絞股藍(lán)正常莖轉(zhuǎn)變?yōu)楦鶢钋o的形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)源激素含量變化

彭 震，朱 里，羅 慶，高建有，查滿榮，彭小列，郭惠紅，劉世彪*

(1. 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本，又名五葉參、七葉參、七葉膽等。絞股藍(lán)因主要分布于秦嶺以南地區(qū)、體內(nèi)富含絞股藍(lán)皂苷且與人參皂苷構(gòu)型相同而被譽(yù)為“南方人參”。 作為重要的藥食兩用植物，絞股藍(lán)具有抗炎、抗腫瘤、降血壓血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、保肝護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能等多種藥理功效[1—2]。自然條件下，絞股藍(lán)既有種子繁殖又有營(yíng)養(yǎng)繁殖，其營(yíng)養(yǎng)繁殖通常以地下根狀莖分蘗、匍匐莖節(jié)位形成不定根和不定芽形式產(chǎn)生新的植株。但在秋末冬初時(shí)，絞股藍(lán)藤蔓會(huì)向地面下垂生長(zhǎng)，莖端觸地后節(jié)間伸長(zhǎng)膨大，末端彎曲并鉆入土中在地下形成根狀莖，一般稱之為“珠芽”[3]。珠芽在地下分化出多個(gè)腋芽和側(cè)枝，越冬后再萌發(fā)出數(shù)株新苗，而原來(lái)的母株藤蔓則在冬季枯死[4]。對(duì)于絞股藍(lán)這種罕見(jiàn)的繁殖行為，人們通常視之為適應(yīng)冬季環(huán)境的繁殖策略。目前對(duì)于絞股藍(lán)莖端向根狀莖轉(zhuǎn)化的研究較少，楊琦[5]對(duì)根狀莖的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖學(xué)觀察，Yang等[6]對(duì)絞股藍(lán)的空中莖、膨大莖和根狀莖轉(zhuǎn)化進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定了相關(guān)差異表達(dá)基因，從分子水平闡述其形成機(jī)制。本研究觀察絞股藍(lán)莖端形成根狀莖的變化過(guò)程和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并分段測(cè)定不同轉(zhuǎn)化時(shí)期莖端部分內(nèi)源激素含量，以期為研究該特殊的莖端轉(zhuǎn)變機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

生長(zhǎng)正常的平利2號(hào)絞股藍(lán)，栽培于吉首大學(xué)種質(zhì)圃。

1.2 儀器與試劑

HM310型切片機(jī)，TG-16G臺(tái)式高速離心機(jī)，AGLIENT1290高效液相色譜儀，SCIEX-6500Qtrap(MSMS)，CHA-2氣浴恒溫?fù)u床，水浴氮吹儀，吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)和茉莉酸(JA)標(biāo)準(zhǔn)品，CNWC18 QuEChers填料，色譜級(jí)甲醇和乙腈。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)變化觀察

于2020年10月中旬至2021年4月上旬期間，連續(xù)觀察絞股藍(lán)藤蔓莖端的生長(zhǎng)方向和入土狀態(tài)，拍照并記錄各發(fā)育階段特征。于4月統(tǒng)計(jì)50枝入土母藤發(fā)育出的根狀莖體系的二級(jí)和三級(jí)腋芽或側(cè)枝數(shù)目，計(jì)算營(yíng)養(yǎng)繁殖的增殖倍數(shù)。

1.3.2 解剖學(xué)觀察

根據(jù)上述觀察將絞股藍(lán)根狀莖的形成分為三個(gè)階段：空中正常芽階段、接觸地面變態(tài)芽階段、地下根狀莖階段(圖1、圖2)。取三階段莖端材料，F(xiàn)AA固定，常規(guī)石蠟切片法制片，番紅固綠和高碘酸-希夫試劑染色[7]。

圖1 絞股藍(lán)莖端發(fā)育為根狀莖過(guò)程Fig. 1 The transition of aerial stem develop into rhizome in Gynostemma pentaphyllum

圖2 絞股藍(lán)莖端形態(tài)發(fā)育三階段及區(qū)段劃分Fig. 2 Partition of the stem apex at three stages in aerial stem-to-rhizome transition in Gynostemma pentaphyllum

1.3.3 激素含量測(cè)定

1.3.3.1 樣品采集

將圖2中變態(tài)芽和根狀莖的莖端從頂部向基部分為 4段：a為尖端段(生長(zhǎng)點(diǎn)和第 1～2莖節(jié))，b為彎曲段(第三莖節(jié)，形成彎鉤結(jié)構(gòu)鉆入土中)，c為膨大段(頂端較小，基端變大)，d為穩(wěn)定段(不再膨大)?？罩械恼Ｑ可形磁虼螅?jié)位仍按此劃分。剪取 3支相同區(qū)段的材料混合浸入液氮中，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，用于激素含量測(cè)定。3個(gè)生物學(xué)重復(fù)取平均值。

1.3.3.2 激素測(cè)定

采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)植物內(nèi)源生長(zhǎng)素 IAA、赤霉素GA3和茉莉酸JA含量。

取上述激素標(biāo)準(zhǔn)品和甲醇溶液配制終濃度為0.1～200 ng·mL-1各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液。取色譜純甲醇和超純水各900 mL，分別加入1 mL甲酸配制有機(jī)和無(wú)機(jī)流動(dòng)相。參考敖蘭吉亞等[8]的方法測(cè)定內(nèi)源激素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)根狀莖形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

2.1.1 根狀莖形成的形態(tài)變化

如圖1所示，絞股藍(lán)正常芽須經(jīng)過(guò)變態(tài)芽發(fā)育為根狀莖。正常的空中莖為綠色，葉片較大(圖1: A)，觸地后或原在地面匍匐生長(zhǎng)的莖端前兩節(jié)處從橫向生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為向地面方向生長(zhǎng)。其后芽尖下第3節(jié)發(fā)生彎曲，并由彎曲處最先鉆入土中(圖1: B～C)，第4節(jié)及以后1～2節(jié)位顯著膨大，再后節(jié)段則不膨大仍保持母藤大小(圖1: B)，這一階段為變態(tài)芽階段，既“珠芽”，其莖具彎鉤，淡綠色，葉變小，無(wú)須根。變態(tài)芽入土后，莖為黃白色，葉極小，第5節(jié)以后長(zhǎng)出須根，并分化出若干腋芽，腋芽外有鱗片葉，即為根狀莖階段(圖1: D～F)。變態(tài)莖和根狀莖上端空中母藤干枯死亡(圖1: F)。根狀莖多個(gè)側(cè)芽在來(lái)春3～4月萌發(fā)成幼苗(圖1: F)。

絞股藍(lán)根狀莖的增殖能力較強(qiáng)，1枝入土后的母藤莖端經(jīng)根狀莖可發(fā)育出多個(gè)二級(jí)和三級(jí)側(cè)芽或側(cè)枝。統(tǒng)計(jì)50個(gè)入土莖端，其中發(fā)育出1芽(枝)的有 19個(gè)(占總數(shù) 38%)，2芽(枝)和 3芽(枝)的各 12個(gè)(24%)，4 芽(枝)的 2 個(gè)(4%)，5 芽(枝)的 4 個(gè)(8%)，5芽(枝)以上的1個(gè)(2%)，新芽的增殖倍數(shù)平均2.28，即1枝母藤越冬后可長(zhǎng)出2.28株幼苗。

2.1.2 根狀莖形成中的結(jié)構(gòu)特征

絞股藍(lán)正常莖端形成根狀莖的過(guò)程可典型地分為三個(gè)階段：正常芽、變態(tài)芽、根狀莖(圖2)，各階段的主要結(jié)構(gòu)特征如圖3所示。

絞股藍(lán)的正常莖、變態(tài)莖和根狀莖的組織結(jié)構(gòu)相似，均具有葫蘆科植物的基本特征。最外為一層表皮細(xì)胞，向內(nèi)為數(shù)層體積較大的皮層細(xì)胞，其內(nèi)皮層細(xì)胞為一圈淀粉鞘，再內(nèi)為內(nèi)外兩輪9～10個(gè)雙韌維管束，維管束之間為髓射線，中央為髓(圖3:A～C)。但正常莖具 5個(gè)棱槽，凸起的棱內(nèi)有發(fā)達(dá)的厚角組織(圖3: A)，而變態(tài)莖和根狀莖為圓形，厚角組織不發(fā)達(dá)。正常莖的淀粉鞘內(nèi)具有較少的淀粉粒(平均粒徑 1.89 μm)，髓中有少量淀粉粒(圖3: A)。變態(tài)莖淀粉鞘細(xì)胞內(nèi)有多數(shù)較小淀粉粒(平均粒徑2.25 μm)，淀粉粒位于細(xì)胞下端，表現(xiàn)為向重力沉降現(xiàn)象(圖3: C)，其髓和髓射線細(xì)胞具有豐富而較大的淀粉粒(髓射線內(nèi)平均粒徑5.56 μm，髓中9 μm，圖3: B)。根狀莖的淀粉粒積累部位與變態(tài)莖相同，但髓中淀粉粒體積更大(平均粒徑 10.56 μm，圖3:D)。在根狀莖尖彎曲段細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)淀粉粒積累(圖3:E)，但在彎曲段基端的膨大段，細(xì)胞體積增大且髓中具淀粉粒，而在彎曲段頂端的芽尖段，細(xì)胞體積較小且細(xì)胞核染色較深，無(wú)淀粉粒積累(圖3: F)。

圖3 絞股藍(lán)變態(tài)莖和根狀莖的結(jié)構(gòu)特征Fig. 3 Structure traits of modified stem and rhizome in Gynostemma pentaphyllum

2.2 絞股藍(lán)根狀莖形成中的內(nèi)源激素含量變化

測(cè)定圖2中根狀莖發(fā)育三個(gè)階段四個(gè)部位的生長(zhǎng)素IAA、赤霉素GA3和茉莉酸JA含量變化。由圖4可見(jiàn)，激素對(duì)絞股藍(lán)不同時(shí)期和不同節(jié)段莖端的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。從發(fā)育階段看，正常莖端的生長(zhǎng)素、赤霉素和茉莉酸含量均為最高，變態(tài)莖端次之，根狀莖最低，反映了入土前的正常莖處于活躍的生長(zhǎng)期，需大量激素促成，而入土后根狀莖處于休眠半休眠狀態(tài)，生理活動(dòng)受抑制，激素含量較低。

圖4 絞股藍(lán)根狀莖形成階段中莖尖各節(jié)段的激素含量Fig. 4 Phytohormone contents in 4 parts of stem apex during rhizome formation in Gynostemma pentaphyllum

從莖端部位看，三種激素含量從芽尖段、彎曲段、膨大段至穩(wěn)定段總體表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)。生長(zhǎng)素含量變化在正常莖表現(xiàn)為“升–降–升”，在變態(tài)莖表現(xiàn)為“升–升–降”，在根狀莖則為“升–降–降”，赤霉素含量在正常莖和變態(tài)莖中的變化趨勢(shì)與生長(zhǎng)素相同，波動(dòng)幅度更大，而在根狀莖表現(xiàn)為“降–升–降”趨勢(shì)但幅度較??；茉莉酸含量在正常莖表現(xiàn)為“升–升–降”且最終含量顯著高于芽尖，在變態(tài)莖表現(xiàn)為“升–升–降”但幅度較小，在根狀莖表現(xiàn)為較小的“升–降–降”趨勢(shì)。生長(zhǎng)素、赤霉素和茉莉酸在變態(tài)莖中的變化規(guī)律相似，茉莉酸在正常莖、變態(tài)莖和根狀莖中的變化規(guī)律相似。總體來(lái)看，生長(zhǎng)素、赤霉素和茉莉酸在變態(tài)莖的彎曲段含量明顯升高，在膨大段達(dá)最高值，說(shuō)明三者共同調(diào)控變態(tài)莖的彎曲和膨大生長(zhǎng)；生長(zhǎng)素在根狀莖的彎曲段升至最高而赤霉素和茉莉酸含量在各節(jié)段變化不顯著，說(shuō)明生長(zhǎng)素在根狀莖的彎曲生長(zhǎng)中發(fā)揮主要作用。

3 討論

根狀莖是生長(zhǎng)于地下但仍具有莖的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征的變態(tài)莖。根狀莖通常來(lái)源于植株莖基部的不定芽或越冬芽，或?qū)嵣缱尤~腋芽和真葉腋芽[7]。絞股藍(lán)種子實(shí)生苗不能直接形成根狀莖，只能由原來(lái)的根狀莖增殖或越冬前由藤蔓莖端入土形成根狀莖，而后者在植物界中較為罕見(jiàn)，正如本文所示。絞股藍(lán)變態(tài)莖和根狀莖的解剖結(jié)構(gòu)與正常莖相似，但它們的髓細(xì)胞體積明顯增大，且正常莖只有淀粉鞘細(xì)胞積累淀粉粒，而變態(tài)莖和根狀莖的淀粉鞘、髓和髓射線細(xì)胞中均可積累大量淀粉粒，且體積較大，這與前人的觀察結(jié)果相一致[5]。根狀莖是碳水化合物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水的儲(chǔ)藏器官，淀粉作為重要的儲(chǔ)藏成分，南荻根狀莖的淀粉在11月中旬成熟期達(dá)最大值，在5月?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛期具最小值，與可溶性糖含量正好相反[8]。絞股藍(lán)秋冬季淀粉粒的積累有利于根狀莖的增粗，與其越冬的生理功能相適應(yīng)。作為多年生草質(zhì)藤本，絞股藍(lán)地上部分在冬季枯萎死亡，但莖端在地下形成根狀莖的同時(shí)，分化出2.28倍的新芽，開(kāi)春后形成多株新苗。因此，根狀莖的形成又是一套營(yíng)養(yǎng)繁殖再生系統(tǒng)的構(gòu)建，這一在與環(huán)境長(zhǎng)期互動(dòng)中發(fā)展起來(lái)的靈活的繁衍策略，極大地提高了物種的生存力和成苗率，提高了種群數(shù)量，生產(chǎn)中則可用于保持品種的優(yōu)良性狀和種苗擴(kuò)增。

根狀莖的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程，由不同的內(nèi)源物質(zhì)和環(huán)境因子等誘導(dǎo)發(fā)生。絞股藍(lán)在發(fā)育為變態(tài)莖之時(shí)，莖前端形成彎鉤結(jié)構(gòu)，使其在鉆入土中時(shí)免受土壤損傷，這與雙子葉植物種子幼苗出土?xí)r的下胚軸頂端部位因土壤壓力而發(fā)生的“頂端彎鉤”結(jié)構(gòu)極為類似[9]，只不過(guò)絞股藍(lán)是入土而幼苗是出土，其目的都是通過(guò)影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸導(dǎo)致其沿重力刺激方向的不對(duì)稱分布，從而造成重力反應(yīng)器官的不對(duì)稱生長(zhǎng)。生長(zhǎng)素與根狀莖的膨大緊密相關(guān)，如蓮藕的膨大與IAA含量呈正相關(guān)關(guān)系[10]，而本研究最高的生長(zhǎng)素含量出現(xiàn)在根狀莖的彎曲段和變態(tài)莖的膨大段。絞股藍(lán)變態(tài)莖彎曲段的赤霉素含量有所上升，至膨大段增至最高，說(shuō)明它也是促成絞股藍(lán)莖端膨大的重要激素，這與較高濃度赤霉素有利于姜和馬鈴薯根狀莖膨大的結(jié)論相符[11—12]，但已經(jīng)膨大且穩(wěn)定的根狀莖赤霉素含量較低。茉莉酸在調(diào)節(jié)擬南芥(Arabidopsis thaliana)暗形態(tài)建成的過(guò)程中與光信號(hào)通路存在互作關(guān)系，它能在暗中抑制乙烯誘導(dǎo)的幼苗頂端彎鉤形成，抑制下胚軸伸長(zhǎng)并促進(jìn)子葉打開(kāi)[13—14]。絞股藍(lán)茉莉酸含量在根狀莖各節(jié)段的含量均較低且持續(xù)下降，表現(xiàn)出與幼苗出土的相反功能，以適應(yīng)入土越冬環(huán)境?？傮w來(lái)看，絞股藍(lán)的生長(zhǎng)素、赤霉素和茉莉酸含量在生理旺盛的正常莖中含量最高，在變態(tài)莖中次之，在生理活動(dòng)受抑制的根狀莖中最低。這三種激素在變態(tài)莖的彎曲段含量明顯升高，在膨大段達(dá)最高值，它們共同調(diào)控絞股藍(lán)莖端彎曲和膨大生長(zhǎng)，而生長(zhǎng)素在根狀莖彎曲段升至最高后連續(xù)下降，赤霉素和茉莉酸含量在各節(jié)段變化不顯著，說(shuō)明生長(zhǎng)素在根狀莖的彎曲生長(zhǎng)中發(fā)揮功能。

絞股藍(lán)變態(tài)莖的向地性生長(zhǎng)和細(xì)胞中淀粉粒的向重力沉降，說(shuō)明根狀莖形成也是一種向重力性轉(zhuǎn)變[15]。最近本課題組報(bào)道了編碼 YUCCA、IDD、LAZY1和ARP2/3復(fù)合體的向地性基因在絞股藍(lán)莖端轉(zhuǎn)變過(guò)程中顯著上調(diào)，其協(xié)調(diào)控制使地上莖獲得類似于根的正向地性從而向地生長(zhǎng)[6]，同時(shí)參與這一轉(zhuǎn)變的還有與苯丙烷生物合成、光周期、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝等差異基因。同時(shí)，這一轉(zhuǎn)變還與 MiR159-MYB29，miR166-ECH2/SGT-like，miR156-SPL6/13A 和 miR396-GRF5-like modules等小RNA的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)有關(guān)[16]，提示從分子水平入手將有助于對(duì)這一現(xiàn)象的深入理解。