固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大豆油中126 種農(nóng)藥殘留

汪春明, 張 洋, 王東斌, 施鵬斐, 楊 波

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 綜合檢測(cè)中心，北京 100123)

為了更有效地規(guī)范食用植物油中農(nóng)藥殘留限量，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織 (FAO)、世界衛(wèi)生組織 (WHO)、歐盟、日本、美國(guó)等國(guó)家或組織都有農(nóng)藥殘留限量的規(guī)定，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)食用植物油中農(nóng)藥殘留的限量也有明文規(guī)定[1-2]。大豆油中農(nóng)藥殘留檢測(cè)之關(guān)鍵在于高含量的甘油及親脂性干擾物的存在，脂質(zhì)類干擾物會(huì)在色譜柱和儀器中積聚，從而縮短色譜柱及儀器的使用壽命[3]；此外，由于離子抑制從而導(dǎo)致被分析物靈敏度下降，現(xiàn)有的檢測(cè)方法在去除油脂的同時(shí)會(huì)損耗一部分目標(biāo)物。為了兼顧除去油脂和提高目標(biāo)物回收率，本研究選擇增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱，對(duì)比傳統(tǒng)的固相萃取柱，以驗(yàn)證其在大豆油農(nóng)藥殘留分析中的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 9000-7000 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；HP-5MS UI 氣相色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)(美國(guó)Agilent 公司)；SR-2DS 振蕩器 (日本TAITEC 公司)；移液槍 (德國(guó)Eppendorf 公司)；EVA50A 氮吹儀 (中國(guó)普立泰科公司)；CR21N 離心機(jī) (日本HITACHI 公司)；VORTEX GENIE 2 渦旋混勻器 (美國(guó)Scientific Industries 公司)；XS105&PL303 分析天平 (瑞士METTLER TOLEDO公司)；VISIPREP DL 固相萃取裝置 (美國(guó)SUPELCO公司)；Milli-Q 超純水系統(tǒng) (美國(guó)Millipore 公司)。

126 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 (見(jiàn)表1，純度 ≥ 95%，Dr Ehrenstorfer，德國(guó))；正己烷、乙腈和乙酸乙酯(色譜純，美國(guó)Fisher 公司)；氯化鈉 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；試驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水；Agilent Bond Elut 弗羅里硅土固相萃取柱 (FL，1 g，6 mL)；Agela 中性氧化鋁固相萃取柱 (AL-N，1 g，6 mL)；Waters Oasis HLB 固相萃取柱 (150 mg，6 mL)；Agilent 增強(qiáng)型脂質(zhì)去除固相萃取柱 (Captiva EMR-Lipid，1 g，6 mL)；Waters Oasis PRiME HLB 固相萃取柱 (60 mg，3 mL)；Waters Oasis PRiME HLB Short 固相萃取柱 (335 mg)；Supelclean 硅膠固相萃取柱 (LC-Si，1 g，6 mL)；Supelclean C18固相萃取柱 (ENVI-18，1 g，6 mL)；Agela Cleanert PEP 固相萃取柱 (200 mg，3 mL)。

試驗(yàn)樣品來(lái)源：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心樣品間。

1.2 樣品前處理

稱取5 g 樣品，以10 mL 用乙腈飽和的正己烷溶解并輕輕搖勻，加入10 mL 用正己烷飽和的乙腈，振蕩10 min 后于 -5 ℃、20 000 r/min 下離心5 min；取下層乙腈相于50 mL 離心管中，以10 mL正己烷飽和的乙腈振蕩提取10 min 后于-5 ℃、20 000 r/min 下離心5 min；合并兩次提取液，混勻；取6 mL 乙腈提取溶液，加入1.5 mL 一級(jí)水混勻，分兩次全部轉(zhuǎn)移到Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱中 (事先分別用5 mL 乙腈、5 mL 一級(jí)水活化)，Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱下接內(nèi)含1.0 g氯化鈉的15 mL 離心管，當(dāng)待測(cè)物流至近干后用吸耳球吹干；流出液 (約7.5 mL) 渦旋30 s，靜置分層；取4 mL 上層乙腈溶液，于40 ℃下氮?dú)獯抵两?，?.0 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 分別準(zhǔn)確稱取不低于10 mg各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用丙酮溶解并定容，得到適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 按照農(nóng)藥的性質(zhì)和保留時(shí)間，將126 種農(nóng)藥分為A、B 兩組，詳見(jiàn)表1。準(zhǔn)確吸取合適的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，得到10 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，之后再逐級(jí)稀釋為1.0 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確吸取適量1.0 mg/L各農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.003、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。選擇不含目標(biāo)農(nóng)藥的大豆空白樣品，按1.2 步驟處理得到空白基質(zhì)溶液。取1 mL 空白基質(zhì)溶液用氮?dú)獯蹈?，分別準(zhǔn)確加入 1 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，即得到系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

表1 126 種農(nóng)藥保留時(shí)間及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table1 Retention time and GC-MS/MS detection parameters of 126 pesticides

續(xù)表 1Table1 (Continued)

續(xù)表 1Table1 (Continued)

1.4 檢測(cè)條件

氣相色譜條件：初始溫度60 ℃，保持1.0 min，以40 ℃/min 升至170 ℃不保持，以10 ℃/min 升至310 ℃保持3.0 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；電子能量70 eV；接口溫度為280 ℃；離子源溫度為280 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲3.0 min；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)，定量定性離子對(duì)及碰撞能量見(jiàn)表1。

1.5 添加回收試驗(yàn)

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[1]中規(guī)定油料和油脂中農(nóng)藥的最大殘留限量基本在0.005 mg/kg 以上，為了更好地滿足最大殘留限量需求，本研究向大豆油中準(zhǔn)確添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低添加水平為0.005 mg/kg (其中113 種按0.005 mg/kg 添加，12 種按0.01 mg/kg 添加，生物芐呋菊酯按0.05 mg/kg 添加)，并分別選擇其1、2 和10 倍3 個(gè)水平添加標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)水平重復(fù)6 次。按1.2 節(jié)和1.4 節(jié)的條件進(jìn)行前處理和測(cè)定，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)對(duì)氣相色譜的影響普遍存在，比較相同濃度的農(nóng)藥，其在基質(zhì)溶液中的色譜峰響應(yīng)值會(huì)比其在純?nèi)軇┲械母??；|(zhì)效應(yīng)的存在，一方面可以減少熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的分解，以及屏蔽進(jìn)樣口的活性位點(diǎn)而減少農(nóng)藥在活性位點(diǎn)的吸附，增加目標(biāo)化合物從進(jìn)樣口到色譜柱的濃度[4-6]；另一方面由于質(zhì)譜檢測(cè)是將物質(zhì)離子化，在磁場(chǎng) (或電場(chǎng)) 作用下按離子的質(zhì)荷比分離來(lái)定性和定量，在基質(zhì)效應(yīng)的存在下，共流出組分會(huì)改變待測(cè)物的離子化效率和離子成分的組成，進(jìn)而引起待測(cè)物檢測(cè)信號(hào)的變化[7-8]，影響方法的靈敏度和檢出限，因此有必要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究采用提取后加入法和絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，通過(guò)測(cè)定目標(biāo)化合物在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)值 (A) 及其在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值 (B)，根據(jù)公式 (1) 計(jì)算基質(zhì)效應(yīng) (Me)。當(dāng)Me＜ 15 % 時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響可忽略；當(dāng)Me≥ 15% 時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響不可忽略[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRM 方法的建立

2.1.1 確認(rèn)保留時(shí)間及母離子 以MS1 scan 模式運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品，在MassHunter 定性分析軟件中積分并提取質(zhì)譜，輔以NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)確定目標(biāo)化合物及其保留時(shí)間，選擇質(zhì)量數(shù)相對(duì)更大、豐度更高的特異性離子作為母離子。

2.1.2 確認(rèn)子離子及最佳碰撞能量 選擇時(shí)間片段，將質(zhì)譜掃描類型改為產(chǎn)物離子掃描 (production)，輸入母離子、低質(zhì)量數(shù)離子、高質(zhì)量數(shù)離子及不同的碰撞能量后運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)品以確定子離子和最佳碰撞能量。

2.1.3 優(yōu)化峰形、確認(rèn)MRM 方法 根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、特征離子對(duì)及最佳碰撞能量創(chuàng)建MRM 方法，運(yùn)行混合標(biāo)準(zhǔn)樣品并記錄各化合物的峰寬，依據(jù)MRM 方法各分段的總時(shí)間，結(jié)合目標(biāo)化合物的峰寬來(lái)調(diào)節(jié)每個(gè)transition 的駐留時(shí)間，確保每個(gè)化合物峰上有20 個(gè)左右的采樣點(diǎn)。在MassHunter 軟件中查看峰形和靈敏度，確認(rèn)方法。優(yōu)化后的結(jié)果見(jiàn)表1。大豆油中126 種農(nóng)藥在動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描下的總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 農(nóng)藥殘留檢測(cè)過(guò)程中常用的提取溶劑有丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、酸化乙腈及其不同比例的混合溶劑，其中乙酸乙酯和丙酮作為提取溶劑在提取脂肪含量高的樣品時(shí)共萃取物多，增加了后續(xù)樣品凈化的難度?？紤]到有些農(nóng)藥在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，導(dǎo)致農(nóng)藥回收率降低，本研究采用不經(jīng)過(guò)酸堿調(diào)節(jié)的用正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。在提取前，先用乙腈飽和的正己烷溶解樣品，以便使溶解在乙腈中的油脂盡可能少[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，在提取過(guò)程中加入氯化鈉也會(huì)使油脂分配到乙腈相的比例大大減小，但在后續(xù)應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有些樣品加入氯化鈉后，乙腈與正己烷不能準(zhǔn)確分層。綜合考慮，在前處理過(guò)程去掉氯化鈉。

2.2.2 固相萃取柱的篩選 為了更好地對(duì)比不同SPE 柱除去油脂的凈化效果，本研究選取5 個(gè)大豆油空白樣品，準(zhǔn)確稱取5 g，加入1.0 g 氯化鈉、以10 mL 用乙腈飽和的正己烷和20 mL 用正己烷飽和的乙腈，振蕩10 min，于 -5 ℃、20 000 r/min 下離心5 min。分別取這5 個(gè)樣品的乙腈層于一個(gè)潔凈容器中，混合均勻后分別準(zhǔn)確移取其5 mL，加入至事先用10 mL 乙腈活化但不流干的FL、AL-N、HLB、PRiME-HLB、PRiME HLB Short、LC-Si、ENVI-18、PEP 和Captiva EMRLipid 固相萃取柱中；其中Captiva EMR-Lipid 使用方式與其他SPE 柱有所不同，使用前先用5 mL乙腈和5 mL水活化，在加入之前，加入1.25 mL 一級(jí)水與其混合均勻 (Captiva EMR-Lipid 柱需要有機(jī)相與水體積比為4 : 1 時(shí)，才能充分發(fā)揮Captiva EMR-Lipid 柱的功效)。凈化液接收于接收管，接收之前準(zhǔn)確稱取接收管的質(zhì)量；乙腈提取液過(guò)所有SPE 柱時(shí)采用1 滴/s，流至近干時(shí)，用吸耳球吹干殘留在固相萃取柱上的乙腈提取液；將凈化液在40 ℃水浴中，氮?dú)獯抵两桑挥涗洸煌邮展艿馁|(zhì)量，計(jì)算前后差值；用1.0 mL 乙酸乙酯溶解，待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

結(jié)合接收管前后剩余油滴 (圖2) 和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜用2.2.2 節(jié)的方法結(jié)合1.4 節(jié)的儀器條件(檢測(cè)模式改為MS1 SCAN)，對(duì)不同種類固相萃取柱凈化后空白樣品色譜圖 (圖3) 進(jìn)行對(duì)比。綜合分析得知，AL-N 和Captiva EMR-Lipid 凈化效果最好。為了進(jìn)一步比較AL-N 和Captiva EMR-Lipid的區(qū)別，作者對(duì)其做了添加回收試驗(yàn)，添加水平為0.02 mg/kg，其中溴螨酯、鄰苯基苯酚、乙酯殺螨醇、速滅磷、丙溴磷過(guò)AL-N 柱后沒(méi)有回收或回收率低，加之Captiva EMR-Lipid 的基質(zhì)響應(yīng)值高于AL-N。因此選用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作為凈化材料。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

結(jié)果表明：在0.003～0.2 mg/L 范圍內(nèi)，126 種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積之間線性關(guān)系良好，R2均大于0.995。

篩選經(jīng)1.2 節(jié)前處理且信噪比低于3 的樣品作為空白，以信噪比等于或大于10 作為方法的定量限 (LOQ)，其LOQ 在0.005～0.05 mg/kg 之間。

添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明：126 種農(nóng)藥的平均回收率在60%～119%之間，其中122 種農(nóng)藥的RSD低于20%，另外4 種農(nóng)藥的RSD 低于25%。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

結(jié)果表明：總體上表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其中：1) 氯苯胺靈和內(nèi)吸磷存在基質(zhì)減弱效應(yīng) (Me在-65%～16%之間)，而且隨著添加濃度的增加，減弱的基質(zhì)效應(yīng)逐漸變得不明顯；2) 醚菌酯在0.005 和0.01 mg/kg 添加水平下表現(xiàn)為基質(zhì)減弱效應(yīng)，在0.05 mg/kg 水平表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；3) 有122 種農(nóng)藥表現(xiàn)為明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；4) 有83 種農(nóng)藥在添加水平0.05 mg/kg 的基質(zhì)效應(yīng)弱于0.005 和0.01 mg/kg，可見(jiàn)當(dāng)添加濃度增加后，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)相應(yīng)的減弱。因此本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了校正。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

利用所建立的方法對(duì)企業(yè)送檢和市場(chǎng)隨機(jī)抽檢的15 批大豆油樣品進(jìn)行了農(nóng)藥多殘留檢測(cè)。結(jié)果均未檢出本方法所涉及農(nóng)藥殘留的存在。

3 結(jié)論

優(yōu)化了大豆油中農(nóng)藥殘留的前處理方法，利用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱，結(jié)合GC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM)，建立了大豆油中126 種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。結(jié)果表明：Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱能夠有效除去甘油及親脂性干擾物，大豆油脂質(zhì)成分含量高，基質(zhì)效應(yīng)明顯，當(dāng)大豆油中所含農(nóng)藥質(zhì)量濃度較低時(shí)基質(zhì)效應(yīng)越明顯，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正能夠使結(jié)果更加準(zhǔn)確。運(yùn)用本方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行農(nóng)藥多殘留檢測(cè)，并未檢出本方法所涉及農(nóng)藥殘留的存在。