柏樹花粉主要致敏蛋白Cup a 1的分離純化

陳晴，岳詩雨，張曉楠，何韶衡

過敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一，是當前世界性的衛(wèi)生學問題[1]。柏樹花粉(Cypresspollen)是引起季節(jié)性過敏性疾病最常見的原因之一，國內外對柏樹花粉致敏蛋白組分的相關研究報道結果不盡相同[2]。為了減少在主要過敏原水平上引入任何可能的人工制品的風險，開發(fā)快速的提取方法，得到主要的過敏原富集物是研究的關鍵，可對當地過敏性性疾病進行診斷和治療。本研究使用40 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為提取液對柏樹花粉致敏蛋白進行粗提取，利用離子交換層析初步純化其主要致敏蛋白Cup a 1，使用離子交換色譜和SDS-PAGE等方法對遼寧省錦州地區(qū)柏樹花粉致敏蛋白組分進行分離、鑒定，為本地區(qū)花粉過敏的診斷及治療提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

花粉原料為中國柏樹(Cypress)花粉，2017年4月柏樹花粉季內于遼寧省錦州市錦州醫(yī)科大學采集，采集后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 主要儀器與試劑

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽(Bio-Rad，美國)；AKTA Pure蛋白分離純化儀(GE，美國)；Azure C300化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Azure，美國)；Micro17R臺式冷凍離心機(Thermo，美國); Cascada Ⅲ 全新智能純水/超純水一體化系統(tǒng)(Pall，美國)；甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、丙烯酰胺、N, N-亞甲基二丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、KH2PO4、NH4HCO3和十二烷基硫酸鈉(SDS)(國藥集團，上海，中國)；蛋白相對分子質量標準(Takara生物技術有限公司，大連，中國)。

1.3 柏樹花粉粗提液提取

稱量柏樹花粉1.00 g，用20 mL 4 ℃ 10 mmol/L KH2PO4快速清洗，5 000×g離心除去上清液，將花粉沉淀轉移至陶瓷研缽，加入液氮快速研磨，加入20 mL 40 mmol/L NH4HCO3緩沖液將花粉轉移至50 mL燒杯中，4 ℃下攪拌過夜，在4 ℃下，20 000×g離心花粉混懸液30 min，保留上清，用0.45 μm濾器過濾上清，4 ℃保存[2]。

1.4 柏樹花粉致敏蛋白Cup a 1分離純化

結合液A：40 mmol/L NH4HCO3，洗脫液B：1 000 mmol/L NH4HCO3。首先用20%乙醇清洗系統(tǒng)泵，然后將離子交換層析柱HiTrap Q HP (1 mL，GE Healthcare)柱子連接到AKTA pure儀器上，再用結合液A清洗樣品泵。然后用5個柱體積 A平衡柱子。通過樣品泵上樣，使用20% B沖洗3個柱體積，洗去未結合的蛋白質，逐漸增加洗脫液B濃度40%，沖洗3個柱體積，同時收集洗脫液，最后增加洗脫液B濃度80%。

1.5 純化后柏樹花粉致敏蛋白Cup a 1鑒定

采用SDS-PAGE體系對各組分蛋白進行分析鑒定。12%分離膠和5%濃縮膠對柏樹花粉粗提液和經離子交換層析分離后每一份蛋白組分進行電泳分離，電泳凝膠用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色，脫色和用凝膠電泳成像系統(tǒng)分析并進行圖像采集，與蛋白質標準比對后確定蛋白質的相對分子質量。

2 結果

2.1 柏樹花粉粗提液的SDS-PAGE

柏樹花粉粗提液中主要有20余條蛋白區(qū)帶，主帶有6條，相對分子質量分別為70 000、45 000、43 000、36 000、24 000、17 000, 其中43 000為柏樹花粉中的主要過敏原蛋白質。在25 000～100 000和10 000～17 000區(qū)帶內的蛋白含量相對豐富(圖1)。

2.2 Cup a 1的分離純化

2.2.1 柏樹花粉粗提液的離子交換層析

陽離子交換層析結果見圖2，其中Ⅲ為含目的蛋白Cup a 1的收集峰。

圖 1 柏樹花粉粗提液中主要蛋白質分布Fig 1 SDS-PAGE of major proteins in crude extract of Cypress pollenMr:相對分子質量；M：蛋白marker；1：40 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為提取液

圖 2 陽離子交換層析色譜結果Fig 2 Result of cation exchange column chromatography

2.2.2 SDS-PAGE鑒定

選擇圖2中標注的5個收集液進行SDS-PAGE分析(圖3)，其中Lane 3對應的Ⅲ收集液SDS-PAGE可見明顯相對分子質量為43 000蛋白條帶，即目的蛋白Cup a 1。

圖 3 陽離子交換層析SDS-PAGE結果Fig 3 SDS-PAGE results of cation exchange column chromatographyMr:相對分子質量；1～5分別對應Ⅰ～Ⅴ號收集液的蛋白條帶

3 討論

花粉過敏(pollen allergy)又稱枯草熱(pollinosis)，是致敏花粉所引起的鼻黏膜炎癥、過敏性哮喘和過敏性結膜炎等癥狀[3-4]。

柏科植物(Cupressaceae)在國內外分布都極為廣泛，1945年最早報道人類對柏樹花粉過敏，在北美和澳大利亞，它們是造成呼吸道過敏非常重要的原因[5]。柏科花粉過敏癥的臨床數據和流行病學數據因物種和地區(qū)而有所不同。在不同種類的柏科植物系家族中，地中海柏木亞科類植物占很大一部分，并且已經被確認為是冬季過敏癥與日俱增的“元兇”[6]。在日本主要的花粉過敏源是日本雪松(日本柳杉)(Japanese cedar)[5]。在中國，柏樹花粉是北部沿海地區(qū)春季主要致敏花粉[7]。據報道，3月份北京協和醫(yī)院的花粉過敏患者中，60%由柏樹花粉引發(fā)，圓柏(Chinese juniper)是目前北京地區(qū)3～4月上旬造成過敏性鼻炎和結膜炎最主要的原因[8]。冬季周期性頻發(fā)的鼻炎對抗生素療法無響應證明了臨床現象也很大程度上表現為柏樹過敏癥[9]。

柏樹花粉中主要的致敏成分是蛋白質，對柏樹花粉過敏性提取物的表征表明，該花粉至少含有6種對IgE反應的成分，主要為相對分子質量43 000的糖蛋白(Cup a 1)[10]。與高碳水化合物含量相比，這些提取物中的蛋白質含量非常低。因此，碳水化合物部分在花粉提取物中的作用是一個重要的問題，糖基可參與人IgE的結合，可能是提取物之間廣泛交叉反應的原因[11-12]。柏樹花粉提取物目前被應用于柏科花粉病的診斷和免疫療法，然而，商業(yè)化用于體外檢測的試劑盒常常對有癥狀的患者提供不明確或假陰性的結果，因此有必要對柏樹花粉的主要過敏原進行分離純化，以實現對花粉過敏患者特異性的診斷與治療[12-13]。

本研究通過對柏樹花粉粗提液中主要致敏蛋白Cup a 1分離純化，使用40 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為提取液對柏樹花粉致敏蛋白進行粗提取，利用離子交換層析初步純化。結果表明，使用40 mmol/L NH4HCO3進行提取時，粗提液中Cup a 1含量最高(相對分子質量43 000)，而其他蛋白含量較少，通過利用酸性緩沖溶液10 mmol/L KH2PO4(pH 4.3)溶液對花粉進行快速清洗，溶解花粉中的碳水化合物，再利用堿性緩沖液40 mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)作為提取液進行提取過程，免除了脫鹽、透析和冷凍干燥等繁瑣過程，避免了蛋白質的降解，其堿性低鹽的成分可以提取少量的蛋白質，其中過敏原蛋白為提取液的主要蛋白成分。陽離子交換層析結果，主要致敏原蛋白Cup a 1主要分布在Ⅲ峰，經SDS-PAGE分析，與國內外報道的Cup a 1相對分子質量43 000[2]相一致。純化后的Cup a 1具有應用于制備過敏原皮試液或脫敏制劑和提高柏樹花粉皮試陽性率及脫敏療效的潛在價值，還有望開發(fā)成體外檢測試劑，為臨床柏樹花粉變態(tài)反應的診斷和治療奠定基礎。本研究利用離子交換層析對柏樹花粉粗提液進行分離，成功純化出柏樹花粉主要致敏蛋白Cup a 1。