鈉通道與嬰兒嚴重肌陣攣癲癇的研究進展

沈雁文

（解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心兒科，北京 100039）

嬰兒嚴重肌陣攣癲癇（severe myoclonic epilepsy in infancy，SMEI）即德拉韋綜合征（Dravet syndrome），是兒童難治性癲癇的代表性疾病，與鈉通道密切相關，具有極高的致死率和致殘率。鈉通道是細胞膜上最重要的離子通道之一，是神經(jīng)、肌肉系統(tǒng)生物電信號的產(chǎn)生基礎。盡管鈉通道被發(fā)現(xiàn)已70余年，目前已知鈉通道與神經(jīng)、肌肉、心血管系統(tǒng)的很多疾病密切相關，是眾多藥物的治療靶點，且鈉通道相關基因的異常尤其常見于癲癇與心率失?；颊?，是導致癲癇患者猝死的重要原因之一[1-3]，然而人們對鈉通道的了解依舊有限。2018年顏寧團隊揭示了人源電壓門控鈉通道Nav1.4在3.2 ?分辨率冷凍電鏡下的結(jié)構(gòu)全貌，尤其是電壓感受結(jié)構(gòu)域、離子選擇篩、快速失活原件等關鍵功能單元的結(jié)構(gòu)，并將Nav1.4相關的70多個點突變及其對應疾病（包括肌強直、肌無力、周期性癱瘓、熱性驚厥附加癥等）與結(jié)構(gòu)進行一一對應，重點討論了與電壓感知和快速失活相關的突變，從而為理解相關疾病的致病機制提供了重要的分子依據(jù)[4]。2021年初顏寧團隊再次通過對人源鈉通道Nav1.1及Nav1.5進行結(jié)構(gòu)解析及對比，揭示了鈉通道上的致病熱點變異位置[5]?；诨蚓庉嬆Ｊ缴镅芯康目焖侔l(fā)展，人們對SCN1A基因相關疾病譜，尤其是SMEI這一兒童災難性的癲癇綜合征開始有了新的認識，針對SMEI的治療研究也開始多樣化[6-8]。本文從鈉通道的分子結(jié)構(gòu)基礎和組織時序表達差異方面介紹了SMEI作為聯(lián)絡神經(jīng)元病的可能性及相關研究進展。

1 鈉通道的種類及進化

電壓門控鈉通道屬于膜蛋白的一種，其編碼基因是基因家族里最古老又高度保守的基因序列之一，因而，人類鈉通道α亞基有超過50%的跨膜區(qū)與最簡單的真核生物序列是一樣的[9]。細菌的鈉通道為同源四聚體結(jié)構(gòu)，而包括人類在內(nèi)的哺乳動物及斑馬魚等則是由一個α亞基和兩個β亞基構(gòu)成的異源三聚體復合物，其中α亞基是最重要的組成。在進化過程中，古生物基因通過同源重復拷貝后逐漸分化出不同亞型，以適應更復雜、更精細的生物功能需求[9-10]。構(gòu)成人類鈉通道的α亞基主要有9種亞型（Nav1.1～1.9），β亞基主要有5種（β1、β1B、β2、β3、β4），其基因位置及分布以及對應蛋白見圖1。

事實上，人體內(nèi)存在的鈉通道種類十分豐富，除了9種主要α亞基與5種主要β亞基的組合以外，哪怕同一基因編碼的α亞基也存在很多類型[10]。除了突變導致的可能致病的異常鈉通道結(jié)構(gòu)外，正常生物生命過程中同一基因編碼的α亞基產(chǎn)物也可以通過選擇性剪切對前體mRNA（PremRNA）進行再加工，最后形成的成熟mRNA并不包含所有外顯子，部分外顯子在選擇性剪切過程中可被拋棄，形成一個基因?qū)喾N不同蛋白的現(xiàn)象。例如SCN2A基因在5號外顯子部位存在一個選擇性剪切位點[11]，SCN8A與SCN5A均在6號外顯子處具有選擇性剪切位點，SCN8A在21號外顯子處還有另一個選擇性剪切位點，均分別在胎兒期和成人期選擇不同的外顯子編碼序列[12-14]。這意味著雖然來自相同的基因，但是胎兒期的Nav1.2、Nav1.5、Nav1.6與成人期的Nav1.2、Nav1.5、Nav1.6實際上存在功能與結(jié)構(gòu)甚至分布上的差異，而且如果這種選擇性剪切過程發(fā)生異常，導致胎兒型鈉通道不能成功轉(zhuǎn)化為成人型鈉通道，也可能導致疾病的發(fā)生，這些可能性不僅與癲癇相關，也與心律失常、腫瘤等其他多種疾病密切相關[13-16]。這種差異對生命發(fā)展過程中的具體意義目前尚不明確，另外，通過何種機制啟動及關閉鈉通道從胎兒型向成人型的轉(zhuǎn)化，需要進一步深入探索。對同一突變的基因，若同時存在其他影響剪切方式選擇的問題，最后產(chǎn)生的離子通道的蛋白結(jié)構(gòu)及功能也會存在差異，選擇性剪切可能是SCN1A基因同一突變可能存在多種臨床表型的原因之一。不同組織細胞如何制定同一基因內(nèi)在的不同剪切方案及剪切程序也至今不明，但選擇性剪切這一背景為部分內(nèi)部存在高度同源重復序列的基因發(fā)生異常導致的疾病的進一步治療提供了以外顯子跳躍作為治療方法的思路。

2 鈉通道的結(jié)構(gòu)特點

在人類，由不同α亞基與不同β亞基構(gòu)成的鈉通道雖具有同源性，其生理功能卻差異極大，在不同組織細胞中分布不同，承擔不同的功能。α亞基是鈉通道的主要構(gòu)成成分，其對河鲀毒素的敏感性是區(qū)分不同鈉通道蛋白的主要鑒別方法。α亞基長度約260 kD，存在4個高度重復的結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域含有6個跨膜結(jié)構(gòu)（S1～S6），均包含電壓感受器和離子傳遞通道，是動作電位的主要承擔者[6,17]。而α亞基前后連接的β亞基則屬于單跨膜細胞黏附因子，調(diào)節(jié)細胞表面蛋白的表達和引導α亞基的動力，對α亞基在細胞膜的定位及功能調(diào)節(jié)均有重要作用，對細胞的遷移定位和神經(jīng)元的增殖、生長等亦發(fā)揮重要作用[18-21]。

以Nav1.6為例，α亞基的4個結(jié)構(gòu)域呈高度同源，在進化過程中高度保守，S1～S6跨膜區(qū)中S1～S5可起到感受壓力的作用，尤其是S4段，常有攜帶正電荷的氨基酸殘基分布，推測其為電壓門控的離子通道壓力感受器的主要位置，S4段賴氨酸及精氨酸殘基的變異往往導致其功能發(fā)生改變，而S5和S6是離子傳遞通道[5,22]。SCN1A基因?qū)闹虏⊥蛔兌鄶?shù)發(fā)生在胞外結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)，其中4個電壓感受域的突變多與SMEI相關[5]。此外，在結(jié)構(gòu)域I與II，結(jié)構(gòu)域II與III之間均存在較大的疏松環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域III及結(jié)構(gòu)域Ⅳ之間存在許多調(diào)控鈉通道活性的配體結(jié)合位點。環(huán)狀結(jié)構(gòu)及α亞基蛋白的N端、長C端均位于細胞內(nèi)側(cè)，存在較多配體結(jié)合位點，可對鈉通道功能產(chǎn)生進行調(diào)節(jié)。如胞內(nèi)側(cè)N末端與MAP1B蛋白結(jié)合[23]，C末端與β亞基結(jié)合[5,21]，均可加強牽引鈉通道移動并定位至細胞表面，而Nav1.6 α亞基的結(jié)構(gòu)域I/結(jié)構(gòu)域II環(huán)的551～554位點，胞內(nèi)側(cè)C末端1 943～1 945位點均存在可與泛素連接酶E3（NEDD4）互相作用的結(jié)構(gòu)位點，可導致Nav1.6泛素化出現(xiàn)內(nèi)陷及降解[24]；結(jié)構(gòu)域II與結(jié)構(gòu)域III之間的疏松環(huán)存在AnkG結(jié)合位點，可引導Nav1.6遷移至軸突起始段及郎飛結(jié)處[25]。C末端的鈣調(diào)蛋白也是重要的功能調(diào)節(jié)位點[26]。多數(shù)鈉通道蛋白具有同源性，配體調(diào)節(jié)位點極為相似。鈉通道的離子傳遞通道結(jié)構(gòu)的開放與閉合是電壓依賴的激活與失活，鈉通道的快激活與失活可調(diào)節(jié)細胞電流，通過細胞膜除極化進而產(chǎn)生動作電位；而鈉通道的慢失活，則調(diào)控了可利用的鈉通道數(shù)量，調(diào)節(jié)細胞的興奮性。不同位置基因突變導致α亞基的不同變化對最終形成的通道蛋白電生理功能的影響不同。當突變發(fā)生于調(diào)控結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)域或位于其他位置的突變干擾了離子通道蛋白的配體結(jié)合位點與配體結(jié)合的能力，疾病的表型嚴重程度很可能還和與通道蛋白結(jié)合的調(diào)控分子所對應的基因是否也存在異常密切相關。這可能是SCN1A同一突變并不一定產(chǎn)生SMEI的另一原因。

3 鈉通道的時空分布

電壓門控的鈉通道主要分布于興奮性細胞，其壓力感受器在一定電壓下可使離子傳遞通道打開、鈉離子內(nèi)流，觸發(fā)神經(jīng)及肌肉組織細胞產(chǎn)生動作電位，細胞膜去極化。不同的鈉通道壓力感受器興奮閾值不同，允許鈉離子通過的能力不同，產(chǎn)生的鈉離子流不同，失活持續(xù)時間不同，不同細胞的離子通道數(shù)量亦不同，使細胞興奮性表現(xiàn)出極大差異，進而承擔并完成不同的生理功能。鈉通道在多種組織細胞膜有不同程度低表達，在神經(jīng)及肌肉系統(tǒng)表達最高，其分布見表1。

表1 鈉通道的分布和表達[17,23-28]

實際上，不僅在不同組織器官中不同亞型的鈉通道分布存在差異，在同一器官的不同部位、同一部位的不同細胞乃至同一細胞的不同部位，鈉通道的分布也有較大差異。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3及Nav1.6是主要的亞型，Nav1.6主要分布于興奮性神經(jīng)元，Nav1.1主要分布于抑制性神經(jīng)元，在小腦浦肯野纖維、海馬抑制性γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元、下丘腦及大腦皮質(zhì)的中間神經(jīng)元均可檢測到一定程度的表達[28]。在細胞水平，Nav1.1和Nav1.3主要位于細胞體和軸突起始段；Nav1.2在髓鞘化和未髓鞘化的軸突和樹突上均有廣泛分布[29]；Nav1.6多數(shù)位于興奮性及抑制性神經(jīng)元軸突起始段的遠端，負責動作電位的產(chǎn)生，其興奮閾值最低，在去極化時最易被激活，20～100 Hz的高頻刺激時不容易失活，慢失活狀態(tài)時有更強的電壓依賴性[30]，與Nav1.2相比，在-35～-25 mV時通過的電流要增多近10%[31]。Nav1.6是軸突起始段及郎飛結(jié)位置的主要鈉通道成分，也是心臟竇房節(jié)的重要鈉通道成分。而Nav1.1（抑制性神經(jīng)元）及Nav1.2（興奮性神經(jīng)元）多數(shù)位于軸突起始段的近端，可調(diào)節(jié)動作電位的反向傳播[31]。在生命的不同階段，同一部位的鈉通道表達也存在很大的差異。在胎鼠和剛出生的乳鼠，Nav1.3是神經(jīng)細胞上主要表達的鈉通道類型，Nav1.1、Nav1.2及Nav1.6則在出生后才逐漸出現(xiàn)升高[32]，而且Nav1.2、Nav1.5及Nav1.6還會出現(xiàn)由胎兒型向成人型逐漸轉(zhuǎn)換的過程[13-14]，在剛出生的小鼠，軸突起始段主要表達Nav1.2，出生后2～4周后才逐漸被Nav1.6取代[33]，不同鈉通道蛋白在生命體的時間軸及組織部位的空間軸上均呈程序性表達的時空差異。

4 鈉通道與SMEI

近年來模型生物研究的快速發(fā)展極大地促進了基礎醫(yī)學研究的發(fā)展，Cre/loxP技術(shù)廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型鼠的制作，不僅縮短了制作周期，降低了成本，而且制作的模型鼠組織特異性強，存活率高，通過Cre/loxP技術(shù)對基因模型鼠的不同類型神經(jīng)元功能進行分析，使我們對鈉通道譜系疾病有了更深的了解，其中對SMEI模型鼠（DS鼠）的病理生理基礎研究最近幾年來也有認識的突破，新的認識和了解可能對SMEI未來的治療產(chǎn)生重要影響。與人類相似，DS鼠在出生時與野生型小鼠無明顯差異，但是生后4～5周開始出現(xiàn)熱敏感性癲癇。小鼠出生時腦組織的鈉通道類型主要以Nav1.3為主，其表達程度最高，在生后21 d左右降至最低，同時，Nav1.1在出生時最低，從生后10 d左右開始逐漸升高，持續(xù)至生后30 d；Nav1.1純合缺失的DS鼠多數(shù)于生后15 d左右死亡，Nav1.1雜合缺失的DS鼠多于生后20 d左右發(fā)病，25 d左右達到死亡高峰期[32]。胎兒型Nav1.3下降、成人型Nav1.1表達上升并對Nav1.3進行替代的時間交叉點，與DS鼠與人類SMEI的發(fā)病年齡相一致，猜測SCN1A基因變異導致Nav1.1單倍體劑量不足、不能完全取代逐漸降低表達的Nav1.3可能是觸發(fā)SMEI發(fā)病的原因。

對小鼠大腦的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Nav1.1主要存在于前腦、大腦皮質(zhì)、小腦中，主要位于SMEI 能抑制性神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.1雜合缺失鼠和純合缺失鼠海馬的神經(jīng)元電壓門控的鈉通道激活與失活均不受影響，但是鈉離子電流均較野生型顯著降低，不同腦組織的抑制性中間神經(jīng)元的鈉離子流也均較野生型鼠下降，其中Nav1.1純合缺失鼠下降更顯著[34]。但以興奮性神經(jīng)元為主的椎體細胞并未受到影響，DS鼠海馬和腦皮質(zhì)的中間神經(jīng)元鈉電流較野生型鼠明顯減少，無法產(chǎn)生持續(xù)高頻爆發(fā)的動作電位，使GABA能抑制性神經(jīng)元的抑制作用減弱并無法持續(xù)維持[34]。全細胞膜膜片鉗記錄DS小鼠的小腦浦肯野神經(jīng)纖維的動作電位閾值顯示動作電位閾值未受到影響，但是鈉離子流減少了58%～69%[34]，提示SMEI患者的共濟失調(diào)癥狀可能與小腦抑制性神經(jīng)元出現(xiàn)Nav1.1單倍體劑量不足導致的浦肯野神經(jīng)纖維功能缺陷有關。局限性敲除小鼠海馬的Nav1.1則模擬了SMEI的熱敏感性和認知缺陷，前頭部GABA神經(jīng)元的功能缺陷也可能參與SMEI患者認知缺陷、孤獨癥樣行為、睡眠障礙的癥狀形成[34-35]?；赟CN1A基因異常導致Nav1.1表達不足、數(shù)量不足，進而使抑制性神經(jīng)元不能以高頻持續(xù)動作電位維持抑制功能，興奮性神經(jīng)元失去抑制性神經(jīng)元的抑制，興奮性神經(jīng)元與抑制性神經(jīng)元出現(xiàn)功能失衡，可能是導致SMEI的原因，這一假設很好地解釋了為何臨床上觀察到SMEI患者口服拉莫三嗪可加重癲癇發(fā)作，而SCN8A基因突變導致的早發(fā)性嬰兒癲癇性腦病13型患者則對包括拉莫三嗪在內(nèi)的多數(shù)鈉通道阻滯劑有效，二者均為鈉通道病，對同一種藥物則呈現(xiàn)完全相反的治療策略選擇。以該假設為基礎，挽救GABA能神經(jīng)元功能或抑制興奮性神經(jīng)元功能以平衡興奮性神經(jīng)元與抑制性神經(jīng)元的作用，應能緩解SMEI的癥狀。研究證實，Nav1.6單倍體劑量不足確實對Nav1.1單倍體劑量不足起了保護作用，同時敲除SCN8A及SCN1A基因的雙雜合小鼠相比SCN1A及β1亞基突變的小鼠疾病嚴重程度有所緩解，相比DS小鼠，對藥物誘發(fā)癲癇的耐受性更好，壽命也相對延長[36]。用反義核苷酸使小鼠SCN8A轉(zhuǎn)錄降低25%～50%同樣延遲了SCN8A腦病鼠及SCN8A+/-DS小鼠的癲癇發(fā)作并減少了二者的致死率[37]。但是由于Nav1.6和Nav1.1在小腦浦肯野纖維上都有豐富表達，Nav1.6減少到50%以下時就要注意肌張力不足和其他運動障礙可能加重。小劑量氯硝西泮可使GABA能神經(jīng)元功能得到一定修復，改善DS小鼠的孤獨癥行為及認知功能[38]，新型鈉通道阻滯劑GS967由于對聯(lián)絡神經(jīng)元的鈉通道無影響，而選擇性作用于椎體神經(jīng)元細胞并下調(diào)Nav1.6表達，可減輕DS鼠的癲癇發(fā)作[39]，也說明促進GABA能神經(jīng)元的功能對改善SMEI癥狀有所幫助。DS小鼠腦組織免疫組化染色中發(fā)現(xiàn)并非所有GABA能神經(jīng)元受損程度都一致，是該假設需要解決的問題，是否與不同部位神經(jīng)元對鈉通道的量的需求或使用的轉(zhuǎn)錄本有所不同有關尚需進一步研究。值得注意的是，SCN1A及SCN9A基因異常均可導致熱性驚厥附加癥、熱性驚厥、SMEI，且SCN1A與SCN9A基因位置相鄰，二者由一個共同的反義RNA調(diào)控基因表達。目前已知SCN1A存在23種不同轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，SCN9A存在15種不同轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，反義RNA基因SCN1A-SCN9A-AS1則有27種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。以上均提示SCN9A可能為SCN1A的調(diào)節(jié)因子，在SCN1A缺陷情況下，是否可能通過SCN9A表達而代償SCN1A功能是一個值得思考的假設。

5 鈉通道致病機制

鈉通道相關疾病譜系廣泛，其以9種α亞基及5種β亞基組合成多種多樣類型的鈉通道蛋白，雖然互相之間同源性高、基礎功能相似，但是差異不大的基因編碼產(chǎn)生的電生理功能并不相同，相同的變異可能有不同的疾病發(fā)生，同為鈉通道異常，導致的疾病從熱性驚厥、熱性驚厥附加癥、SMEI、Doose綜合征、多種不同類型嬰兒癲癇性腦病、孤獨癥、痛覺異常，瘙癢癥、心律失常等表現(xiàn)各異，治療的方向和策略也有很大不同，同樣的鈉通道異常引起的癲癇，采用的也可以是截然相反的治療策略。

鈉通道致病的主要途徑包括：①基因異常導致肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或蛋白的二級、三級、四級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致離子通道的功能發(fā)生變化，或者鈉通道蛋白量產(chǎn)不足，或與配體結(jié)合并發(fā)揮功能調(diào)節(jié)的能力發(fā)生了改變。②引導鈉通道蛋白定位的基因異常，導致鈉通道蛋白不能定位到目標區(qū)域，無法形成一定量的離子通道簇；或因β亞基基因或β亞基表達的調(diào)節(jié)基因異常導致α亞基與β亞基表達不平衡最后無法很好結(jié)合等原因?qū)е履繕宋恢眉翱傮w位置的離子通道簇量產(chǎn)不足，離子通道量的變化導致細胞興奮性改變。③與鈉通道蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)鈉通道蛋白功能結(jié)構(gòu)的相關基因異常導致調(diào)節(jié)物量產(chǎn)不足，無法精確調(diào)節(jié)離子通道的開關。④結(jié)構(gòu)異常的突變體蛋白無法正常降解或更新，導致異常蛋白聚集和沉積，造成細胞毒性損害。⑤不同生命時期的鈉通道不能完成發(fā)育時間軸上的相互替代，胎兒型產(chǎn)物持續(xù)存在，成人型不能正常出現(xiàn)。⑥生命體不同部位上理應出現(xiàn)的不同鈉通道不能按預定規(guī)律出現(xiàn)在正常部位而出現(xiàn)異位表達?；谝陨?方面的異常也將成為未來鈉通道疾病治療策略選擇的主要方向。目前，以寡核苷酸化合物靶向封閉SCN1A反義RNA使SCN1A基因高表達，已在DS小鼠上顯示出緩解病情的效果[40]，在對發(fā)病機制研究的基礎上，更多治療方法的出現(xiàn)成為可能。

6 總 結(jié)

作為鈉通道密切相關的兒童難治性癲癇的一種代表性疾病，SMEI具有極高的致死率及致殘率，SCN1A基因的異常不僅在80%的SMEI患者中檢出，也常見于熱性驚厥附加癥和熱性驚厥患者，其中部分基因突變相同的患者表現(xiàn)出的疾病表型并不完全相同，其原因與以下6種因素相關：本身的亞基成分對應的基因異常、選擇性剪切程序的異常、配體基因的多態(tài)性、輔助定位蛋白對應的基因多態(tài)性、發(fā)育過程的表達調(diào)控異常等多種基因的累積效應，以及同一生理過程產(chǎn)生的通路上其他基因的多態(tài)性形成的功能差異的累積效應，可解釋SCN1A同一突變位置的臨床表型存在多樣性，突變位置與臨床表型無顯著關聯(lián)。神經(jīng)細胞的興奮性最終并不取決于單個離子通道功能的狀態(tài)，而是取決于離子通道蛋白在關鍵部位聚集形成的離子通道蛋白簇整體的電生理狀態(tài)以及它與其他離子通道或轉(zhuǎn)運體的聯(lián)動效應對細胞的興奮性、動作電位的產(chǎn)生、傳播的影響。對鈉通道整體的生理、電生理、解剖、胚胎學相關研究，使我們對SMEI有了新的認識，進一步揭示Nav1.1的結(jié)構(gòu)及其功能調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)因子，SCN1A基因表達的調(diào)控，對開發(fā)SMEI的治療方法具有重要意義。Nav1.1結(jié)構(gòu)的解析及功能調(diào)節(jié)位點的發(fā)現(xiàn)、SCN1A表達的調(diào)控是探索SMEI發(fā)病機制及未來開發(fā)治療方法的關鍵，相關研究需要臨床與基礎研究相結(jié)合，功能與結(jié)構(gòu)并重，基因與蛋白同行，未來SMEI的治療將趨向多元化及個性化。