左歸降糖解郁方通過調(diào)控SIRT1/TORC1通路增加糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度*

楊 蕙， 王宇紅， 杜 青， 柳 卓， 羅薇絮， 趙洪慶

（1湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，湖南長沙410206；3湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙410006）

臨床研究和meta 分析認為，糖尿病和抑郁癥互為患病率增加的獨立風險因素，可雙向誘發(fā)疾病發(fā)生或加重[1]。由于世界范圍內(nèi)糖尿病患者數(shù)量逐年遞增，故并發(fā)抑郁癥的概率也在逐漸升高，尤其是在中等發(fā)達及欠發(fā)達國家[2]。但是，有關(guān)該疾病的發(fā)病機制及藥物干預研究卻較少。左歸降糖解郁方是在經(jīng)典名方左歸丸的基礎上加減而成，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的降糖調(diào)脂、改善動物抑郁樣行為的作用[3]，且對外周和中樞胰島素抵抗均具有較好的調(diào)節(jié)作用[4]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）可作用于多種底物蛋白而參與調(diào)控細胞凋亡、自噬、氧化應激、炎癥等病理生理過程[5-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其可通過保護胰島β 細胞、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等參與調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)，進而抑制糖尿病及糖尿病引起的器官功能損傷，并被視為糖尿病及其并發(fā)癥治療新靶點[7-9]。在腦內(nèi)，SIRT1作為胰島素信號的重要下游，可被胰島素信號激活，并通過雷帕霉素靶蛋白復合物（target of rapamycin complex 1，TORC1）增強環(huán)磷腺苷反應元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）的轉(zhuǎn)錄功能，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neuotrophic factor，BDNF）的表達，參與神經(jīng)生長并調(diào)節(jié)神經(jīng)行為。我們的前期研究已經(jīng)明確，左歸降糖解郁方可通過增加海馬BDNF 的表達而緩解糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為[10]。但其是否通過調(diào)控SIRT1/TORC1 信號而上調(diào)BDNF 表達，尚未可知。故本文擬運用SIRT1 的激動劑和抑制劑，探究SIRT1/TORC1 信號通路與左歸降糖解郁方調(diào)控糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬BDNF表達的相關(guān)性。

材料和方法

1 實驗動物、試劑和儀器

SPF 級健康雄性SD 大鼠（190～210 g）購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0004。實驗中，動物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新實驗中心SPF 級動物房中，實驗前適應性飼養(yǎng)5 d，動物自由攝食及飲水。

左歸降糖解郁方組成為：黃芪18 g，貫葉連翹3 g，姜黃9 g，熟地黃15 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，菟絲子9 g，杜仲9 g，丹參12 g，丹皮6 g，牛膝9 g。方中各藥均購自于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，并于醫(yī)學創(chuàng)新實驗中心制備為水煎液，生藥濃度為1.14 kg/L。SRT2104和sirtinol購自MedChemExpress；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Solarbio；抗SIRT1 單克隆抗體購自Affinity Biosciences；抗TORC1、p-CREB、CREB 和BDNF 多克隆抗體購自Proteintech；抗GAPDH 多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；增強型BCA 蛋白定量試劑盒購自Absin；超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒購自新賽美生物科技有限公司；高爾基染液套裝購自Servicebio。Western blot 系統(tǒng)購自Bio-Rad；正置光學顯微鏡購自日本尼康。

2 方法

2.1 動物模型的制備及分組 動物給予2 周高脂（high-fat diet，HFD）灌胃后進行一次性STZ 尾靜脈注射（38 mg/kg），隨后再施加4 周慢性不可預知性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）形成糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型[11]。首先，將模型動物分為4 組，并設立健康對照：糖尿病并發(fā)抑郁癥模型（model-1）組、高劑量（20.52 g/kg）左歸降糖解郁方（ZJJ-H）組、中劑量（10.26 g/kg）左歸降糖解郁方（ZJJ-M）組、低劑量（5.13 g/kg）左歸降糖解郁方（ZJJL）組和對照（control）組。其次，給予糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬腦區(qū)注射SIRT1 激動劑和抑制劑干預[12]，并設立假手術(shù)對照和健康對照：SIRT1 激動劑（SRT2104）組、SIRT1抑制劑（sirtinol）組、疾病模型假手術(shù)（model-2）組和對照（control）組。最后，給予糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠高劑量左歸降糖解郁方灌胃的同時注射SIRT1 抑制劑：疾病模型假手術(shù)（model-2）組、高劑量左歸降糖解郁方（ZJJ）組和高劑量左歸降糖解郁方灌胃聯(lián)合SIRT1 抑制劑干預（ZJJ-sirtinol）組。其中，左歸降糖解郁方從CUMS 造模開始時給藥直到實驗結(jié)束，共給藥28 d；SIRT1 的激動劑（SRT2104）和抑制劑（sirtinol）均從CUMS 造模的第3周開始直到實驗結(jié)束，共給藥14 d，給藥濃度均為10 μmol/L[13]。

2.2 動物行為學檢測 本文采用懸尾實驗和強迫游泳實驗對動物的抑郁樣行為進行評價。懸尾實驗是將動物尾部懸掛于金屬掛鉤上使動物在整個實驗過程中保持倒掛。實驗一共持續(xù)3.5 min，前30 s 為適應時間，后3 min 為實驗時間。實驗過程中統(tǒng)計動物的不動時間，并進行統(tǒng)計。強迫游泳實驗是將動物置于一個高為40 cm，直徑為20 cm 的圓柱形玻璃缸內(nèi)，水位以動物伸展全身后尾部不碰觸缸底為準。實驗共持續(xù)4 min，前1 min 為適應時間，后3 min 為實驗時間。實驗以動物不動時間進行統(tǒng)計。上述兩個實驗中均保證同期實驗動物之間不可見，以減少動作干擾。

2.3 血糖檢測及胰島素抵抗評價 各組大鼠在行為學檢測結(jié)束后禁食12 h，麻醉取腹主動脈血。按照1 200 r/min 離心10 min 后取上層血漿，并按照ELISA 試劑盒說明書檢測動物空腹血糖及胰島素含量。外周胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖含量（mmol/L）×胰島素含量（mU/L）/22.5。

2.4 高爾基染色 冰上取大鼠腦組織置于固定液中固定72 h，隨后切成厚度為3 mm 的組織塊。用生理鹽水將腦組織輕輕漂洗，置于EP 管中，加入高爾基染液將腦組織完全浸沒，放置陰涼通風處避光14 d（浸泡48 h 后，換1 次新染液，之后每隔3 d 換1 次新染液，共計14 d）。將樣本取出，置于15%的蔗糖溶液中低溫避光脫水1 d，取出組織塊；再置于30%的蔗糖溶液中低溫避光脫水2 d。隨后，蒸餾水洗1 min，濃氨水（浸沒組織）處理45 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅膜定影液（浸沒組織）處理45 min，蒸餾水洗1 min。最后，將樣本置于30%的蔗糖溶液中低溫避光脫水3 d，采用OCT 包埋，并切為100 μm 的腦切片，常溫避光保存過夜后，浸入純水20 s，用濾紙擦干組織周邊多余的水分后，甘油明膠封片。攝片后采用ImageJ分析樹突棘數(shù)量。

2.5 Western blot檢測 將腦海馬樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。檢測時，將樣本置于蛋白裂解液中，并加入磷酸化酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。冰上研磨均勻后靜置2 h離心取上清，并用BCA蛋白濃度試劑盒進行蛋白定量。制備凝膠，樣本蛋白變性后上樣進行SDS-PAGE。隨后，在濕式轉(zhuǎn)膜裝置中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2 h，并分別加入抗SIRT1、TORC1、p-CREB、CREB 和BDNF 抗體稀釋液（1∶1 000），4℃過夜后洗膜并加入Ⅱ抗（1∶3 000），室溫孵育1 h。洗膜后用ECL 進行顯色。采用ImageJ 軟件對所有蛋白條帶進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0。所有指標均以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 左歸降糖解郁方降低模型大鼠血糖并改善外周胰島素抵抗

與對照組比較，模型組大鼠的血糖和外周胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，高劑量和中劑量左歸降糖解郁方組大鼠血糖和外周胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），而低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；高劑量左歸降糖解郁方對模型大鼠血糖和胰島素抵抗的改善作用要顯著優(yōu)于低劑量（P＜0.01），而中劑量對大鼠胰島素抵抗的作用優(yōu)于低劑量（P＜0.05），見表1。

2 左歸降糖解郁方減少模型大鼠的抑郁樣行為

與對照組比較，模型組大鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中的不動時間均明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量左歸降糖解郁方可顯著減少大鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中的不動時間（P＜0.01）；而中劑量組大鼠在懸尾實驗中的不動實驗明顯縮短（P＜0.05），但在強迫游泳實驗中差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；與對照組比較，低劑量組大鼠在行為學實驗中的差異未見統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；高劑量左歸降糖解郁方對大鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間的改善作用明顯優(yōu)于低劑量（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠血糖、胰島素抵抗指數(shù)和抑郁樣行為的影響Table 1. Effect of Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on blood glucose，insulin resistance and depression-like behaviors of the diabetic rats with depression（Mean±SEM. n=8）

3 左歸降糖解郁方增加模型大鼠海馬的樹突棘密度

與對照組比較，模型組大鼠海馬樹突棘密度顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量和中劑量左歸降糖解郁方組大鼠的樹突棘密度顯著增加（P＜0.01），而低劑量左歸降糖解郁方則對模型大鼠海馬樹突棘密度沒有顯著性影響（P＞0.05）；與低劑量左歸降糖解郁方組比較，高劑量組和中劑量組海馬樹突棘密度的增加更為顯著（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1。

Figure 1. Effect of Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on spine density of hippocampal neurons in diabetic rats with depression（scale bar=50 μm）. Mean±SEM. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs model-1 group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs ZJJ-L group.圖1 左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬樹突棘密度的影響

4 左歸降糖解郁方對SIRT1/TORC1 信號的調(diào)節(jié)作用

與對照組比較，模型組大鼠海馬SIRT1 和TORC1 的表達均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量左歸降糖解郁方可顯著升高模型大鼠海馬SIRT1 和TORC1 的表達（P＜0.01），中劑量僅顯著上調(diào)海馬SIRT1 的表達（P＜0.05），而低劑量對上述蛋白則無顯著的調(diào)節(jié)作用（P＞0.05）；高劑量左歸降糖解郁方對SIRT1/TORC1信號的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于低劑量（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

5 激活SIRT1/TORC1 信號增強神經(jīng)營養(yǎng)因子表達及樹突棘密度

與模型組比較，SIRT1 激動劑可顯著提高海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平（P＜0.05 或P＜0.01）；SIRT1 抑制劑可顯著降低海馬BDNF 的表達（P＜0.01），但對TORC1 和p-CREB 蛋白水平無顯著影響（P＞0.05）；與SIRT1 抑制劑比較，SIRT1 激動劑可顯著提高TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平（P＜0.01）；與模型組比較，SIRT1 激動劑可顯著增加模型大鼠海馬樹突棘密度（P＜0.01），而其抑制劑對樹突棘密度未見顯著影響（P＞0.01）；與SIRT1 抑制劑比較，其激動劑可顯著增加海馬樹突棘的密度（P＜0.05），見圖3。

6 左歸降糖解郁方調(diào)控SIRT1/TORC1 信號增強神經(jīng)營養(yǎng)作用及樹突棘密度

Figure 2. Effect of Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on SIRT1/TORC1 signaling pathway in hippocampus of diabetic rats with depression. Mean±SEM. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model-1 group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs ZJJ-L group.圖2 左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬SIRT1/TORC1信號的影響

Figure 3. Effects of the SIRT1 activator and inhibitor on neurotrophy and spine density of hippocampal neurons in diabetic rats with depression. A：the protein levels of TORC1，p-CREB and BDNF in the hippocampus；B：the spine density of hippocampal neurons（scale bar=50 μm）. Mean±SEM. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model-2 group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs sirtinol group.圖3 SIRT1激動劑和抑制劑對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)營養(yǎng)和樹突棘的作用

與模型組比較，高劑量左歸降糖解郁方可顯著提高模型大鼠海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平及樹突棘密度（P＜0.05或P＜0.01）；與高劑量左歸降糖解郁方組比較，SIRT1 抑制劑可顯著減弱左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平及樹突棘密度的提高作用（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of the Zuogui-Jiangtang-Jieyu decoction（ZJJ）on neurotrophy and spine density of hippocampal neurons via SIRT1/TORC1 signaling pathway. A：the protein levels of TORC1，p-CREB and BDNFin the hippocampus；B：the spine density of hippocampal neurons（scale bar=50 μm）. Mean±SEM. n=4. #P＜0.05，##P＜0.01 vs model-2 group；&P＜0.05 vs ZJJ group.圖4 左歸降糖解郁方調(diào)控SIRT1/TORC1信號改善神經(jīng)營養(yǎng)和海馬樹突棘密度

討論

本實驗所用復方左歸降糖解郁方是依據(jù)糖尿病并發(fā)抑郁癥的“虛、淤、郁”中醫(yī)病機[14]，以疏肝解郁、活血化瘀為治法，在經(jīng)典名方左歸丸的基礎上加減而得。方中熟地為君，滋養(yǎng)腎陰；山茱萸和枸杞為臣，合君藥以加強滋補腎陰作用；佐以菟絲子、牛膝和杜仲補肝腎，黃芪健脾益氣，丹參和丹皮活血散瘀，姜黃和貫葉連翹化瘀行氣、疏肝解郁。全方共奏疏肝解郁、活血化瘀之功效。實驗可見，左歸降糖解郁方可有效降低糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠外周血糖并減輕胰島素抵抗，同時在經(jīng)典的動物抑郁行為評價實驗——懸尾實驗和強迫游泳實驗中均可見左歸降糖解郁方的抗抑郁作用。上述結(jié)果與之前的研究保持一致[15]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可有效改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元的胰島素信號，從而改善細胞供能[4]。事實上，胰島素信號在腦內(nèi)不僅調(diào)節(jié)神經(jīng)元的能量代謝，還可通過影響神經(jīng)元樹突的形成和生長，參與調(diào)節(jié)動物的神經(jīng)行為。我們通過Golgi-Cox 染色研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬樹突棘密度顯著降低，高劑量和中劑量左歸降糖解郁方均明顯減輕海馬的上述損傷。由于樹突棘密度改變可直接影響突觸的傳遞功能，而海馬中樹突棘密度降低所導致的突觸可塑性下降又與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[16-17]。因此推測，左歸降糖解郁方減少糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為可能與其調(diào)控樹突棘密度相關(guān)。

近年來，腦胰島素抵抗被認為是糖尿病和抑郁癥之間的重要聯(lián)系，且以胰島素信號異常為主要表現(xiàn)形式[18]。已有較多研究表明，腦胰島素信號異?？蓪е潞ｑR樹突棘密度降低、數(shù)量減少等形態(tài)損傷，并引發(fā)抑郁樣行為和學習記憶減退等表現(xiàn)[19]，但其分子機制尚未完全清楚。SIRT1 是胰島素信號的重要下游分子，同時也是最新發(fā)現(xiàn)的抑郁癥靶標[20]。當腦內(nèi)發(fā)生胰島素抵抗時，胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）酪氨酸位點磷酸化水平降低，可通過下調(diào)AMPK活性導致SIRT1的脫乙酰能力被抑制，從而使SIRT1 介導TORC1 固定位點的賴氨酸殘基脫乙?；?，SIRT1/TORC1 信號通路被抑制[21]。本研究中，左歸降糖解郁方可顯著升高糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬中下調(diào)的SIRT1 和TORC1 蛋白水平，提示了其對SIRT1/TORC1 信號通路的調(diào)節(jié)作用。此外，由于SIRT1基因敲除小鼠海馬可見突觸可塑性降低及樹突分支減少，并被認為與SIRT1 蛋白的催化活性缺失有關(guān)[22]，故進一步推測，左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬樹突棘的改善作用可能與其調(diào)節(jié)SIRT1/TORC1信號通路有關(guān)。事實上，也有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1 可通過調(diào)節(jié)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）表達影響慢性應激大鼠的抑郁樣行為[13]，或是通過干預過氧化物酶增殖體激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）的脫乙?；绊懮窠?jīng)元的谷氨酸毒性，進而導致抑郁樣行為的發(fā)生[23]。故左歸降糖解郁方調(diào)節(jié)SIRT1 蛋白、減少糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為的下游分子機制值得進一步研究。

神經(jīng)營養(yǎng)對于樹突棘的生長非常重要，研究發(fā)現(xiàn)BDNF 可促進樹突棘的增加。而TORC1 作為一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，可通過增強CREB 的轉(zhuǎn)錄功能，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 的表達[24]。在本研究中，我們對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠分別注射了SIRT1 的激動劑和抑制劑。結(jié)果顯示，SIRT1 激動劑可顯著提高疾病模型大鼠海馬中TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平，且顯著增加海馬樹突棘密度，即激活糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1信號可通過增強神經(jīng)營養(yǎng)而提高樹突棘的密度；而SIRT1 抑制劑對模型大鼠海馬樹突棘密度及TORC1 和p-CREB 蛋白水平無顯著影響。推測造成上述結(jié)果的原因可能是糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠本身就存在海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白的顯著下調(diào)和樹突棘密度的降低，導致抑制劑的作用在疾病背景下不能表現(xiàn)出來。而該推測可進一步通過研究SIRT1 抑制劑對正常大鼠的影響進行驗證。

為進一步研究左歸降糖解郁方調(diào)控SIRT1/TORC1信號通路影響海馬樹突棘的分子機制。本實驗選擇了對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1信號通路作用最顯著的高劑量左歸降糖解郁方進行研究。與高劑量左歸降糖解郁方干預的單一措施相比，SIRT1 抑制劑可顯著減弱高劑量左歸降糖解郁方對大鼠海馬TORC1、p-CREB 和BDNF 蛋白水平及樹突棘密度的提高作用。該結(jié)果進一步明確了左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1 信號的作用，同時提示其可能通過調(diào)控SIRT1/TORC1 信號通路而增強海馬BDNF 的表達。

綜上所述，本研究認為左歸降糖解郁方可干預糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬SIRT1/TORC1 信號通路，并可能通過增強海馬神經(jīng)營養(yǎng)而提高神經(jīng)元的樹突棘密度，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。