中藥渣固態(tài)發(fā)酵前后蛋白質(zhì)和多糖含量的變化

白 海，高 陽，劉麗敏，馬 毅

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；3.天津通和飼料有限公司博士后科研工作站，天津 301700；4.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同 037009；5 天津畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112）

我國對傳統(tǒng)中藥的使用具有悠久的歷史，且其種類繁多，資源豐富，并在最近的新型冠狀病毒肺炎的治療過程中發(fā)揮了重要作用[1]。隨著我國中醫(yī)藥工業(yè)的不斷發(fā)展，人們對中醫(yī)藥需求不斷增加，如各類保健品、中成藥等，致使中藥廢棄物也越來越多，由大型制藥廠產(chǎn)生藥渣約占總量70%，而中藥渣主要是通過填埋、燃燒等方式進行處理，這樣做會消耗大量的時間、人力，造成資源浪費、環(huán)境污染，這不僅為中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，也為生產(chǎn)廠家?guī)硖幚黼y題，更為生態(tài)環(huán)境的保護帶來了諸多難題[2]。有研究表明，中藥提取后，中藥渣還含有一定功效成分，如蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸和微量元素等營養(yǎng)成分的存在，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[3]。隨著微生物技術(shù)和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，以中藥渣為原始材料，大規(guī)模地發(fā)酵生產(chǎn)具有功能性營養(yǎng)的飼料，不僅可以減少中藥資源的浪費，減輕對環(huán)境造成的污染，而且可以解決飼料供應(yīng)不足問題，同時這種新型飼料還可以增強動物對疾病的抵抗力、促進動物體內(nèi)新陳代謝、改善動物生長性能等作用，是一項具有發(fā)展?jié)撃艿男录夹g(shù)。將其應(yīng)用在飼料添加劑、獸藥等方面，可實現(xiàn)中醫(yī)藥資源的再利用，為中藥渣的綜合利用提供一條新途徑[4-5]。

本試驗以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母菌作為發(fā)酵菌種，研究了3種菌種不同復(fù)配比例對中藥渣固態(tài)發(fā)酵的影響，可為探究中藥渣殘留物制備飼料添加劑的工藝應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，黑曲霉（Aspergillus nige），購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 中藥渣復(fù)合物

試驗采用的中藥渣復(fù)合物為治療高血壓的中藥渣，經(jīng)干燥粉碎后備用。該藥渣主要由煎熬浸取后的茯苓、甘草、蒲公英等組成，測得其初始蛋白質(zhì)含量為6.76%，多糖含量為8.83%。

1.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

10 g 中藥渣，20 g 瓊脂，30 g 玉米粉，1 L 蒸餾水，初始pH 7.5，121 ℃滅菌20 min，用于混合菌種固態(tài)發(fā)酵試驗。

1.4 試驗儀器

電子天平JH1102(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），潔凈工作臺SW-CJ-2F(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），生化培養(yǎng)箱SPX-100B-Z(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），微波爐G70F20N2L-DG(廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-100SII(上海博迅超溫保護壓力蒸汽滅菌器），紫外/可見分光光度計UV-1200(上海美國譜達儀器有限公司），三孔三溫恒溫水浴鍋XMTD-204(金壇市盛威試驗儀器廠）。

1.5 試驗方法

1.5.1 混合菌種間比例的確定

分別稀釋3 種不同的菌，使菌懸液的濃度為1×108cfu/mL，將菌懸液按試驗比例接種到培養(yǎng)基上，在37 ℃下靜置培養(yǎng)一段時間，取出后用微波爐烘干，取0.1 g的樣品融于10 mL蒸餾水中，測定發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖和蛋白質(zhì)含量，以選定最佳菌種配比。

1.5.2 固態(tài)發(fā)酵水平下單因子試驗

分別測量在不同初始pH 值、初始玉米粉含量、發(fā)酵時間和菌液接種量下發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)和多糖含量變化，以確定最適條件。

1.5.3 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

選取發(fā)酵后產(chǎn)物中多糖和蛋白質(zhì)的含量作為評價指標(biāo)，選擇與預(yù)試驗相同的單因子進行試驗，各取3個水平進行測量。

1.6 測定方法

1.6.1 多糖的測定

采用3,5-二硝基水揚酸法(簡稱DNS 法)測定多糖的含量[6]。

1.6.2 蛋白質(zhì)的測定

采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定蛋白質(zhì)含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種比例對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖的影響

單一菌株的酶系統(tǒng)相對中藥渣底物來說不完整，對發(fā)酵基質(zhì)的轉(zhuǎn)換有一定的限制，而不同菌種組合可以克服上述不利的因素。本試驗使用多菌株的組合來協(xié)調(diào)發(fā)酵，并且期望每個菌株的酶系統(tǒng)通過彼此互補來增加蛋白質(zhì)與多糖的產(chǎn)量。在該試驗中，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種了枯草芽孢桿菌：產(chǎn)朊假絲酵母菌：黑曲霉，其比例分別為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶2∶2、2∶1∶2、2∶2∶1，試驗結(jié)果見圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)枯草芽孢桿菌∶產(chǎn)朊假絲酵母菌∶黑曲霉為1∶2∶1時，發(fā)酵后的蛋白質(zhì)和多糖含量都是最小值；當(dāng)比例為1∶2∶2、2∶1∶2 和2∶2∶1 時，蛋白質(zhì)含量都十分接近，故不能單獨作為參考指標(biāo)，需結(jié)合多糖含量來確定最佳菌種比例。當(dāng)比例為2∶1∶2時，蛋白質(zhì)和多糖含量均達到最高，分別為4.23%和5.37%，所以選擇發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量最高的一組進行后續(xù)試驗。

圖1 混合菌種不同比例對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)和多糖的影響

2.2 不同因素對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

2.2.1 初始玉米粉含量對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

細菌的生長和繁殖需要足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，而氮源的含量在細菌的生長中起著重要的作用。本次試驗以玉米粉為氮源，探究不同初始玉米粉含量對微生物生長和發(fā)酵的影響。圖2 是發(fā)酵培養(yǎng)基初始玉米粉含量分別為0.1、20、30、40、50 mg/mL 時發(fā)酵后蛋白質(zhì)與多糖的含量的測定結(jié)果。

圖2 玉米粉含量對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

由圖2 可知，在固態(tài)發(fā)酵的過程中，適量的玉米粉含量可以為微生物提供足量的氮源，并且有利于微生物的發(fā)酵。玉米粉含量過少可導(dǎo)致氮源不足，不能使微生物正常的生長，從而影響其發(fā)酵效果，導(dǎo)致發(fā)酵后的蛋白質(zhì)及多糖含量較低；玉米粉含量過多，可能會導(dǎo)致培養(yǎng)基水分不足，從而抑制微生物的生長代謝。當(dāng)玉米粉含量達到30 mg/mL 時，微生物發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖的含量都達到最佳，分別為2.85%和0.41%。因此，選擇添加30 mg/mL 玉米粉作為氮源進行后續(xù)試驗。

2.2.2 初始pH值對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

在微生物生長過程中，pH 值直接或間接的影響細菌的正常生長，其過高或過低都會影響生長速率，不利于發(fā)酵過程，培養(yǎng)基的初始pH 值與混合菌種的生長發(fā)酵有著直接的關(guān)系。

由圖3 可以看出，在初始pH 值為7.5 時，微生物發(fā)酵后蛋白質(zhì)與多糖的含量均達峰值，分別為6.74%和0.75%。大于或小于此pH 值時，發(fā)酵后蛋白質(zhì)的含量均降低，在pH 值為6.5 時，多糖含量為0.72%，而蛋白含量僅為3.11%。

圖3 初始pH值對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

2.2.3 混合菌種接種量對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

在發(fā)酵過程中，微生物的數(shù)目也是重要的一環(huán)。在最適的菌種配比下，菌種數(shù)目不足，會大大影響發(fā)酵的速率，浪費時間及材料，增加了不必要的成本；而菌種數(shù)目過多，又可能會增加微生物之間的競爭，造成培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗太快，不利于其發(fā)酵過程?；旌暇N初始接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%時發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)和多糖含量的變化如圖4所示。

圖4 接種量對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

圖4 表明了不同的接種量對發(fā)酵的影響。由圖可知，隨著接種量的增加，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先降低再增加，到達最高后又出現(xiàn)的小幅的減少；多糖的含量一開始就出現(xiàn)不斷增長的趨勢，并在接種量為3%時達到最大，隨后顯著降低。只有當(dāng)接種量為3%，發(fā)酵物中的蛋白質(zhì)與多糖的含量都相對穩(wěn)定，并可以取得良好的發(fā)酵結(jié)果。所以，選擇初始接種量為3%最佳。

2.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

菌種的發(fā)酵時間對復(fù)合中藥渣發(fā)酵生產(chǎn)功能性飼料具有重要的參考價值。發(fā)酵時間過長，會導(dǎo)致在有限的空間范圍內(nèi)，微生物之間的競爭加劇，導(dǎo)致細菌的自溶，菌體數(shù)目下降，蛋白質(zhì)和多糖的含量降低；發(fā)酵時間太短，則發(fā)酵后產(chǎn)量過低。發(fā)酵時間對混合菌種發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響如圖5所示。

由圖5 可知，在前4 d，蛋白質(zhì)與多糖的含量均有下降，是因為在前期微生物生長的過程中，不斷地消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)以供自己所需。在第5 d 時，蛋白質(zhì)含量有所提升；第6 d 時，蛋白質(zhì)與多糖含量達到最高，蛋白質(zhì)含量為9.96%，多糖含量為8.95%；第7 d 時，蛋白質(zhì)與多糖含量再次開始下跌。因此最佳發(fā)酵時間為6 d。

圖5 接種時間對發(fā)酵后蛋白質(zhì)和多糖含量的影響

3 結(jié)論

本試驗選取枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、黑曲霉作為發(fā)酵菌種，對中藥渣（包括甘草、茯苓、蒲公英等常見中藥種類）進行發(fā)酵，以蛋白質(zhì)含量和多糖含量作為主要評價指標(biāo)，確定了最佳工藝條件：接種比例枯草芽孢桿菌∶產(chǎn)朊假絲酵母∶黑曲霉2∶1∶2，接種量3%，添加30 mg/mL 玉米粉作為氮源，初始pH 7.5，發(fā)酵6 d 后，發(fā)酵底物中蛋白質(zhì)含量為9.96%，多糖含量為8.95%，蛋白質(zhì)含量比未發(fā)酵藥渣提高了47.3%，多糖含量提高了1.4%。

目前，全國產(chǎn)生的藥渣殘留物質(zhì)量很大，諸如各大藥廠制藥后所剩藥渣，煎制中藥后所剩殘留物等。已有研究表明，在飼料中添加中藥渣可以促進畜禽的生長發(fā)育[8-9]。如果可以將這種方法廣泛應(yīng)用，選用適合的混合菌種進行中藥渣的發(fā)酵，促使藥渣中的蛋白質(zhì)、多糖含量增加，將其發(fā)酵產(chǎn)物作為功能性飼料資源或農(nóng)業(yè)化肥使用，減少了環(huán)境污染，避免了資源浪費。