甲基紅褪色光度法測(cè)定司帕沙星含量的研究

李新華，袁 泉，岳志勁，劉永文

（山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

司帕沙星是第三代喹諾酮類抗菌藥，其藥理作用是通過阻礙細(xì)菌的DNA合成而產(chǎn)生殺菌作用，對(duì)多種細(xì)菌有強(qiáng)大抗菌作用，因此對(duì)微生物感染的相關(guān)疾病都有良好的治療作用，主要用于呼吸、泌尿、腸道、膽道、皮膚軟組織等感染。目前，測(cè)定司帕沙星含量的方法主要有毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法[1]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[2]、高效液相色譜法[3]、熒光猝滅法[4]、紫外分光光度法[5]等，但未見司帕沙星與甲基紅反應(yīng)形成荷移絡(luò)合物的褪色光度法測(cè)定司帕沙星含量的報(bào)道。

以甲基紅為顯色劑，通過其與司帕沙星作用，使甲基紅發(fā)生明顯的褪色反應(yīng)[6-11]，根據(jù)吸光度值的降低來測(cè)定司帕沙星藥片中的司帕沙星含量。該法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，無需昂貴的儀器及試劑，與文獻(xiàn)比較結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

FA2204 電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；722E 分光光度計(jì)、PHS-3C 型精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；HH-2 恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

1.00× 10-3mol/L 司帕沙星儲(chǔ)備液：取0.039 2 g司帕沙星對(duì)照品（含量99.8%，中國(guó)藥品生物制品鑒定所），用無水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶，并用黑色塑料膜包裹，避光保存，用時(shí)用無水乙醇稀釋至所需濃度。

1.00× 10-3mol/L 甲基紅溶液：取0.026 9 g 甲基紅，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，用時(shí)用無水乙醇稀釋至所需濃度。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液：取5.90 mL 冰醋酸稀釋至500 mL，配成0.2 mol/L 的醋酸溶液；取13.808 g 醋酸鈉，稀釋至500 mL，配成0.2 mol/L 的醋酸鈉。以不同比例配成不同pH值的緩沖溶液。

其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

司帕沙星片（大同五洲通制藥有限責(zé)任公司）為市售品，批號(hào)20190401，規(guī)格0.1 g×6片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL 的容量瓶中加入4.00 mL 的1.00×10-4mol/L甲基紅溶液和1.00 mL pH=3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，再加入一定量的司帕沙星儲(chǔ)備液，加水定容，搖勻。靜置10 min，用1 mL 的比色皿測(cè)定吸光值（λ=553 nm），計(jì)算ΔA=A0-A。其中A0為空白試劑的吸光度值，A為含有司帕沙星的試劑的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜與機(jī)理討論

用SP-722E 型分光光度計(jì)，分別對(duì)甲基紅-司帕沙星溶液（以空白試劑為參比）和甲基紅溶液、司帕沙星溶液、甲基紅-司帕沙星溶液（以水為參比），在320～700 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，得到吸收光譜曲線（圖1）。由圖1 可知，當(dāng)以水為參比時(shí)甲基紅在530 nm 處有最大吸收峰（曲線a）；而司帕沙星相對(duì)水而言溶液幾乎沒有吸收（曲線c）；向甲基紅溶液中加入司帕沙星溶液之后，吸光值降低，波峰藍(lán)移至510 nm處，在350～500 nm 之間較不加入司帕沙星溶液的吸光值高，在500～630 nm 之間的吸光值較不加入司帕沙星溶液的吸光值低（曲線b）；以試劑空白為參比時(shí)，加入司帕沙星的甲基紅溶液在553 nm 處形成波谷（曲線d）。以上事實(shí)表明，甲基紅與司帕沙星在波長(zhǎng)500～630 nm之間發(fā)生了褪色反應(yīng)。

圖1 司帕沙星-甲基紅體系的吸收光譜

司帕沙星對(duì)甲基紅褪色反應(yīng)的機(jī)制可能是由于司帕沙星的分子結(jié)構(gòu)中-F 富電子，可作為給電子體；甲基紅中苯環(huán)的羧基及鄰位的氮氮雙鍵的相互作用，使兩個(gè)苯環(huán)電子云密度降低，苯環(huán)缺電子，可作為受電子體。因此，在pH=3.5 的條件下，甲基紅中缺電子的苯環(huán)與司帕沙星中富電子的-F 通過電荷荷移形成1∶1 的絡(luò)合物[11]（配位比的測(cè)定用等摩爾系列法）。反應(yīng)機(jī)理見圖2。

圖2 反應(yīng)機(jī)理

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

以試劑空白為參比，553 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)，以4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 甲基紅濃度和用量的影響

選取10 個(gè)10 mL 的容量瓶，分為A、B 2 組，其中A 組作為空白對(duì)照。在A、B 組中分別加入1.00×10-4mol/L 甲基紅溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，再依次加入1.00 mL 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=3.5)，然后在B 組溶液中加入4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL。按照2.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定ΔA，結(jié)果見圖3。由圖可知，當(dāng)甲基紅的用量在1.00～4.00 mL(即甲基紅的濃度為1.00×10-5～4.00×10-5mol/L)時(shí)，溶液的吸光度降低值ΔA隨甲基紅的用量增加而增大；當(dāng)甲基紅的用量為在4.00～5.00 mL(即甲基紅的濃度為4.00×10-5～5.00×10-5mol/L)時(shí)，溶液的吸光度降低值ΔA隨甲基紅的用量增加而降低。這可能是因?yàn)榧谆t與司帕沙星締合后，過量的甲基紅溶液使締合物的吸光值受到影響。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇甲基紅的用量為4.00 mL，即甲基紅溶液的濃度為4.00×10-5mol/L。

圖3 甲基紅濃度的影響

2.2.2 緩沖溶液和pH的探討

實(shí)驗(yàn)比較了醋酸-醋酸鈉、Britton-Robinson（BR）、KH2PO4-NaHPO4（PB）、鹽酸-醋酸鈉、六次甲基四胺和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)甲基紅與司帕沙星荷移絡(luò)合物反應(yīng)的影響情況。結(jié)果表明，PB 緩沖體系有渾濁出現(xiàn)，透光度不好；在六次甲基四胺緩沖溶液中無明顯褪色現(xiàn)象；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液褪色現(xiàn)象不明顯，ΔA較??；BR、鹽酸-醋酸鈉、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中褪色現(xiàn)象最為明顯，且三者吸光度下降值ΔA的差值很小。

環(huán)境的酸堿性對(duì)司帕沙星與甲基紅荷移絡(luò)合物解離影響較大，進(jìn)而影響到二者的締合。因此，本實(shí)驗(yàn)首先考慮緩沖體系的pH值對(duì)褪色現(xiàn)象的影響。在酸性堿性中性的緩沖體系下分別做定性實(shí)驗(yàn)，可知在酸性緩沖體系下甲基紅與司帕沙星有褪色現(xiàn)象，因此，選定酸性緩沖體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

選用20個(gè)10 mL的容量瓶分為2組，一組作為空白試劑，在20 個(gè)10 mL 的容量瓶中，依次加入1.00×10-4mol/L 甲基紅溶液4.00 mL、pH 在1.0～5.5 的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液1.00 mL，然后在另一組溶液加入4.00×10-6mol/L的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，2組溶液均用蒸餾水定容至10 mL。按照2.2 節(jié)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定ΔA，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，當(dāng)醋酸－醋酸鈉緩沖溶液的pH=3.5 時(shí)，ΔA值最大，褪色現(xiàn)象最明顯。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還考察了緩沖液用量對(duì)荷移反應(yīng)的影響情況。結(jié)果表明，當(dāng)移取量為1.00 mL時(shí)，褪色現(xiàn)象最明顯，ΔA值最大。因此，本實(shí)驗(yàn)中緩沖溶液的最佳條件為移取1.00 mL pH=3.5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液。

圖4 pH的影響

2.2.3 表面活性劑的影響

試驗(yàn)了陰離子型和陽(yáng)離子型表面活性劑及非離子表面活性劑對(duì)甲基紅－司帕沙星荷移反應(yīng)的影響情況。結(jié)果表明，十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基三甲基銨和曲拉通X－100 對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較小，因此，實(shí)驗(yàn)中不加入任何類型的表面活性劑。

2.2.4 溫度和時(shí)間的影響

（1）時(shí)間對(duì)褪色作用的影響

室溫下，在不同的反應(yīng)時(shí)間10、20、30、40、50 min里，分別對(duì)吸光度降低值ΔA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)應(yīng)的ΔA為0.386、0.386、0.394、0.397、0.397。由此可見，司帕沙星與甲基紅荷移反應(yīng)10 min 時(shí)ΔA為0.386，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)ΔA增加不是太大，因此，實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為反應(yīng)時(shí)間。

（2）溫度對(duì)褪色作用的影響

在15、25、35、45、55、65 ℃分別對(duì)吸光度降低值ΔA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，ΔA值分別為0.380、0.380、0.360、0.342、0.330、0.314?？梢?，當(dāng)溫度為15～25 ℃之間時(shí)，吸光度降低值ΔA幾乎不變化；當(dāng)溫度在25～65 ℃之間時(shí)，ΔA隨溫度的升高逐漸降低。因此，實(shí)驗(yàn)選擇在室溫下進(jìn)行。

2.2.5 加樣順序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

甲基紅和醋酸－醋酸鈉緩沖溶液加樣順序?qū)y(cè)定結(jié)果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，先加甲基紅溶液然后與醋酸－醋酸鈉緩沖溶液混合后再加入司帕沙星溶液作為加樣順序效果最佳。

3 干擾試驗(yàn)

在所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，用4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，考察了常見藥物添加劑及常見離子（分子）對(duì)該測(cè)定方法的影響情況。結(jié)果表明，當(dāng)向4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入淀粉、葡萄糖、賦形劑滑石粉、蛋白質(zhì)、硬脂酸鎂、糊精、組氨酸、色氨酸和乳糖及一些常見金屬離子（Na+、K+、NH4+、Al3+、Ca2+、NO3-、Cl-、Cu2+、Fe3+、Pb2+）實(shí)驗(yàn)表明，一定量的常見金屬離子、無機(jī)酸根離子、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸對(duì)司帕沙星測(cè)定的結(jié)果影響較小，相對(duì)誤差均小于5%。所以，本法具有較高的選擇性，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00、2.20、2.40、2.60、2.80、3.00 mL 1.00×10-5mol/L 司帕沙星乙醇溶液加入10 mL容量瓶中，按照上述的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖5。

圖5 司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

ΔA與司帕沙星的濃度在1.00×10-6～3.00×10-6mol/L 范圍內(nèi)呈線性，線性方程為ΔA=0.14936c+0.09909，r2=0.997。計(jì)算出表觀摩爾吸光系數(shù)為K=2.10×105L/（mol?cm）。再做20次空白實(shí)驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，求出標(biāo)準(zhǔn)偏差δ=1.00×10-3，按檢出限的計(jì)算公式CLOD=3×δ/K，求得檢出限D(zhuǎn)=6.00×10-7mol/L。

5 實(shí)際樣品的測(cè)定

5.1 司帕沙星試樣的制備

稱取0.239 4 g 司帕沙星片劑，研磨均勻，用乙醇溶解，抽濾，洗滌，除去不溶物，定容于250 mL容量瓶中，搖勻，備用。再取1 mL稀釋到100 mL容量瓶中。

5.2 試樣的測(cè)定

取2.00 mL 的試樣溶液于10 mL 容量瓶中，用上述1.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照工作曲線求得2.00 mL 中司帕沙星的含量，然后加入一定量的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 藥物制劑中司帕沙星含量的測(cè)定及回收率

6 結(jié)論

試驗(yàn)了司帕沙星與甲基紅在酸性條件下形成荷移絡(luò)合物，在波長(zhǎng)553 nm條件下，發(fā)生褪色反應(yīng)的各種適宜條件。結(jié)果表明，在pH=3.5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中，當(dāng)依次加入4.00 mL濃度為1.00×10-4mol/L的甲基紅溶液、1.00 mL的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液和一定量的司帕沙星溶液，常溫下放置10 min 左右，此時(shí)甲基紅與司帕沙星已完全荷移，使甲基紅溶液發(fā)生明顯的褪色現(xiàn)象，體系非常穩(wěn)定，且在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。司帕沙星與甲基紅溶液反應(yīng)形成配位比1∶1的荷移絡(luò)合物，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了藥物制劑中司帕沙星的含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.52%，回收率為101.5%。該方法操作簡(jiǎn)單、可靠性強(qiáng)、具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，可用于準(zhǔn)確測(cè)定藥劑中司帕沙星的含量。