應(yīng)用多重序列比對、 SNP 篩選等生物信息學(xué)分析手段，對貝母屬葉綠體基因組序列進(jìn)行分析，貝母屬植物序列大小在151 009～152 224 bp之間，序列一致性為97.22%，共發(fā)現(xiàn)SNP位點5 879個，其中川貝母類鑒別候選位點71個。該技術(shù)兼有PCR技術(shù)的靈敏性和測序技術(shù)的準(zhǔn)確性，精密度在10%左右，且一次可檢測96個樣本，操作簡單，與熒光信號結(jié)合還可定量檢測樣本含量，精密度在0.1%左右。但其價格昂貴，日常鑒別應(yīng)用較困難。

8 PCR-AFLP技術(shù)

PCR-擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是用兩種酶切割出引物結(jié)合位點，后對酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。AFLP具有RFLP的高特異性和PCR的高效性，可重復(fù)性好。徐金中等[15]將AFLP應(yīng)用于浙貝母的遺傳多樣性的分析，多態(tài)性條帶達(dá)67%以上，表明AFLP能檢測到很豐富的多態(tài)性，具有在川貝母鑒別中應(yīng)用的可行性。AFLP結(jié)合了RFLP與RAPD的優(yōu)點，不足之處是費用高，步驟繁瑣，反應(yīng)條件要求高，應(yīng)用于日常鑒別有一定困難，目前需要簡化引物的篩選及優(yōu)化實驗條件。

9 小結(jié)與展望

分子生物技術(shù)是一種較為先進(jìn)的技術(shù)，具有較高的特異性和靈敏度。此技術(shù)種類繁多，其中以分子中的DNA檢測為主，但DNA分子較少，往往不能被直接檢測到，但運用PCR技術(shù)，可以將提取到的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，近年來以PCR為基礎(chǔ)的多種分子生物技術(shù)發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于川貝母及其他中藥材的鑒定之中。

目前PCR相關(guān)鑒別法前景較好，操作也正趨向簡易、成熟。PCR-RFLP及PCR-RAPD的相關(guān)研究較廣泛，技術(shù)較成熟，結(jié)果穩(wěn)定可靠，但操作耗時耗力，最適反應(yīng)條件及酶切體系等正在進(jìn)一步完善；RAPD采用隨機(jī)引物，但穩(wěn)定性及重復(fù)性低，提高實驗穩(wěn)定性尤為重要；SSR序列廣泛分布于川貝母DNA中，但需要測序，實驗成本較高，可作為ISSR技術(shù)的實驗基礎(chǔ)，不適于平時鑒別工作；ISSR技術(shù)使用的是隨機(jī)引物，實驗成本較低，操作較簡易，且目前的已知序列充足，開發(fā)SSR序列難度并非十分困難，將其應(yīng)用于川貝母研究前景應(yīng)該很好；qPCR技術(shù)可對川貝母進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，且精確度極高，目前在川貝母方面的研究相對較少，對于此技術(shù)的實驗步驟及條件的確立研究意義重大且前景較好；DNA條形碼是準(zhǔn)確性最高的技術(shù)之一，但目前的數(shù)據(jù)庫仍需進(jìn)一步完善，且實驗成本高，無法定量測定，與HPLC等化學(xué)測定技術(shù)相結(jié)合或?qū)⒊蔀檠芯繜狳c；SNP篩選可將分子鑒定具體到核苷酸，但實驗成本較高。這些方法都是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的，對川貝母的鑒別也都意義重大，各實驗室可根據(jù)自己的實驗意義、經(jīng)費、實驗條件等因素選擇適合自己的技術(shù)。

常用的RFLP、RAPD等方法無法滿足大量樣品的檢測，但AS-PCR（等位基因特異性PCR）采用特異性引物，可將具有共同引物的樣本同時進(jìn)行多重PCR鑒別（在一個PCR反應(yīng)中實現(xiàn)多個目標(biāo)序列的同步擴(kuò)增），具有高通量性，可同時檢測幾十甚至上百個樣本，對數(shù)據(jù)庫的建立意義較大；分子生物技術(shù)還可與質(zhì)譜法、統(tǒng)計學(xué)、多元分析法等方法相結(jié)合，更加全面準(zhǔn)確地鑒別出川貝母的混偽品。生物芯片、mRNA差異顯示技術(shù)等已被應(yīng)用于其他中藥材的鑒別，如劉潤南等[16]運用底芯片法和蓋芯片法篩查雙黃連注射劑中的致敏性成分；黎潔文等[17]應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)篩選何首烏中二苯乙烯苷合成相關(guān)基因。但這些暫未應(yīng)用于川貝母的鑒別，將此類方法進(jìn)行優(yōu)化，同樣有望應(yīng)用于川貝母的真?zhèn)舞b別。目前川貝母鑒別方法雖多，但部分技術(shù)屬新型技術(shù)，研究不夠透徹，故完善已有技術(shù)及尋找新方法對川貝母的鑒別均有重大意義。

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