不同負荷游泳運動對大鼠海馬食欲素A及其受體1表達的影響

張業(yè)廷，李 雪，付 燕，魏翠蘭，袁瓊嘉*

自主運動可以有效改善認知能力以及促進腦健康，強迫運動也可以起到類似的效果（Dishman，1997；Yuede et al.，2018）。運動可能會通過改變不同大腦腦區(qū)神經(jīng)突觸可塑性來影響學習和記憶能力，但具體機制有待進一步研究。海馬是學習與記憶的重要腦區(qū)，其神經(jīng)突觸具有高度的結構可塑性和功能可塑性，在認知調(diào)控中起重要作用（Sun et al.，2018）。有研究表明，運動可以改善海馬神經(jīng)的突觸可塑性，從而改善海馬依賴性學習和記憶過程（Clark et al.，2008；Erickson et al.，2011；Hyodo et al.，2012）。但關于游泳運動對認知影響的相關研究較少，游泳運動對于大鼠而言屬于典型的強迫運動形式。

雖然有研究表明，體育活動可以改善海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生，但運動引起的海馬神經(jīng)可塑性的機制尚不清楚，尤其是強迫運動（Rhodes et al.，2003；Smith et al.，2005）。體育活動通過改變與海馬突觸可塑性相關分子的表達，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)細胞粘附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）等，可以引起神經(jīng)生長，促進長時程增強效應（Long-term potentiation，LTP）過程和海馬依賴性學習記憶（Erickson et al.，2011；Van Praag et al.，1999）。與自愿運動類似，強迫運動可以增強大鼠的空間學習和記憶形成以及海馬BDNF表達（Khabour et al.，2013）。近年來，有研究表明，食欲素（Orexin）及其受體與海馬的神經(jīng)突觸可塑性有關（Chieffi et al.，2017；Laperchia et al.，2017）。

食欲素是一種下丘腦神經(jīng)肽，可與兩種密切相關的G蛋白（OX1/2R）結合。食欲素有兩種類型：食欲素A（Orexin A，OXA）和食欲素B（Orexin B，OXB），食欲素受體1（OX1R）是下丘腦外側分泌的神經(jīng)肽，OX1R與OXA高度相關，研究表明OX1R與學習記憶相關（Chieffi et al.，2017；Rashidy-Pour et al.，2015；Zhao et al.，2014）。雖然食欲素促進行動和認知過程的機制以及促進學習記憶的機制尚未被充分理解，甚至存在爭議，但有研究表明，食欲素在調(diào)節(jié)高級大腦功能方面發(fā)揮著重要作用（Akbari et al.，2006，2007，2008；Jaeger et al.，2002；Li et al.，2017；Mavanji et al.，2017；Raoof et al.，2015；Selbach et al.，2010；Zhao et al.，2014）。如OXA被發(fā)現(xiàn)會導致年輕成年小鼠海馬突觸傳遞的長期增強（Li et al.，2017；Zhao et al.，2014）。研究表明，食欲素可以通過谷氨酸能、去甲腎上腺素能和膽堿能信號，在海馬區(qū)引起突觸可塑性（Chieffi et al.，2017；Selbach et al.，2004）。對于阿爾茲海默癥轉基因小鼠而言，其OXA表達低于野生型小鼠，而將OXA（1.5～3 nmol）注入其齒狀回或藍色黃斑核時，海馬的LTP會顯著增強（Jaeger et al.，2002）。對于正常大鼠而言，顱內(nèi)注射OXA（0.14～0.56 nmol）能夠顯著增強大鼠的學習能力（Telegdy et al.，2002）。相反的是，有研究表明，正常大鼠顱內(nèi)注射OXA（1～10 nmol）會抑制海馬LTP，對大鼠在Morris水迷宮實驗過程中表現(xiàn)的空間記憶能力造成損害（Aou et al.，2003）。大鼠海馬神經(jīng)元缺氧模型伴隨著OXA表達的增加，而OXA可通過介導OX1R加重間歇性低氧血癥引起的海馬神經(jīng)元損傷（Li et al.，2017）。上述研究中出現(xiàn)相互矛盾的結果，可能是由于研究的動物模型（正?；虿±恚?、食欲素劑量/濃度差異所造成的。

目前關于食欲素及其受體在特定運動刺激下表達變化的研究較少，尤其缺乏強迫運動對其表達影響的研究。我們推測一定強度的游泳運動可以影響OXA和OX1R的表達，從而改變大鼠的空間學習和記憶。然而，不同運動負荷對認知的影響可能會有所不同（Dishman，1997；Yuede et al.，2018）。因此，本研究利用不同負荷游泳的運動方式對大鼠進行干預，觀察游泳運動對大鼠空間學習和記憶能力的影響。同時測定OXA和OX1R的表達水平，探討OXA和OX1R的表達水平與空間學習記憶能力的關系。

1 研究對象與方法

1.1 動物飼養(yǎng)

2月齡健康雄性SD大鼠30只，體重為300±20 g，購于成都達碩科技公司。分籠飼養(yǎng)于成都體育學院無特定病原體（SPF）動物實驗中心。室內(nèi)溫度為22°C±2°C，室內(nèi)濕度為45%～65%，采用12 h/12 h白天/黑夜循環(huán)環(huán)境喂養(yǎng)，自由進食與飲水。

1.2 動物分組及運動方案

大鼠適應性喂養(yǎng)第1周結束后，隨機分為3組：對照組（C組）、中等負荷運動組（M組）、大負荷運動組（O組），每組n=10。C組大鼠自然喂養(yǎng)8周，M、O組大鼠進行為期8周的運動干預。游泳運動干預在第2周周一開始，游泳器具為透明玻璃缸（長150 cm，寬60 cm，深50 cm，水溫34°C±2°C）。在游泳運動干預的第1天，M、O組大鼠游泳10 min，之后每天游泳時間遞增5 min，直到第3周周五能夠每天游泳60 min。然后，M組大鼠每天固定進行60 min的游泳運動干預，每周干預6天（周一至周六下午21：00—22：00），游泳運動干預至第9周。O組大鼠從第4周開始繼續(xù)每天游泳時間遞增10 min，至第4周周六每天游泳120 min，隨后每天負重游泳，時間為120 min/天，從第5周開始，大鼠負自身體重游泳，從負自身體重1%至負自身體重5%，每周增加1%，直至第9周負自身體重5%，每周同樣干預6天（周一至周六下午21：00—22：00）（崔笑梅 等，2017；袁瓊嘉 等，2009；Elikov，2016）。

1.3 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗（MWM）于第10周開始，用于評估大鼠空間學習與記憶能力，包括連續(xù)7天的定位航行實驗和60 s空間探索實驗（D’Hooge et al.，2001）。在定位航行實驗中，每天將每只大鼠依次從4個象限中點輕輕放入水中，讓其尋找水下2 cm處固定于第Ⅳ象限的黑色圓形平臺。尋找水下平臺的時間最長為120 s，若超時還未完成，則將大鼠引導至水下平臺并在平臺上保持15 s，同樣的，在120 s內(nèi)能夠?qū)ふ也⒄驹谄脚_上的大鼠也需保持15 s后再撈起。大鼠從入水到找到平臺的時間即為逃避潛伏期，結合大鼠游泳速度可以分析大鼠的空間學習能力。定位航行實驗結束24 h后，拆除水下平臺，進行空間探索實驗。空間探索實驗時，將大鼠從第Ⅱ象限輕輕入水，計時60 s大鼠在第Ⅳ象限中所用的時間及穿過原來水下平臺所在位置的次數(shù)可以用來評價大鼠的空間記憶能力。

1.4 樣本采集

MWM實驗結束24 h后，斷頭處死大鼠，將腦組織迅速從顱骨中取出。各組取4例全腦進行免疫熒光檢測。將各組剩余6例全腦迅速取出其海馬組織，用于Western Blot和Real-time PCR實驗。

1.5 Real-Time PCR實驗

嚴格按照 RNAzol?RTRNA Isolation Reagent（GeneCopoeiaTM，USA）試劑盒說明提取海馬組織mRNA。逆轉錄酶將mRNA樣本反轉錄成互補的DNA（cDNA）。隨后以cDNA為模板，進行Real-Time PCR實驗，反應條件見表1。分析目的基因表達采用2-△△CT（Livak）方法。由Ta-KaRa寶生物工程有限公司設計所需引物，其序列見表2。

表2 PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度Table 2 PCR Primer Sequence andAmplification Product Length

1.6 免疫熒光實驗

通過免疫熒光實驗檢測OXA蛋白表達量。將全腦組織進行冰凍切片，室溫下放置8 min，隨后在4°C環(huán)境下于4%多聚甲醛中固定10 min。用PBS清洗2次后，于4°C環(huán)境下孵育OXA一抗（1：50，R&D Systems USA）過夜。第 2天 PBS清洗后，用熒光抗體（1：100，R&D Systems USA）37°C環(huán)境下孵育1 h。采用DAPI進行核染色。利用OLYMPUS顯微鏡獲得熒光圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光強度（AU/μm2）。

1.7 Western Blot實驗

通過Western Blot實驗檢測海馬組織中OX1R蛋白表達量。用濕轉方法將蛋白質(zhì)轉至PVDF膜上。剪取目的蛋白條帶，用去脂牛奶封閉1 h，之后將帶有目的蛋白的PVDF膜用一抗在4°C冰箱中孵育過夜。第2天，用TBST液洗滌PVDF膜后用二抗室溫孵育1 h；洗滌后進行化學發(fā)光、顯影、定影，獲得目的蛋白印跡圖像。對膠片進行掃描，利用Gel-pro Plus軟件對目的蛋白和內(nèi)參蛋白作光密度（OD）值分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)由SPSS統(tǒng)計軟件進行處理，以均值±標準差（M±SD）表示。各組間相關數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析法，若方差齊性，則用LSD法進行事后檢驗；若方差不齊，則將原始數(shù)據(jù)轉換至齊性后再做統(tǒng)計處理。以P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結果

2.1 大鼠空間學習與記憶能力

在MWM定位航行實驗過程中，各組大鼠的逃避潛伏期均逐漸減少（圖1A），表明各組大鼠都能夠有效的學習尋找水下平臺的技能。每天各組大鼠之間的游泳速度無顯著差異（P＞0.05，圖1B），表明逃避潛伏期未受到游泳速度的影響。M組大鼠在第3天平均逃避潛伏期顯著低于C組及O組（P＜0.05），而C組與O組大鼠在第5天平均逃避潛伏期最短，并且之后各組表現(xiàn)再沒有顯著提升，且C組與O組之間平均逃避潛伏期并無顯著差異（P＞0.05，圖1A）。在MWM定位航行實驗中，M組穿越原平臺所在區(qū)域的次數(shù)顯著高于C組及O組，O組與C組相比有減少的趨勢，但并無顯著差異（P＜0.05，P＜0.01，P＞0.05，圖1C）。

圖1 Morris水迷宮實驗大鼠空間學習與記憶能力Figure 1.Spatial Learning and Memory of Rats in Morris Water Maze Experiment

2.2 海馬OXAmRNA及OX1R mRNA含量

所有檢測基因均在200 bp以下，且無引物二聚體出現(xiàn)，結合它們的擴增曲線和溶解曲線，可以判斷產(chǎn)物是目的基因。M組大鼠OXA mRNA表達量顯著高于C組（P＜0.05，圖2A），但其OX1R mRNA表達量顯著低于C組（P＜0.05，圖2B）。而C組與O組大鼠OXA mRNA及OX1R mRNA表達量無顯著差異（P＞0.05，圖2）。由此看出，OXA mRNA與OX1R mRNA的表達量并不同步。

圖2 海馬OXAmRNA及OX1R mRNA表達情況Figure 2.Expression of OXAmRNAand OX1R mRNA in the Hippocampus

2.3 海馬OXA蛋白及OX1R蛋白含量

激光共聚焦顯微鏡下觀察到海馬區(qū)OXA免疫陽性產(chǎn)物的分布。與C組相比，M組大鼠的免疫陽性產(chǎn)物熒光強度在海馬DG、CA3、CA1 3個區(qū)域較低，說明M組大鼠OXA蛋白表達水平低于C組；O組大鼠免疫陽性產(chǎn)物熒光強度在海馬DG、CA3、CA1 3個區(qū)域與C組無顯著差異，說明O組大鼠OXA蛋白表達水平與C組無顯著差異（P＜0.05，P＞0.05，圖3A～I，圖4A～C）。

圖3 OXA免疫熒光檢測結果Figure 3. OXA Immunofluorescence Assay

圖4 蛋白表達水平Figure 4. Protein Expression Level

Western Blot分析顯示，M組大鼠OX1R蛋白表達水平顯著低于C組（P＜0.05，圖4D）。C組、O組大鼠比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，圖4D）。因此，中等負荷運動訓練后大鼠OXA和OX1R蛋白表達水平均明顯下降，但大負荷運動訓練對OXA和OX1R蛋白表達無顯著影響。

3 討論

適宜負荷的運動可以改善健康水平，但過高或過低的運動負荷可能會損害健康。這一點在心血管疾病患者中得到了最顯著的證明，如果想要降低獲得心血管疾病的風險，則不能低于體育活動負荷的閾值（Garber et al.，2011）。關于不同負荷運動對認知影響的研究還較少，有研究指出，較大的運動負荷可能會損害認知，但也是研究則表明，較大的運動負荷反而有助于改善認知（Baird et al.，2018；Moore et al.，2016）。在不同負荷游泳運動結束后，本研究對大鼠進行MWM實驗，結果表明，中等負荷游泳運動可以改善大鼠的空間學習和記憶，大負荷游泳運動不能顯著影響大鼠空間學習記憶能力。雖然如此，但在本研究中大負荷游泳運動表現(xiàn)出具有損害大鼠空間學習記憶能力的趨勢，之所以未出現(xiàn)顯著差異，可能與本研究的樣本量較少及干預周期較短有關。同時，我們在進行游泳干預過程中發(fā)現(xiàn)，在大負荷游泳運動時，大鼠嗆水的概率似乎會提高，這有可能會增加大鼠的應激性。在后續(xù)研究中我們將對游泳運動過程中除去運動以外的其他刺激，如嗆水、水溫等的應激作用展開進一步的研究，并進一步增加游泳運動干預的周期及大鼠樣本量，以取得更加可靠的實驗結果。

普遍認為，突觸是神經(jīng)元網(wǎng)絡和信息傳遞的關鍵結構，神經(jīng)元突觸可塑性是神經(jīng)生物學中學習記憶的重要影響因素（Edelmann et al.，2014）。LTP是突觸可塑性的重要內(nèi)容，被廣泛認為是構成學習和記憶基礎的主要分子機制之一。食欲素及其受體（OX1R和OX2R）廣泛分布于大腦中，在調(diào)節(jié)學習和記憶方面發(fā)揮著重要作用。OXA可以調(diào)節(jié)多個大腦區(qū)域和行為系統(tǒng)，并通過作用于氨基丁酸能、谷氨酸能、腎上腺素能和膽堿能的海馬神經(jīng)元，特異性地參與學習和記憶的認知過程（Simth et al.，2005）。近年來，動物研究發(fā)現(xiàn)，OX1R和OX2R通過參與乙酰膽堿、組胺、去甲腎上腺素、血清素和多巴胺的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)睡眠覺醒和促進學習記憶方面發(fā)揮作用（Aou et al.，2003；Ni et al.，2014；Tsujino et al.，2009；Zhao et al.，2014）。OXA和OX1R在海馬中的表達變化影響突觸的可塑性，與調(diào)節(jié)學習記憶的過程密切相關（Aou et al.，2003；Selbach et al.，2010；Zhao et al.，2014）。OXA通過增強海馬突觸的可塑性和cAMP反應元件結合蛋白的磷酸化，促進了社會識別記憶（Lang et al.，2013）。另有研究表明，OXA可以促進學習和記憶的獲得、鞏固及恢復過程（Akbari et al.，2008）。但以上研究并未提及OXA具體的表達量與學習記憶能力之間的關系。

本研究表明，中等負荷游泳運動能夠降低大鼠海馬OXA和OX1R蛋白的表達水平，并且可以改善大鼠的空間學習與記憶能力。值得一提的是，M組大鼠OXA mRNA表達量顯著高于C組，而OXA表達量顯著低于C組。轉錄水平和蛋白表達水平出現(xiàn)了矛盾，可能是由于OXA蛋白的形成需要經(jīng)過轉錄、翻譯、翻譯后修飾等過程，OXA mRNA屬于轉錄環(huán)節(jié)，而翻譯及翻譯后修飾的過程存在很大的變數(shù)，機制復雜。本研究未能對其具體機制進行研究，在未來的研究中，我們將會嘗試對這一現(xiàn)象進行分析。有研究指出，過度激活食欲素系統(tǒng)會導致神經(jīng)元損傷，進而導致學習和記憶能力下降（Aou et al.，2003，Ni et al.，2014）。研究表明，原發(fā)性失眠癥患者的記憶能力下降與OXA水平升高有關，高水平的OXA可引起失眠，并通過過度喚醒大腦皮層而損害記憶功能（Rayner，2003）。OXA可以雙向調(diào)節(jié)海馬CA1突觸可塑性，在OXA表達水平較高時，提高OXA表達水平可以通過OX1R抑制LTP；在OXA表達水平較低時，提高OXA表達水平可以通過OX1R和OX2R誘導再增強LTP（Lu et al.，2016）。

通過以上研究可以看出，某些病癥可能會導致OXA表達超過（如原發(fā)性失眠癥等）或低于（如阿爾茲海默癥等）正常的生理水平，從而可能會抑制海馬LTP，損害學習與記憶能力；而OXA表達正常時，增高或降低OXA都有可能對學習和記憶能力起到促進作用。因此推測，OXA表達在正常的生理水平內(nèi)時，可以雙向調(diào)節(jié)海馬CA1突觸可塑性。OXA表達在正常的生理水平內(nèi)時，當OXA表達水平超過某一閾值，降低OXA表達水平，有助于改善學習與記憶能力；當OXA表達水平低于某一閾值，提高OXA表達水平，有助于改善學習與記憶能力。目前還不能確定OXA表達的這一閾值。本研究中，所采用的2月齡健康雄性SD大鼠，OXA表達可能超出了這一閾值，因此，中等負荷游泳運動可能通過降低OXA表達水平，改善了大鼠的學習與記憶能力。另外，本研究顯示，大負荷游泳運動沒有顯著改變OXA和OX1R蛋白的表達水平。

綜上，中等負荷游泳運動可能通過降低OXA和OX1R表達水平，改變了大鼠海馬的LTP，這也許是中等負荷游泳運動改善大鼠空間學習記憶能力的機制之一。

4 結論

中等負荷游泳運動能提高大鼠的空間學習記憶能力，這可能與中等負荷運動能夠降低大鼠海馬OXA和OX1R的表達水平有關。大負荷游泳運動不能顯著影響大鼠海馬OXA和OX1R的表達水平及其空間學習記憶能力。