RACK1在子宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

袁浩鑫，邢利青，盧 燁，范清娥

（1.大同市第五人民醫(yī)院，山西大同 037000；2.山西大同大學(xué)第一臨床醫(yī)院，山西大同 037009）

子宮頸癌（cervical cancer）是來(lái)源于子宮頸上皮的惡性腫瘤，主要組織學(xué)類(lèi)型是鱗癌,腺癌次之[1]。在世界范圍內(nèi),子宮頸癌是女性發(fā)病第4 位的惡性腫瘤。生活在較不發(fā)達(dá)地區(qū)的婦女,子宮頸癌是繼乳腺癌之后的第2 大常見(jiàn)婦女惡性腫瘤,占全球新發(fā)病例的84%，其病死率在所有女性惡性腫瘤中居于第2 位[2]。近年來(lái)該病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)且年輕化[3-4]。子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活狀況[5]。探索表達(dá)異常的生物學(xué)標(biāo)志物,為早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療宮頸癌提供新的思路具有重要意義。激活的蛋白激酶C 受體1（receptor for activated C kinase 1，RACK1）蛋白是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)接頭蛋白,是一種錨定蛋白,可參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路,進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和分化等過(guò)程,與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[6-8]。RACK1 在多種惡性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)較高，但其在子宮頸癌中的表達(dá)研究較少。本研究采用免疫組化兩步法及RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連鎖反應(yīng)）測(cè)定RACK1 在宮頸癌組及癌旁組的表達(dá)，旨在探討RACK1 在宮頸癌中的表達(dá)情況，探討其在宮頸癌中的作用，為宮頸癌的早期診斷和治療帶來(lái)新的契機(jī)。

1 資料

選取大同市第五人民醫(yī)院2015 年1 月-2018 年12 月收治的經(jīng)腹腔鏡或開(kāi)腹手術(shù)治療且病理學(xué)檢查確診為子宮頸癌的組織標(biāo)本100例作為宮頸癌組，同時(shí)取距宮頸癌組織3 cm 以上的宮頸組織作為癌旁組60 例。病例年齡在32～69 歲之間，平均49±7 歲。病理類(lèi)型：鱗癌67例（其中特殊類(lèi)型隆起型中分化鱗癌2 例、非角化型鱗狀上皮癌1 例），腺癌33 例（其中特殊類(lèi)型宮頸基底細(xì)胞樣腺癌1例）。采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009 年）的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期40 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期11 例。分化程度：高31例，中41例，低28例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合宮頸癌臨床診斷且均經(jīng)手術(shù)治療者；②病理學(xué)檢查最終確診為子宮頸癌的病例；③臨床資料完整，輔助檢查完善；④手術(shù)前未經(jīng)過(guò)化療、放療及免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性子宮頸癌；②年齡較大，且合并嚴(yán)重的心腦血管疾病及精神疾病等系統(tǒng)性疾病無(wú)法耐受手術(shù)者；③合并其它生殖系統(tǒng)惡性腫瘤者；④患有其它系統(tǒng)惡性腫瘤者；⑤臨床資料不完整，缺失，難以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及缺少病理標(biāo)本者。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有參與者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

2 方法

2.1 免疫組織化學(xué)染色

2.1.1 方法（En Vision 兩步法）

將各組織石蠟包塊切成5 μm 厚度的石蠟切片，常規(guī)脫蠟，免疫組化采用En Vision 兩步法，DAB 顯色。PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，具體染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)試劑盒、一抗RACK1 均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.1.2 結(jié)果判讀

RACK1 蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，著色呈淺黃色、黃色、棕黃色和黃褐色。取有代表性的10 個(gè)高倍視野在高倍鏡（×400）下觀察計(jì)數(shù)，根據(jù)著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分。著色強(qiáng)度：淡棕色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3 分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，按百分比計(jì)數(shù)：1 分（＜25%），2 分（25%～50%)，3 分（＞50%～75%)，4分（＞75%）。每張切片染色陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分×每張切片染色強(qiáng)度評(píng)分得出的結(jié)果，即為免疫組化反應(yīng)評(píng)分，＜4分為陰性，≥4分為陽(yáng)性。

2.2 反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連鎖反應(yīng)RT-PCR

用Oligo6 軟件進(jìn)行RACK1 引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用Trizol 試劑提取宮頸癌組織及宮頸癌旁組織總RNA，并用核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA 含量，取2 μg 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用合成的cDNA 為模板，用PCR 儀分別進(jìn)行擴(kuò)增RACK1 mRNA 以及內(nèi)參基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，其中GAPDH上游引物序列為5′-AGTCTTGCTAGCTACGCG CCT-3′，下游引物序列為5′-CGCTAAAGCTAG CTACGCATCGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為195 bp。RACK1上游引物序列為5′-TAGCGGCTAACGTTTACGC C-3′，下游引物序列為5′-AGGCTGCTAGCTAAC CGTCAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為324 bp。循環(huán)條件為：90 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，12 ℃保存。PCR 結(jié)束后，各取5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，后經(jīng)溴化乙錠染色，采用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定RACK1/GAPDH 的灰度比，作為RACK1mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)3 次，采用SPSSl8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RACK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

宮頸癌組RACK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為66.00%（66/100），高于宮頸癌旁組陽(yáng)性表達(dá)率8.33%(5/60)，2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.2 宮頸癌組與宮頸癌旁組中RACK1 蛋白表達(dá)情況比較

RACK1 蛋白在低分化宮頸癌組織中的表達(dá)率高于高、中分化者,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）,而在國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009年）臨床分期、浸潤(rùn)深度及不同病灶直徑宮頸癌組織中的RACK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌組中RACK1蛋白表達(dá)差異

3.3 反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連鎖反應(yīng)（RT-PCR 法）測(cè)定RACK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

用RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示，宮頸癌組RACK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量平均值（0.798±0.124）高于宮頸癌旁組平均值（0.269±0.076），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.479，P=0.000）。反應(yīng)產(chǎn)物條帶見(jiàn)圖1。

4 討論

宮頸癌的惡性程度及對(duì)女性身體健康的危害不容置疑。目前已知13～15 種HPV 與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和子宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)[1]。在發(fā)達(dá)國(guó)家已建立完善的宮頸癌疫苗接種體系。目前，二價(jià)、四價(jià)、九價(jià)宮頸癌疫苗已在我國(guó)獲得批準(zhǔn)使用，但疫苗不能覆蓋所有致病的HPV 型別。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療子宮頸癌，對(duì)于女性身體健康仍至關(guān)重要。RACK1 分子是一種錨定蛋白，可以調(diào)控多條信號(hào)通路，引發(fā)信號(hào)分子形成復(fù)合物，從而調(diào)控基因表達(dá)，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，RACKl 在乳腺癌、肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)呈陽(yáng)性且升高[9-12]。本研究結(jié)果顯示RACK1蛋白在宮頸癌組陽(yáng)性表達(dá)率高于宮頸癌旁組；在低分化宮頸癌組織中的表達(dá)率高于高、中分化者，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中的表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。而在FIGO 分期、浸潤(rùn)深度及不同病灶直徑方面無(wú)明顯差異。

綜上所述，RACK1 在宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)較高，且其表達(dá)與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，隨著進(jìn)一步的研究與探索，RACK1 有可能會(huì)作為評(píng)估子宮頸惡性病變生物學(xué)行為的潛在分子標(biāo)志物，為早發(fā)現(xiàn)、早診斷宮頸癌提供理論依據(jù)。針對(duì)RACK1靶基因的治療，可能會(huì)成為宮頸癌治療的一種全新而有效的方法，可為宮頸癌的治療提供新的思路，為以后進(jìn)一步的研究和更好的指導(dǎo)臨床工作打下基礎(chǔ)。