甲基硫菌靈和百菌清浸苗防治甘薯黑斑病的影響因素分析

張德勝, 白瑞英, 喬 奇, 田雨婷, 王永江, 王 爽, 張振臣

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室，鄭州 450002)

甘薯黑斑病由甘薯長喙殼菌Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted 侵染甘薯引起，整個生育期均可感病，每年由該病造成的產(chǎn)量損失為5%～10%，是甘薯的主要病害之一[1]。帶菌苗的栽插和運輸是該病傳播的重要途徑[1]，生產(chǎn)中的引種不規(guī)范會進一步加重該病的蔓延[2]。使用殺菌劑浸苗是防控甘薯黑斑病的重要手段，中國建國初期應用較多的硼砂、氯化汞、醋酸苯汞、波爾多液等已被更加高效安全的藥劑代替[3-5]。在中國除已登記的甲基硫菌靈等4 種殺菌劑外[6]，三唑酮、粉唑醇、噁霉靈、異菌脲和百菌清等也被證實對甘薯黑斑病有明顯防治效果[7-9]。在世界其他甘薯產(chǎn)區(qū)，噻菌靈、苯醚甲環(huán)唑、氟啶胺等被報道對甘薯黑斑病有較好防治效果[10-12]。上述殺菌劑分屬多個化學結構類型，作用機理多樣[13]，但浸苗技術并無區(qū)別，所有藥劑均沿用浸苗3～10 min 的方法防治甘薯黑斑病[1,14]。

張岳等發(fā)現(xiàn)，醋酸苯汞和二氯萘醌在一定范圍內(nèi)對甘薯黑斑病的防治效果隨藥液濃度的增加而增加，隨藥劑處理時間的增加而降低，但易對薯苗造成藥害[15]；方樹民等發(fā)現(xiàn)，多菌靈和甲基硫菌靈的浸苗時間會影響其對甘薯蔓割病的防治效果[16]。可見，不同類型藥劑所需的浸苗條件有所不同。防治其他病蟲害的施藥技術研究也表明，藥劑作用機理、施藥方式、施藥劑量、藥液用量等因素以及與作物間的相互作用均對防治效果有顯著影響[17-19]。目前尚不確定影響浸苗防治甘薯黑斑病效果的關鍵因素，未見多因素協(xié)同作用影響浸苗效果的研究，無法判斷不同類型藥劑是否需要配套相應的浸苗技術。

為此，本研究選擇內(nèi)吸性的甲基硫菌靈(thiophanate-methyl) 和非內(nèi)吸性的百菌清(chlorothalonil) 兩種類型殺菌劑進行試驗，明確浸苗時間或藥液濃度的單因素變化與防治效果的關系；用正交法分析藥劑浸苗時間、藥液濃度和孢子濃度對甘薯黑斑病發(fā)病的影響；比較浸苗時間和藥液濃度對兩種藥劑防治效果的影響，旨在為提高浸苗防治甘薯黑斑病的效果及農(nóng)藥使用的“減量增效”提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株及分生孢子懸浮液制備 甘薯長喙殼菌Ceratocystis fimbriata 菌株由河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所分離，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，菌株編號CFSC-01。將菌株在PSA 平板上25 ℃避光培養(yǎng)10 d，用無菌水洗下分生孢子，根據(jù)試驗要求調節(jié)至合適的孢子濃度，制得孢子懸浮液，備用。

1.1.2 薯苗品種 商薯19 脫毒種薯由河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。試驗開始前將長度15 cm 左右的薯苗從種薯上剪下，去除全部葉片僅保留頂芽和腋芽，保濕備用。

1.1.3 供試藥劑 36% 甲基硫菌靈懸浮劑( thiophanate-methyl 36% SC)，江蘇藍豐生物化工股份有限公司生產(chǎn)；40%百菌清懸浮劑 ( chlorothalonil 40% SC)，江陰蘇利化學股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 盆栽基質 將市售蛭石和草炭按照等體積混合，備用。

1.2 儀器設備

JJ-CJ-1G 潔凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；GZ-280BE-LED 光照培養(yǎng)箱，南京金恒實驗儀器廠；FYL-YS-100L 恒溫箱，北京福意電器有限公司；MLS-3750 高壓滅菌鍋，日本三洋電機株式會社；DHG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；Axio Scope.A1 型正置顯微鏡，德國Carl Zeiss 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥劑浸苗時間對防治效果的影響 根據(jù)預備試驗結果，設置甲基硫菌靈和百菌清浸苗的質量濃度均為500 mg/L，浸苗時間分別為：1、5、10、30 min 和1、3、6、9、12 h，分別進行水培和盆栽試驗，同時設置空白對照處理。每處理4 次重復，每重復10 株薯苗。

浸苗方法：在玻璃廣口瓶中進行。藥液深度4 cm 左右，將各重復薯苗單獨浸苗，達到藥劑處理時間后，將薯苗上藥液瀝干。

水培方法：將薯苗按重復轉移至單獨放置的孢子懸浮液 (孢子濃度為5 × 105孢子/mL) 中接菌6 h，孢子懸浮液深度4 cm 左右。接種后按重復轉入裝有無菌水的廣口玻璃瓶中，放入光照培養(yǎng)箱中于25 ℃、光暗比16 h : 8 h 條件下培養(yǎng)。

盆栽方法：將700 cm3盆栽基質加入70 mL無菌水潤濕后，加入100 mL 孢子懸浮液 (孢子濃度為1 × 106孢子/mL)，混勻，置于底部有孔的營養(yǎng)缽中，將薯苗插入。

分別于水培試驗7 d 后、盆栽試驗9 d 后調查黑斑病發(fā)病情況，計算防治效果。

1.3.2 藥液濃度對防治效果的影響 根據(jù)藥劑浸苗時間與防治效果的關系，設置甲基硫菌靈和百菌清浸苗時間均為6 h，甲基硫菌靈和百菌清浸苗的質量濃度分別為300、400、500、600 和700 mg/L，同時設置清水對照。每處理4 次重復，每重復10 株薯苗。浸苗方法、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間同1.3.1節(jié)，取樣調查黑斑病發(fā)病情況并計算防治效果。

1.3.3 藥劑浸苗時間、藥液濃度和孢子濃度對薯苗發(fā)病影響的正交試驗 根據(jù)甲基硫菌靈和百菌清浸苗時間、藥液濃度的單因素試驗結果，設計正交試驗，測定薯苗發(fā)病與藥劑浸苗時間、藥液濃度和孢子濃度3 因子的關系。每個因子設3 個水平，試驗設計見表1。盆栽接種及薯苗培養(yǎng)條件同1.3.1 節(jié)的盆栽方法 (下同)。

表1 正交試驗設計方案L9 (34)Table1 Scheme of orthogonal experiment L9 (34)

1.3.4 藥劑浸苗時間與藥液濃度的不同組合對防治效果的影響 根據(jù)單因素試驗及正交試驗結果，接種方法及薯苗培養(yǎng)方法參照1.3.1 節(jié)盆栽方法。甲基硫菌靈和百菌清的浸苗時間、藥液濃度兩因素均設4 水平，共16 個組合處理，每處理4 次重復，試驗設計見表2 及表3。均設空白對照處理。

表2 甲基硫菌靈浸苗時間與藥液濃度處理組合Table2 Dipping time and concentration of treatment combination with thiophanate-methyl

1.3.5 病圃驗證試驗 選擇排種人工接種病薯的苗床為病圃，試驗前清除所有病薯薯塊，整地起壟進行試驗。甲基硫菌靈和百菌清的質量濃度均為500 mg/L，浸苗時間分別為10 min、2 h 及6 h，同時設不浸苗的空白對照處理。每處理3 次重復，每重復扦插100 株健康薯苗，小區(qū)隨機區(qū)組排列。

浸苗方法：在整理箱 (70 cm × 45 cm) 中配制藥液，每處理單獨配制，藥液深度4 cm。將3 次重復的薯苗同時放入整理箱進行藥劑處理，固定薯苗保持豎直向上，浸苗完成后晾干種入病圃，于定植21 d 后調查發(fā)病情況及單株鮮重。

1.3.6 防治效果計算方法及數(shù)據(jù)分析 水培試驗中，甘薯病苗分級標準[20]為：0 級，無病斑；1 級，有零星小病斑出現(xiàn)，病斑總數(shù)＜5 個；3 級，病斑較大，病斑總數(shù)＜15 個；5 級，病斑相連，連片長度≤1.5 cm；7 級，病斑相連，連片長度＞1.5 cm。

盆栽試驗中，甘薯病苗分級標準[21]為：0 級，無病斑；1 級，有一個長軸小于等于1 cm 的病斑；3 級，有兩個長軸小于等于1 cm 的病斑或一個長軸大于1 cm 小于等于2 cm 的病斑；5 級，單獨病斑或融合病斑長軸大于2 cm 小于等于3 cm，或短軸寬度達到莖粗一半；7 級，單獨病斑或融合病斑長軸大于3 cm，或短軸達到莖粗的三分之二，植株生長不良。病情指數(shù) (%) = ∑(各級發(fā)病薯苗數(shù) × 相對級數(shù)值)/(調查總薯苗數(shù) × 7) × 100；防治效果 (%) = (無菌水對照病情指數(shù)-藥劑處理病情指數(shù))/無菌水對照病情指數(shù) × 100。

病圃驗證試驗調查各重復病株數(shù)量，不對病株進行分級。病株率 (%) = (病株數(shù)/調查總株數(shù)) ×100；防治效果 (%) = (空白對照區(qū)病株率-處理區(qū)病株率)/空白對照區(qū)病株率 × 100。

試驗數(shù)據(jù)以平均值和標準差形式表示。應用DPS 8.01 專業(yè)版完全隨機統(tǒng)計模塊、非線性回歸模塊和正交試驗統(tǒng)計模塊進行分析，多重比較采用新復極差法進行[22]。

2 結果與分析

2.1 藥劑浸苗時間對防治效果的影響

水培接種試驗中，兩種藥劑的防治效果均隨浸苗時間的增加而提高，但當甲基硫菌靈浸苗時間達到6 h 后或百菌清浸苗時間達到3 h 后，浸苗時間增加對防治效果影響不再顯著。當浸苗時間為1 min 時，兩種藥劑的防治效果差別最大，之后隨浸苗時間的增加而逐漸減小。

盆栽接種試驗結果的變化規(guī)律與水培試驗類似，只是到達峰值的時間不同，即兩種藥劑的防治效果同樣隨浸苗時間的增加而提高，但當甲基硫菌靈浸苗時間達到6 h 后或百菌清浸苗時間達到1 h 后，浸苗時間增加對防治效果影響不再顯著。當浸苗時間為10 min 時，兩種藥劑的防治效果差距最大，1 min 處理次之。

由圖1 可知，兩種不同作用類型藥劑甲基硫菌靈浸苗時間少于6 h、百菌清浸苗少于3 h 時，浸苗時間與防治效果呈正相關。在浸苗時間小于3 h時，百菌清防效高于相同濃度的甲基硫菌靈。水培和盆栽兩組試驗中防治效果隨浸苗時間的變化趨勢較一致。

2.2 藥液濃度對防治效果的影響

水培接種試驗中，兩種藥劑的防治效果隨藥液質量濃度的增加而提高。當藥液質量濃度達到500 mg/L 時，再增加藥液濃度甲基硫菌靈對防治效果影響不再明顯；百菌清除500 mg/L 和600 mg/L兩處理防治效果差異不顯著外，其余各濃度處理間差異顯著。兩種藥劑在300 mg/L 時防治效果差距最大。

盆栽接種試驗的結果與水培試驗結果一致，差別僅在于甲基硫菌靈的質量濃度達到600 mg/L時防治效果不再隨藥液質量濃度的增加而表現(xiàn)出顯著差異。

由圖2 可知，當甲基硫菌靈的質量濃度小于600 mg/L、百菌清小于700 mg/L 時，防治效果與藥液質量濃度呈正相關。相同藥液濃度下，濃度越低，兩種藥劑防治效果的差距越大。水培和盆栽兩組試驗中防治效果隨藥液濃度的變化趨勢較一致。

2.3 藥劑浸苗時間、藥液濃度和孢子濃度對薯苗發(fā)病的影響

以病情指數(shù)為考察指標，由表4 可知，RC＞RB＞RA，表明防治藥劑為甲基硫菌靈時，對薯苗發(fā)病影響由大到小的順序為孢子濃度＞浸苗時間＞藥液濃度。

由表5 可知，RC＞RA＞RB，表明以百菌清為防治藥劑時，對薯苗發(fā)病影響由大到小為孢子濃度＞藥液濃度＞浸苗時間。

由方差分析結果 (表4 和表5) 可知，兩種藥劑處理中，藥液濃度、浸苗時間和孢子濃度3 個因素對甘薯黑斑病發(fā)病的影響都達到極顯著水平，均為影響薯苗發(fā)病的關鍵因素。

2.4 藥液濃度與浸苗時間不同組合對防治效果的影響

由圖3 可知，甲基硫菌靈和百菌清兩種不同類型藥劑，在相同濃度下處理，防治效果均隨浸苗時間的延長而增加；相同浸苗時間處理，防治效果均隨藥液濃度的提高而增加。其中，甲基硫菌靈浸苗360 min 且質量濃度為700 mg/L 的處理防治效果最好，達到72.5%；百菌清浸苗180 min且質量濃度為600 mg/L 的處理防治效果最好，達到85.1%。

表4 甲基硫菌靈正交試驗結果Table4 Orthogonal experiment outcome using thiophanate-methyl

在浸苗處理30、120、240 和360 min 時，甲基硫菌靈700 mg/L 處理和400 mg/L 防治效果分別相差11.6%、18.8%、21.7%和26.8%，隨浸苗時間延長而增加。在質量濃度為400、500、600和700 mg/L 時，浸苗360 min 和30 min 防治效果間分別相差27.5%、31.2%、39.8%和42.8%，隨藥液質量濃度的提高而增加。表明甲基硫菌靈需要充足的浸苗時間以保證藥效發(fā)揮。

在浸苗處理10、30、60 和180 min時，百菌清600 mg/L 處理和300 mg/L 防治效果分別相差37.1%、33.8%、38.1%和33.3%，未隨浸苗時間延長而明顯增加。在300、400、500 和600 mg/L時，浸苗180 min 和10 min 防治效果間分別相差17.7%、18.3%、17.5%和13.9%，未隨藥液濃度提高而增加。同低濃度處理相比，浸苗時間的延長并不能更大程度提高百菌清高濃度處理的防治效果，與甲基硫菌靈不同。

以防治效果 (y) 為因變量，藥液濃度 (x1) 和浸苗時間 (x2) 為自變量，可根據(jù)上述試驗結果構建二元回歸方程，甲基硫菌靈為y = -12.618 4 + 0.067 6 x1+ 0.106 9x2(x1區(qū)間400～700 mg/L，x2區(qū)間30～360 min)，百菌清為y = 0.100 5 + 0.119 9x1+0.084 0x2(x1區(qū)間300～600 mg/L，x2區(qū)間10～180 min)。方差分析結果F 值分別為84.31、83.36，F(xiàn) ＞F0.01(2,13)，故兩方程y 與x1、x2之間有真實二元線性回歸關系；tx1、tx2分別大于t0.01，表明兩方程x1、x2對y 的偏回歸極顯著。根據(jù)兩回歸方程中x1和x2的系數(shù)可以判斷，在設定范圍內(nèi)提高藥液濃度或延長浸苗時間均可提高兩藥劑的防治效果(表6)。

2.5 病圃驗證試驗結果

由表7 數(shù)據(jù)可知，甲基硫菌靈、百菌清分別以質量濃度500 mg/L 浸苗6 h，病株率分別為13.3%和12%，防治效果達分別為83.6%和85.2%，單株平均鮮重分別為60.1 g 和58.7 g，均顯著高于其他處理。當浸苗時間為2 h 時，甲基硫菌靈和百菌清的防治效果分別為4.1%和70.9%，兩者防治效果差異顯著。當浸苗時間為10 min 時，兩者的防治效果分別為 -1.6%和24.2%，其單株平均鮮重與空白對照處理差異不顯著。表明藥劑浸苗時間顯著影響防治效果，而藥劑防治效果顯著影響薯苗生長 (鮮重)，相對于百菌清，甲基硫菌靈需要更長的浸苗時間。

表6 回歸方程的顯著性檢驗及回歸分析Table6 Significance test and regression analysis of regression equation

表7 不同浸苗時間對甘薯黑斑病田間防治效果及對甘薯鮮重的影響Table7 Effect of different dipping time on the control efficiency of black rot and fresh weight of sweet potato

3 結論與討論

甘薯的種植模式為種薯育苗，剪苗栽插[23]。通過近距離接觸、混合屯苗、可使病苗侵染健苗，栽插后的灌溉水和糞肥帶菌也可造成薯苗感病，薯苗感染黑斑病后生長受抑制，后期會形成病薯[1]。減少或杜絕病苗產(chǎn)生是防治甘薯黑斑病的必要環(huán)節(jié)，殺菌劑浸苗是重要的防治手段[1]。

施藥技術與藥劑的作用效果密切相關，通過改變施藥方式[24-25]、選擇合適劑型等[26]可以提高藥劑的防治效果。而針對特定的施藥方式和藥劑特性優(yōu)化施藥條件，同樣是達到農(nóng)藥“減量增效”的重要手段。以噴霧施藥為例，通過優(yōu)化霧滴粒徑和密度、降低施藥液量等，在不改變用藥量的情況下，可以有效提高農(nóng)藥利用率和防治效果[27-29]。病圃試驗結果顯示，甲基硫菌靈和百菌清按500 mg/L 劑處理薯苗，常規(guī)浸苗10 min 時，防治效果分別為 -1.6%和24.2%，遠未達到防治預期。

本試驗采用病原菌分生孢子懸浮液混入盆栽基質的方法模擬外部病原菌侵染薯苗[21]，做到了發(fā)病均勻，病情可控，規(guī)避了其他苗病干擾等因素。通過試驗發(fā)現(xiàn)，在浸苗防治甘薯黑斑病時，百菌清、甲基硫菌靈浸苗時間與防治效果呈正比，浸苗時間分別達到3 h、6 h 時防治效果最佳。此結果與甲基硫菌靈浸苗防治甘薯蔓割病時60 min內(nèi)防治效果與浸苗時間呈正比的結果一致[16]，與目前生產(chǎn)上普遍沿用的浸苗時間差異明顯。正交試驗進一步明確了浸苗時間、藥液濃度和孢子濃度對薯苗發(fā)病的影響均達到極顯著水平，均是影響防治效果的關鍵因素。在此基礎上可進一步研究不同侵染途徑病原菌的檢測，評估薯苗的感病風險，有針對性地調整浸苗條件。

根據(jù)藥劑浸苗時間和藥液濃度的不同組合試驗結果及構建的回歸方程表明，在一定范圍內(nèi)，提高藥液濃度和延長浸苗時間均可以提高防治效果，但甲基硫菌靈和百菌清防治效果隨施藥條件變化的趨勢明顯不同。此現(xiàn)象與兩種類型藥劑丙環(huán)唑和嘧菌酯 (≤0.05 g/L) 隨濃度和霧滴密度變化對小麥白粉病菌的抑制率差異有相似之處[30]。內(nèi)吸性的甲基硫菌靈需要充足的浸苗時間從而達到理想防治效果；非內(nèi)吸性的百菌清不同藥液濃度間的防治效果差異大于不同浸苗時間間的防治效果差異。病圃試驗同樣驗證了這兩種藥劑在不同浸苗時間下的防治效果顯著不同。為保證防治效果，使用甲基硫菌靈浸苗時，浸苗時間應達到6 h，如果想提高浸苗效率，可選擇適當提高百菌清濃度并減少浸苗時間。本試驗為了避免不同劑型干擾試驗結果，兩種藥劑均選用懸浮劑，但在相同浸苗條件下劑型對防治甘薯黑斑病是否有影響還不明確，有待進一步研究。

總之，殺菌劑浸苗防治甘薯薯苗黑斑病，浸苗時間、藥液濃度、孢子濃度均為影響防治效果的關鍵因素，各因素對發(fā)病的影響隨藥劑類型的不同而變化。在一定范圍內(nèi)，可通過提高藥液濃度和延長浸苗時間達到提高防治效果的目的。甲基硫菌靈和百菌清的防治效果隨藥液濃度和浸苗時間變化的趨勢不同，甲基硫菌靈對浸苗時間的要求顯著高于百菌清。不同類型藥劑需配套相應的浸苗技術才能保證藥效發(fā)揮。