矮牽牛新種質的花色表型及花色素分析

李雅琪，劉心怡，過雪瑩，潘俊松，唐東芹*

(1. 上海交通大學設計學院，上海 200240；2. 上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240)

矮牽牛(Petunia hybrida)是茄科碧冬茄屬植物，由于觀賞效果好、易栽培、適應性強且抗性佳，世界各地廣泛種植[1]。矮牽牛是世界上使用最廣、銷售量最大的盆花和花壇植物之一，被譽為“世界花壇花卉之王”和“花壇皇后”[2]，常用于花境、花壇、立體景觀、花槽、盆栽、陽臺、窗臺和居室裝飾。在中國，作為花壇后起之秀，矮牽牛的需求越來越大[3]。

花色是包括矮牽牛在內(nèi)的眾多觀賞植物的重要性狀。長期以來，觀賞植物育種的重要目標之一是培育色彩繽紛的新品種，科學量化的花色描述對育種子代的篩選、新品種的鑒定和保護等均具有重要意義[4]。如在金銀花[5]、菊花[6]、鳶尾[7]等觀賞植物中，基于花色特性的研究可以為其品種的界定與分類提供良好參考和理論依據(jù)?；ㄉ硇偷拿枋瞿壳拜^為客觀的測色方法有比色卡比色和儀器測色，在目測的基礎上結合比色卡，對于常規(guī)的花色分類和描述已經(jīng)足夠。而要獲得更為科學的定量數(shù)據(jù)，則需要在定性分析花色后，進一步結合使用儀器測色[8]，從而使花色的表型描述更加可靠。更深入的研究表明，植物花色與花色素的種類和含量密切相關，且已經(jīng)證實，植物花色素主要分為類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿三類，其中類黃酮和類胡蘿卜素廣泛分布于各種植物中，而生物堿類色素主要為甜菜堿，其只存在于石竹目植物中，不能與類黃酮化合物共存[9—11]?；ㄉ彩前珷颗５闹匾^賞性狀和育種目標，每年都有不同花色的新品種產(chǎn)生以適應市場需求。對花色進行科學描述，并分析影響花色呈現(xiàn)的色素種類及含量對矮牽牛的育種實踐和推廣應用有重要意義。目前對矮牽牛花色和花色素的定量研究并不多見，實踐和現(xiàn)有文獻描述矮牽?；ㄉ珪r多采用最簡單的目測法，如楊翅春等[12]在觀察矮牽?；ㄉ硇蜁r用紫色、白色和淺紫色描述；也有研究對矮牽牛進行了初步的花色素類型鑒定和含量的測定，但僅測定了花色苷的含量[13—14]，從花色素類型及含量上來看并不能全面反映影響矮牽牛花色豐富的呈色原因。

本研究以上海交通大學自育的 27個矮牽牛新種質為研究材料，用英國皇家園藝學會比色卡(Royal Horticultural Society Color Chart，RHSCC)和色差儀描述了矮牽?；ㄉ硇?，通過特征顯色反應初步判斷矮牽牛的花色素類型，進一步用標準曲線法和 pH示差法等方法測定典型矮牽牛品種中花色素的含量，對矮牽牛花色表型及花色素種類、含量進行較為系統(tǒng)的分析研究，為后續(xù)量化評價矮牽?；ㄉ?、新品種鑒定與分類以及基于花色的育種工作等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的 27個矮牽牛材料是上海交通大學花卉課題組培育的品種或組合，均為雜交F1代，其組合編號和品種名見表1，其中浦江系列品種為上海市認定品種。

表1 矮牽牛的組合編號與品種名Table 1 Combination numbers and cultivar names of Petunia hybrida

1.2 方法

在晴天的上午，從上海交通大學七寶校區(qū)矮牽牛課題組基地采集材料。從各個矮牽牛種質的多個植株上隨機采集盛花期花朵若干，立即帶回室內(nèi)拍攝花朵照片和測定花色表型，其余材料放入4 ℃冰箱保存，用于花色素定性和定量分析。

1.2.1 矮牽?；ㄉ硇偷臏y定

用比色卡比色和色差儀測色法分別描述各種質的花色表型。在無陽光直射處將每個種質的花瓣顏色與 RHSCC對比，記錄最接近顏色的代碼作為該種質花色 RHSCC編號。用每個種質的花瓣中間部分對準色差儀(SC-10手持式色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司)的集光孔測量花色的亮度 L*值、紅綠色度a*值和黃青色度b*值，重復測定10次，并計算花色的彩度C*值和色相角h值。

1.2.2 矮牽?；ㄉ仡愋偷亩ㄐ詼y試

將矮牽牛新鮮花朵去除花冠筒，稱取0.10 g花冠放入研缽中，加入5 mL石油醚、10%鹽酸和25～28%氨水，快速研成勻漿，過濾后觀察液體顏色[15]，每份材料重復3次，記錄并拍照。根據(jù)特征顯色反應顯色情況判斷花瓣中是否含有類胡蘿卜素和類黃酮兩類色素，比較不同色系矮牽牛所含花色素類型的異同。

1.2.3 矮牽?；ㄉ睾康臏y定

結合特征顯色反應結果和矮牽牛的生長表現(xiàn)，選出后續(xù)測定花瓣中類胡蘿卜素、類黃酮和花色苷三類色素含量的矮牽牛代表種質。測定花色素含量時設置3個生物學重復，取3次測量的平均值作為最終含量。

根據(jù)電泳的定量結果，使用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行檢測定量，之后根據(jù)樣本的測序量要求進行相應比例的混合。

花瓣類胡蘿卜素的提取和含量測定參考任玉鋒等和甘林鑫等的方法[16—17]。花瓣類黃酮和花色苷的提取參考段晶晶的方法[18]略有改動。采用標準曲線法測定矮牽?；ò曛蓄慄S酮含量[18]。采用 pH示差法測定矮牽牛花瓣中花色苷含量[19—20]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel軟件處理矮牽?；ㄉ突ㄉ睾繑?shù)據(jù)，使用IBM SPSS Statistics軟件分析矮牽牛3類花色素含量的差異顯著性，使用Origin 2021b軟件進行線性擬合，并繪制Rutin標準曲線、矮牽?；ㄉ植技?類花色素含量圖。

2 結果與分析

2.1 矮牽?；ㄉ硇?/h3>

根據(jù)目測法與RSHCC比色，將27個矮牽牛種質的花色分別歸為5個色系：紫色系、紫紅色系、紅色系、黃色系和白色系(圖1，表2)。統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，所測矮牽牛種質中，花色以紫紅色和紅色為主，分別包含11和10個種質，而白色、紫色和黃色較少，分別只有3、2和1個種質。

圖1 27個矮牽牛種質的花部表型Fig. 1 The flower phenotype of 27 petunia germplasms

表2 矮牽?；ㄉ祫澐諸able 2 Division of the petunia flower color

27個矮牽牛種質RHSCC比色和色差儀測色的統(tǒng)計結果見表3，表中每個種質的花色L*、a*、b*、C*和h值分別為10次測量結果的平均值。

表3 27個矮牽牛種質的花色測定結果Table 3 Flower color determination of 27 petunia germplasms

(續(xù)表)

由表3可知，矮牽牛的花色在CIELab表色系統(tǒng)中分布較廣，5個色系的樣本在花色參數(shù)上數(shù)值存在明顯的規(guī)律。統(tǒng)計27個種質的花色L*、a*、b*、C*和 h值的變化范圍(極差)、平均值、標準差和變異系數(shù)，(表3)。從變異系數(shù)上來看，b*和h值高達662.30%和325.96%，遠遠大于L*、a*和C*值的變異系數(shù)(＜55%)，可見矮牽?；ㄉ赽*和h值的變化遠比L*、a*和C*值豐富。

按色系繪制矮牽牛花色 L*、a*與 b*值的分布圖，如圖2所示。5個色系中，白色系花色亮度(L*)最高，其次為黃色系、紅色系、紫紅色系，亮度最低的是紫色系。花色紅綠色度(a*)從高到低依次為紫紅色系、紅色系、紫色系、黃色系和白色系，說明按照該順序這些色系花色中的紅色減少、綠色增加，除紫色系外其余4個色系的花色均偏紅，紫色系花色 a*值變化大。花色黃青色度(b*)最高是黃色系，然后依次為紅色系、白色系、紫色系和紫紅色系，說明這些色系花色中的黃色依次減少、而藍色增加，因此黃色系、紅色系和白色系的花色偏黃，紫紅色系的花色偏藍，但紫色系各種質間的花色b*值變化大，其中有2個種質與其他種質b*值差異較大，此外，紅色系中也有1個種質與其他種質差異較大。

圖2 5個矮牽牛色系的花色L*、a*和b*值分布圖Fig. 2 Distribution of L*，a* and b* values of flower color in five series of Petunia hybrida

27個種質的花色 a*與 b*值的二維分布圖見圖3。矮牽牛花色分布比較廣泛，在第一、二和四象限均有分布。5個色系的 a*、b*值區(qū)分比較明顯，紅色系和紫紅色系之間相互有少量重疊部分。白色系分布最集中，紅色系其次，紫紅色系分布大多數(shù)比較集中，只有2個種質分散在紅色系中，紫色系分布最分散。紅色系和白色系只分布在第一象限，紫紅色系分布在第一和四象限而且集中分布在第四象限，紫色系分布在第二和四象限。

圖3 27個矮牽牛種質的花色a*與b*值二維分布圖Fig. 3 Two dimensional distribution of flower color a* and b* values of 27 petunia germplasms

27個矮牽牛種質的花色 L*、a*與 b*值的三維分布圖見圖4?？梢灾庇^地看出，矮牽?；ㄉ植驾^為分散，不同色系花色差異較大。坐標系中從L*軸頂部到底部依次為白色系、黃色系、紅色系、紫紅色系和紫色系，說明花色越淺亮度越高。

圖4 27個矮牽牛種質的花色CIEL*a*b*分布圖Fig. 4 CIEL*a*b* distribution of 27 petunia flower

2.2 矮牽?；ㄉ仡愋偷蔫b定

通過特征顯色反應初步確定矮牽?；ò曛兴纳胤N類，結果如表4。

表4 27個矮牽牛種質的類胡蘿卜素、類黃酮及花色苷顯色反應Table 4 Carotenoids、flavonoids and anthocyanins color reaction of 27 Petunia hybrida germplasms

(續(xù)表)

在類胡蘿卜素特征顯色反應中，27個矮牽牛種質表現(xiàn)出無色或淺黃色。其中，紫色系、白色系和黃色系種質均表現(xiàn)為淺黃色，說明這3個色系花瓣可能含有少量類胡蘿卜素；紫紅色系和紅色系15個呈無色，說明這些種質花瓣中不含或含極少胡蘿卜素；還有6個種質顯現(xiàn)淺黃色，可能含有少量類胡蘿卜素(表4)。

從類黃酮特征顯色反應結果可以發(fā)現(xiàn)，27個矮牽牛種質均表現(xiàn)為不同深淺的黃色，說明其花瓣中均都含有類黃酮成分。其中，白色系和黃色系種質均顯淺黃色，紫色系種質均顯深黃色，紫紅色系和紅色系中則深淺黃色均有(表4)。可見，不同種質花瓣所含類黃酮的種類或含量可能不同，從而影響其花色呈現(xiàn)。

花色苷特征顯色反應表明，白色系和黃色系種質均呈淺色，說明它們含有極少量花色苷；紫紅色系和紫色系種質均呈深色，說明其花瓣中應該都含有花色苷；紅色系除了一個種質(1479)呈淺色之外其余均呈深色，可見紅色系種質絕大多數(shù)含有花色苷(表4)。各個種質顯現(xiàn)的顏色不同，意味著其花瓣所含花色苷的種類或含量可能不同。

綜上，在5個矮牽牛色系中，白色系和黃色系花瓣中含有類黃酮、少量類胡蘿卜素(淺黃色)和極少量花色苷(淺色)；紫紅色系和絕大多數(shù)紅色系種質花瓣中含有類黃酮和花色苷，多數(shù)不含或含極少量(無色)類胡蘿卜素；紫色系花瓣中含有類黃酮、花色苷和少量類胡蘿卜素。

2.3 矮牽?；ò曛谢ㄉ睾糠治?/h3>

2.3.1 類胡蘿卜素

根據(jù)顯色情況，從顯色的各色系中選取生長表現(xiàn)較好的典型種質進行類胡蘿卜素含量測定，分別包括紫色系、白色系和黃色系各1個，紫紅色系和紅色系中各2個，共7個種質，其組合編號及花瓣類胡蘿卜素含量如圖5所示。測定結果表明：7個種質的花瓣類胡蘿卜素含量在 0.004～0.216 mg·g-1FW之間，多數(shù)在0.02 mg·g-1FW左右，整體看含量均在較低水平。比較不同矮牽牛種質的花瓣類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)種質之間的差異很大。7個被測種質中，最高值在紅色系種質1511中檢測到，相當于含量最低種質(1502，白色)的52.8倍，其余5個種質的含量均低于0.03 mg·g-1FW。

圖5 7個矮牽牛種質的花瓣類胡蘿卜素含量Fig. 5 Carotenoid content in petals of 7 Petunia hybrida germplasms

2.3.2 類黃酮

根據(jù)顯色情況結合生長狀況，選取了13個矮牽牛代表種質進行花瓣類黃酮含量的測定。以槲皮素3-O-蕓香糖苷(Quercetin 3-O-rutinoside，簡稱Rutin)標準溶液濃度(C)為x軸、波長350 nm下吸光度值(A)為y軸繪制的標準曲線，其R2值達到統(tǒng)計學要求，因此，用于樣品中類黃酮含量的計算。

矮牽?；ò觐慄S酮含量結果如圖6所示，13個種質的花瓣中類黃酮含量在2.5～12.2 mg·g-1FW之間，絕對值均遠遠大于類胡蘿卜素含量，可見這些種質花瓣中均含有較高的類黃酮。但比較發(fā)現(xiàn)，其含量高低與顯色反應中顏色深淺程度并沒有直接對應關系，這可能與花瓣中類黃酮種類如花色苷有關。類黃酮含量在不同種質間的差異明顯，13個被測種質中，含量最高的種質(1451)是最低種質(1511)的近5倍。從色系來看，黃色系類黃酮含量最高，紫色系和白色系其次，除白色 1502外，含量均在10 mg·g-1FW 左右；紫紅色系 2個種質在 4.2～5.1 mg·g-1FW 之間，而紅色系最低，多數(shù)低于3 mg·g-1FW。

圖6 13個矮牽牛種質的花瓣類黃酮含量Fig. 6 Flavonoid content in petals of 13 Petunia hybrida germplasms

2.3.3 花色苷

作為一類重要的類黃酮物質，花色苷對花色的呈現(xiàn)非常重要。因此，進一步對上述13個含有類黃酮的代表種質花瓣中的花色苷含量進行了測定分析(圖7)。結果顯示，13個種質的花瓣中均檢測到花色苷，含量在0.08～3.88 mg·g-1FW之間，種質間差異非常顯著。13個被測種質中，花瓣花色苷含量最高的是紫色系種質1524，最低的是紅色系1511，兩者相差達50多倍。比較5個色系的花瓣花色苷含量，發(fā)現(xiàn)紫色系2個種質和紫紅色系2個種質的花色苷含量均在較高水平，高于1 mg·g-1FW，顯著高于紅色系、白色系和黃色系；其中，白色系和黃色系 4個種質色苷含量水平相當，均在0.2 mg·g-1FW左右；紅色系種質之間差異較大，其含量范圍為 0.08～0.67 mg·g-1FW。

圖7 13個矮牽牛種質的花瓣花色苷含量Fig. 7 Anthocyanin content in petals of 13 Petunia hybrida germplasms

3 討論

花色是很多園林植物(尤其是花卉)最為重要的觀賞性狀，傳統(tǒng)上對花色的評價多用主觀的目測法，包括前期關于矮牽牛的花色表型描述[12，14，21]。但是，由于顏色分類標準很多且人的視覺存在差異[4]，該法對花色的判定受主觀性影響較大而不盡準確。本研究采用 RHSCC比色和色差儀測色這兩種較為客觀的方法對矮牽?；ㄉ硇瓦M行系統(tǒng)描述，在定性描述花色的基礎上，進一步用CIELab系統(tǒng)對其花色進行數(shù)量化描述，基于數(shù)據(jù)建立更為科學的花色表型描述。通過唯一的RHSCC編號結合CIELab數(shù)值，既能直觀反映花色，又能將其科學量化，從而更為全面地描述矮牽牛的花色情況，為后續(xù)品種評價、鑒定以及新品種選育提供良好的科學依據(jù)。上述27個矮牽牛種質花色以紫紅色和紅色為主，紫色、白色和黃色較少，而且均為純色、單瓣種質，這與目前國內(nèi)外市場上的品種花色分布大致一樣[2]，今后可往稀少或暫未出現(xiàn)的花色、復色和重瓣方向培育更好的優(yōu)良種質，為市場提供更多選擇，營造更為優(yōu)美的園林景觀。

植物的花色主要受到類黃酮、類胡蘿卜素、甜菜素等3種色素的影響，為了更好地了解矮牽牛花色形成的生理基礎，有必要對其色素種類及含量進行系統(tǒng)分析。特征顯色反應是一種常用的判斷色素類型的快速定性方法，在小蒼蘭、蠟梅、月季和杜鵑等花色素種類定性分析時都用到這種方法[22—25]。分析表明，矮牽牛27個種質花瓣中的花色素主要是類黃酮和類胡蘿卜素兩大類，這與梁嫻和羅充的研究一致[13]。而利用顯色深淺推測花色素含量，即顏色越深說明花瓣花色苷含量越高[13]，本文的色素含量定量分析顯示這種簡單的判斷并不夠科學。

初步確定花色素類型后，選擇了部分典型種質分別測定了矮牽牛中3類花色素的含量。類胡蘿卜素是一類在自然界中廣泛分布的黃色、橙色和紅色色素[26]。在7個含有類胡蘿卜素的矮牽牛種質中，只在一個紅色種質檢測到較高含量，整體水平均很低，這與顯色反應中顯現(xiàn)的黃色很淺的現(xiàn)象是相符的。因此，定性測試和定量測定都證明了矮牽?；ò曛蓄惡}卜素含量較少，可見該色素對矮牽?；ò瓿噬挠绊憫摲浅Ｓ邢?。比較13個矮牽牛種質花瓣中的類黃酮含量，發(fā)現(xiàn)這些種質花瓣中均含有較高的類黃酮，且絕對值均遠遠大于類胡蘿卜素含量，推測矮牽牛花瓣呈色主要受到類黃酮的影響。類黃酮含量在不同種質間的差異明顯，其中黃色系類黃酮含量最高，紫色系和白色系其次，而紫紅色系和紅色系相對來說最低。作為一類重要的類黃酮，花色苷類色素對花色的呈現(xiàn)作用非常重要，是大多數(shù)花色形成的重要組成色素，廣泛存在于超過90%的被子植物中[27]。測定結果表明：13個種質的花瓣中均檢測到含有花色苷，其中紫色系和紫紅色系的花色苷含量顯著高于白色系和黃色系，紅色系則變化較大，可見紫色和紫紅色矮牽牛花瓣的呈色與花色苷密切相關，其花色苷含量占類黃酮總含量的16.7%～54.7%，尤其是紫紅色種質940-1，其花色苷占比達一半以上；而白色系和黃色系類黃酮含量普遍較高，但花色苷占比則不到4%，說明主要是其它類別的類黃酮物質在起作用。類似的結果在香雪蘭[28]和風信子[29]中也有報道，黃色和白色品種里沒有檢測到花色苷，而在紫紅色品種中則有高含量的花色苷存在于花瓣中，對其呈色起到重要作用。

矮牽?；ㄉ某尸F(xiàn)受到不同色素的影響，紫色系和紫紅色系主要受到類黃酮尤其是花色苷的影響，紅色系花色呈現(xiàn)由類黃酮和類胡蘿卜素共同作用，而白色系和黃色系的花色呈現(xiàn)則主要受花色苷以外的類黃酮物質影響。以上結果為后續(xù)從生理和分子角度揭示矮牽牛花色形成機理和指導育種實踐奠定了良好基礎。