基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的作用機制研究

施建新 趙珩 閔仲生 譚城 李紅敏

摘要：目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的作用靶點，探討治療特應(yīng)性皮炎作用機制。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)平臺，以口服利用度和類藥性分別篩選本配伍的有效活性成分同時預(yù)測作用靶點;從Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索中藥靶點所對應(yīng)的人類基因，檢索Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫中特應(yīng)性皮炎相對應(yīng)的基因，再將疾病基因與中藥預(yù)測的靶點取交集，使用在線String工具對疾病基因與中藥的靶點交集進行PPI互作分析。采用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病調(diào)控網(wǎng)，將藥物-疾病關(guān)鍵靶點蛋白進行GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果 IL6、AKT1、TNF等是荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵靶點，GO富集分析分析顯示荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎關(guān)鍵靶點設(shè)計生物過程條目多條，KEGG通路分析顯示IL17及TNF信號通路是荊芥-防風(fēng)配伍治療特應(yīng)性皮炎的主要機制通路。結(jié)論 荊芥-防風(fēng)藥對治療特應(yīng)性皮炎的機制可能與其干擾NF-κB在IL17及TNF信號通路中轉(zhuǎn)錄，影響炎癥因子IL-6等相關(guān)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);荊芥-防風(fēng)配伍;特應(yīng)性皮炎;作用機制

中圖分類號：R285 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）03-0015-07

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility in the treatment of atopic dermatitis by using network pharmacology and bioinformatics methods to screen the targets. Methods： Based on the TCMSP data platform， the effective active ingredients of this compatibility were screened by oral availability and drug-like properties and the targets were predicted at the same time. The corresponding human gene was searched for the target of traditional Chinese medicine from the Uniprot database， and the specificity of the corresponding genes to dermatitis was searched in the Genecard and OMIM databases， and then the disease genes and the predicted targets were taken to intersect， and the intersection of the disease genes and the targets were used to perform PPI interaction analysis by the online String tool. Cytoscape software was used to construct a drug-component-target-disease regulation network， and the drug-disease key target protein was analyzed for GO function and KEGG pathway enrichment. Results： IL6， AKT1， TNF， etc. were the key targets of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility in the treatment of atopic dermatitis. The GO enrichment analysis showed the key targets of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility in the treatment of atopic dermatitis were designed with multiple biological process items. KEGG pathway analysis showed the IL17 and TNF signaling pathways were the main mechanism pathways for the treatment of atopic dermatitis with Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility. Conclusion： The mechanism of Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility drugs in the treatment of atopic dermatitis may be related to its interference with the transcription of NF-κB in the IL17 and TNF signaling pathways and the influence of the inflammatory factor IL-6.

【Key words】Network pharmacology;Schizonepeta-Saposhnidoviae campibility;Atopic dermatitis;Mechanism of action

特應(yīng)性皮炎（atopicdermatitis，AD）是一種慢性瘙癢性且兒童發(fā)病率較高的皮膚病[1]。國外研究表明，在高收入國家中兒童AD發(fā)病率為15%～20%，成人AD發(fā)病率為1%～3%[2-3]。研究指出，AD發(fā)病的時間有可能會影響患者的臨床病程和持續(xù)時間，所以2歲之前發(fā)病的患者，他們的癥狀改善及病程控制通常好于發(fā)病較晚的患者，但此結(jié)論仍需要進一步的調(diào)查證實[4]。

中醫(yī)古籍中并未出現(xiàn)“特應(yīng)性皮炎”的病名，的古籍中記載了一些與特應(yīng)性皮炎癥狀相似的疾病，如“奶癬、血風(fēng)瘡、四彎風(fēng)”等，古籍中記載的特征與特應(yīng)性皮炎極為相似。荊芥防風(fēng)具有解熱、陣痛、影響免疫功能、抗過敏等作用，然而荊芥、防風(fēng)復(fù)雜的化學(xué)成分及治療疾病的多樣化[5]，臨床通常難以明確荊芥防風(fēng)藥對治療特應(yīng)性皮炎具體作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討其治療特應(yīng)性皮炎的可能作用機制，探索中醫(yī)藥治療AD的新方法。

1 資料與方法

1.1 荊芥、防風(fēng)化學(xué)成分虛擬篩選 在 TCMSP 平臺檢索荊芥、防風(fēng)主要活性成分的靶點蛋白，并在 Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將預(yù)測出的靶點蛋白名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化，選擇物種為“Homo sapiens”，轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因名稱，即得到藥物的潛在作用靶點。

1.2 疾病基因靶點預(yù)測 通過Genecard網(wǎng)站（https：//www.genecards.org/）和OMIM網(wǎng)站（https：//omim.org/）的檢索功能，搜索特應(yīng)性皮炎相對應(yīng)的基因，同時獲取特應(yīng)性皮炎基因數(shù)目。

1.3 網(wǎng)絡(luò)合并 使用在線工具String（https：//string-db.org）將AD基因與荊芥、防風(fēng)靶點取交集，獲取交集基因靶點很有可能是該藥對活性成分治療特應(yīng)性皮炎靶點。

1.4 PPI互作分析計算核心基因和繪制Cytoscape藥理網(wǎng)絡(luò)圖 將荊芥、防風(fēng)與特應(yīng)性皮炎取交集后的115個基因靶點進行PPI互作分析，輸入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建成分靶點基因PPI網(wǎng)絡(luò)，并進行核心篩選，制成藥物干預(yù)疾病的相關(guān)基因關(guān)系圖。

1.5 基因富集分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫查詢藥物與疾病的共同靶點，利用R語言將基因symbol轉(zhuǎn)為基因ID，設(shè)置pvalue=0.05，qvalue=0.05對獲取的基因分別進行GO富集和KEGG富集分析，進一步說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1 荊芥、防風(fēng)化學(xué)成分虛擬篩選 本實驗通過閾值設(shè)定OB>30%，DL>0.18，共篩選出主要候選化合物種類29種，荊芥化合物種類11種，主要包括揮發(fā)油類、單萜類及黃酮類，防風(fēng)化合物種類18種，主要包括色原酮類、香豆精類、揮發(fā)油類、多炔類及多糖類，從候選化合物中共篩選出成分靶點550個，其中荊芥312個，防風(fēng)238個（表1）。

2.2 中藥和疾病基因靶點預(yù)測 荊芥-防風(fēng)通過Uniprot網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/）檢索中藥靶點對應(yīng)的人的基因，其中排除未找到及重復(fù)的基因，最終共獲取基因175個。再通過Genecard網(wǎng)站（www.genecards.org）檢索與AD對應(yīng)的致病基因，共獲取特應(yīng)性皮炎基因1430個。其中，荊芥-防風(fēng)所干預(yù)的特應(yīng)性皮炎疾病基因為100個（圖1）。

2.3 網(wǎng)絡(luò)合并及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用String工具（string-db.org）構(gòu)建成分靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。通過計算每個基因的連接點數(shù)目，找出前30個PPI核心靶點，即IL6、AKT1、TNF等（圖3）。

2.4 繪制Cytoscape疾病-靶點藥理網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape3.72軟件，制成藥物干預(yù)疾病的有效成分與相關(guān)基因關(guān)系圖（圖4）。

2.5 GO富集分析 利用R語言，獲取基因ID，通過GO富集分析獲取的100個基因，共獲得129條相關(guān)的富集條目，分子功能的作用主要表現(xiàn)在細(xì)胞因子結(jié)合受體細(xì)胞，因子活性等方面（圖5、圖6）。

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集結(jié)果分析結(jié)果（圖7）顯示，“荊芥-防風(fēng)”藥對治療特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵基因靶點富集的通路共有164條，包括IL-17信號通路路徑（圖8）、TNF信號通路路徑（圖9）等。

3 討論

特應(yīng)性皮炎（AD）病因尚未明確，目前公認(rèn)其發(fā)病機制主要與皮膚屏障功能的異常、父母的遺傳、自身免疫功能異常及周圍環(huán)境因素相關(guān)。全球有超過20%的兒童及3%的成年人患有特應(yīng)性皮炎。2019年報道上海嘉定地區(qū)兒童的AD發(fā)病率約為2.54%[6]，與美國甚至歐洲等地相比，AD的在瑞典兒童中的患病率甚至能高達22.3%[7]。西醫(yī)多采用抗組胺類藥物，局部外用首選糖皮質(zhì)激素，雖能取得一定的療效，但各種不良反應(yīng)的發(fā)生也限制了它們的使用。尋找臨床療效確切，能有效降低復(fù)發(fā)率和毒副作用較小的方法及藥物，一直是各國臨床皮膚科醫(yī)生所關(guān)注的。

中醫(yī)雖無AD這一病名，但根據(jù)其發(fā)病原因及臨床表現(xiàn)，總結(jié)歸納后可歸屬于“濕瘡”、“浸淫瘡”、“四彎風(fēng)”等范疇，這其中尤以“四彎風(fēng)”與特應(yīng)性皮炎最為貼切[8]。風(fēng)邪襲入腠理是特應(yīng)性皮炎的病因之一，病機多為先天稟賦不耐，脾肺不足并外感風(fēng)濕熱邪，發(fā)于疾病所致，治則多以健脾利濕，清熱祛風(fēng)為主?！扒G芥防風(fēng)”藥對臨床運用廣泛，它們作為君藥的眾多復(fù)方廣泛應(yīng)用于皮膚科[9-10]，除了具有良好的祛風(fēng)止癢的功效，常常用于蕁麻疹、慢性濕疹等疾病起的瘙癢及支氣管炎、過敏性鼻炎等各類過敏性疾病。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索“荊芥-防風(fēng)”藥對通過何種途徑對特應(yīng)性皮炎產(chǎn)生治療效果。通過PPI蛋白互作分析，共找到100個互作關(guān)系密切的基因，IL6、AKT1、TNF等，說明這些基因參與了“荊芥-防風(fēng)”藥對對特應(yīng)性皮炎的治療。通過GO功能富集分析及KEGG通路富集分析來闡釋作用靶點在基因功能和信號通路的作用，發(fā)現(xiàn)藥對在生物過程富集主要表現(xiàn)在對有機物的反應(yīng)，細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)，細(xì)胞對有機物的反應(yīng)，對含氧化合物的反應(yīng)，對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)等方面。分子功能富集主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)合，酶結(jié)合，信號受體結(jié)合，細(xì)胞因子受體結(jié)合等方面。細(xì)胞成分富集主要表現(xiàn)在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)部分、細(xì)胞外區(qū)、膜筏、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腔等部分，所以本藥對可以通過影響細(xì)胞因子及其受體，抑制IL6發(fā)揮治療作用[11-12]。通過KEGG分析及文獻回顧[13]，“荊芥防風(fēng)”藥對作用于AD的機制可能體現(xiàn)在其有效成分干預(yù)NF-KB在IL17和TNF這2條信號通路中的轉(zhuǎn)錄，進而影響細(xì)胞因子的表達。在IL17通路中，藥對完全調(diào)節(jié)了下游炎癥因子IL1β、TNFα、IL6及IFNγ。TNF通路中也大量影響了炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子等，從而達到治療的特應(yīng)性皮炎結(jié)果。

IL-17及TNF這2條信號通路可能是本藥對治療特應(yīng)性皮炎的潛在通路[14-15]。既往研究已經(jīng)表明IL17在多種自身免疫疾病及炎癥致病因子中發(fā)揮了重要作用[16]，最近研究也表明，IL17會在患兒中有明顯的升高[17]。另外新生兒來源的IL-17可以預(yù)防特應(yīng)性皮炎的發(fā)生，因為IL17對于皮膚的穩(wěn)定和皮膚炎癥具有雙向調(diào)節(jié)的作用[18]。運用流式細(xì)胞術(shù)檢測術(shù)提示：雖然IL17在AD和銀屑病的皮損中都有表達，CD4+來源的IL17在兩種疾病中的表達的沒有顯著差異，但CD8+來源的IL17在銀屑病中表達比在AD中的表達具有明顯的意義[19]。目前已經(jīng)針對IL17這個通路，開發(fā)了治療銀屑病的生物制劑[20]。IL17的升高會導(dǎo)致AD的發(fā)生，所以針對IL17的治療很可能是治療AD的一個新的通路[21]。

在TNF通路中，本藥對通過影響NF-KB轉(zhuǎn)錄，來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子JUN、Fos及炎癥因子IL-6、IL1b等達到治療特應(yīng)性皮炎的結(jié)果。TLR4[22]的缺少會促進TNF-α的表達，而TNF-α可以單獨或者聯(lián)合Th2細(xì)胞因子降低神經(jīng)酰胺的含量，從而影響皮膚屏障功能[23]。研究表明，急性AD皮損中的角質(zhì)形成細(xì)胞中Th2細(xì)胞因子和腫瘤壞死因子-α可增強GITRL（Glucocorticoid-inducedTNFreceptor-relatedproteinligand）的表達。這一觀察表明細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的角質(zhì)形成細(xì)胞GITRL表達與其在AD炎癥反應(yīng)中的作用有關(guān)[24]。

綜上所述，通過對“荊芥-防風(fēng)”相關(guān)靶點與化學(xué)成分的作用進行分析，通過圖形的可視化發(fā)現(xiàn)藥對在分子水平上的復(fù)雜的作用原理，展示網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究“藥物-疾病-基因-靶點”的相互關(guān)系及其影響，換個新穎的角度展示中藥治療疾病原理，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法尋找“荊芥-防風(fēng)”藥對治療特應(yīng)性皮炎的可能的作用機制，為日后動物實驗提供可能的治療通路提供依據(jù)。但考慮到數(shù)據(jù)庫不夠完整，人體內(nèi)其他藥代動力學(xué)的影響分析不夠徹底，還需要更深入的研究來探索其具體機制。

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（收稿日期：2020-11-02）