馬媾疫研究進展

劉艷成，羅查干，岳 帥，謝家鑫，孫志鵬

(興安盟動物疫病預防控制中心，內蒙古 烏蘭浩特 137400)

馬媾疫（Dourine）是馬媾疫錐蟲（Trypanosoma equiperdum）寄生于馬屬動物的生殖道黏膜、水腫液中的一種原蟲病。也是目前發(fā)現唯一不以無脊椎動物為媒介而直接通過交配傳播的錐蟲病。該病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）必須上報的疫病，也是我國進出境馬屬動物必檢疫病之一。該病曾嚴重威脅到我國馬屬動物的健康，但隨著抗錐蟲藥物的使用和防控措施的落實，得到了有效控制。近年來，隨著現代馬產業(yè)快速發(fā)展，馬屬動物數量增長迅速，牲畜無序流動頻繁，該病又呈現復發(fā)的趨勢。

1 病原

馬媾疫錐蟲，隸屬于原生動物門、鞭毛體總綱、動體目、錐體科、錐蟲屬。馬媾疫錐蟲長18～34μm，寬2～2.5μm，呈卷曲的柳葉狀，前端尖銳，后端稍鈍，蟲體中央有較為明顯的橢圓形核，并有由后向前延伸的波動膜和鞭毛[1]。

2 流行病學

2.1 傳染源

傳染源主要為發(fā)病馬、潛伏期感染馬、隱性感染馬和帶蟲馬。

2.2 傳播途徑

該病主要通過自然交配傳播，多由公畜傳染給母畜，也可由母畜傳染給公畜。此外，人工授精時，器械被污染也可傳播該??；患病母畜在分娩和哺乳時也可將病原傳播給幼畜。極少情況下，蠅、虻等吸血昆蟲也可傳播該病。

2.3 易感動物

各類馬屬動物均易感，其中驢騾對該病耐受性較馬強。實驗室條件下犬、兔、大鼠、小鼠均可感染。

2.4 流行狀況

馬媾疫錐蟲最早于1894年在阿爾及利亞被發(fā)現，隨后該病陸續(xù)在世界多國出現。我國于20世紀50年代從蘇聯引進的種馬發(fā)現該病，隨后在我國東北、西北和中原地區(qū)的多個省市均有該病流行[2]。死亡率可達50%以上（特別是公馬）。

3 臨床癥狀

《陸生法典》將馬媾疫的潛伏期定為6個月。病畜多經過水腫期、皮膚丘疹期和神經癥狀期等過程。病初病畜呈現間歇性發(fā)熱，生殖器官出現尖性水腫，患畜頻繁排尿,流出少量灰白色透明黏液。公馬開始為陰莖鞘水腫,逐漸擴展至陰囊及腹下；母馬陰戶水腫,波及至乳房。隨著病情的發(fā)展,病畜的頸部、胸部、腹部和臀部的皮膚出現5～15 cm環(huán)形扁平丘疹（稱之為“銀元疹”）,疹塊中央稍凹陷,周邊隆起,常突然出現。病情嚴重的病例會出現局部肌肉神經麻痹的癥狀。顏面部神經麻痹時，可見唇鼻歪斜，眼瞼、下唇和耳朵下垂；后肢與腰神經麻痹時，后軀無力,跛行，步態(tài)不穩(wěn)；咽部神經麻痹時，病畜吞咽困難。隨著病程的延長，病畜多貧血、瘦弱、繼發(fā)感染而最終死亡。

4 診斷方法

4.1 血清學檢測技術

馬屬動物感染馬媾疫錐蟲后，無論臨床癥狀是否明顯，其機體均會發(fā)生特異性反應，產生體液抗體。馬媾疫錐蟲與伊士錐蟲、布氏錐蟲等其他錐蟲關系密切，不同種間具有相同的細胞骨架成分，能夠誘導產生較強的血清學交叉反應。目前，診斷馬媾疫所用的抗原或抗體（單抗或者多抗）均包含這些保守成分，導致血清學檢測方法特異性不強，特別是存在伊士錐蟲感染的地區(qū)，無法進行鑒別診斷。OIE《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》推薦的檢測方法有補體結合試驗（CF）、間接熒光抗體試驗（IFA）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

4.1.1 補體結合試驗。作為國際貿易指定試驗，被用于臨床疑似病例的確診和隱性感染的篩檢。但驢、騾常出現非特異性反應，造成假陽性。盡管補體結合試驗作為國際貿易指定試驗，但因操作復雜、檢測周期長等缺點，在基層臨床篩檢工作中應用并不廣泛。

4.1.2 間接熒光抗體試驗。作為OIE馬媾疫錐蟲診斷的替代試驗，可用于定性試驗，或用于補體結合試驗中未定結果的進一步檢驗。該方法需采集錐蟲數量處于增長期的動物血液，制備抹片后，進行熒光標記。

4.1.3 酶聯免疫吸附試驗。作為OIE馬媾疫錐蟲診斷的替代試驗，具有操作簡單、快速、敏感性高、實驗設備要求簡單、應用范圍廣泛等優(yōu)勢，目前間接ELISA方法和競爭ELISA方法均已被建立[3-4]，并廣泛用于大范圍的血清篩查。

4.1.4 其他檢測方法。J.M.Hagebock等[5]建立一種利用補體結合試驗抗原、陽性血清和被檢血清的瓊脂凝膠擴散（AGID）試驗，可用于驗證陽性反應和檢測抗補體血清。F.Claes等[6]構建了一種卡片凝集試驗方法（CATT），試驗效果與補體結合試驗相當。J.B.Katz等[7]建立了一種可同時檢測馬媾疫、馬鼻疽和馬巴貝斯蟲的免疫印跡試驗方法，極大的提高了檢測效率。

4.2 病原學檢測技術

4.2.1 顯微鏡涂片檢查。馬媾疫錐蟲僅短暫存在于末梢血液中，且蟲體數量較少，檢出率較低。應重點采集丘疹、浮腫皮膚的抽出液，生殖器黏液及黏膜刮取物，將采集的病料滴加適量生理鹽水，置于載玻片上，覆以蓋玻片，制成壓片標本；也可制成抹片，姬氏液染色后，鏡檢。鏡下發(fā)現呈卷曲的柳葉狀、中央有較為明顯的橢圓形核的蟲體，即可進行初步判定。但顯微鏡檢查法很難從形態(tài)學和運動性與錐蟲屬的其他種進行區(qū)分，特別是存在伊士錐蟲感染的地區(qū)，無法進行鑒別診斷。

4.2.2 分子生物學診斷。近年來，PCR檢測方法以其簡單快速、特異性強、靈敏度高等特點，廣泛應用于動物疫病的診斷。Moser等克服了核酸雜交敏感性較低的不足，率先建立了錐蟲病PCR檢測技術。王群、鄭小龍等[8-9]利用錐蟲基因組中的差異，相繼建立了馬媾疫錐蟲PCR檢測方法和馬媾疫錐蟲SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，在進出境動物檢驗檢疫和臨床鑒別診斷中發(fā)揮了重要作用。

5 防治措施

5.1預防措施

5.1.1 強化飼養(yǎng)管理。對未發(fā)生該病的場戶，嚴把入場關，對新引進的種馬，特別是國外進口馬匹，嚴格執(zhí)行隔離檢疫措施，實驗室檢測結果和隔離期滿后再混群飼養(yǎng)。

總之，黃庭堅詞集的兩個版本系統(tǒng)都可能存在某些缺陷，尤其是嘉靖本因收詞數量較多而可能羼入部分偽作。另外，其他文獻中也有一些署名黃庭堅的詞作，或被作為存目附編于今人所纂黃氏詞集中，或未見于任何版本的黃庭堅詞集。為便于梳理，筆者將所見黃庭堅存疑互見詞列為下表：

5.1.2 切斷傳播鏈條。借助早期診斷，篩查易感動物，發(fā)現染疫動物，除名貴品種考慮隔離、治療外，其余患畜應立即淘汰，消滅傳染源。在配種季節(jié)，防止任意交配，推行人工授精，對配種器械嚴格消毒，切斷傳播途徑。對健康母畜和種公畜在配種前，使用三氮脒、萘磺苯酰脲等藥物進行預防。

5.2 治療藥物

對養(yǎng)殖價值較高的患畜可使用抗錐蟲藥物進行治療，但馬屬動物對抗錐蟲藥物比較敏感，應嚴格控制藥物劑量，避免藥物中毒。

5.2.1 萘磺苯酰脲（商品名：蘇拉明、那加諾、拜耳205）為脲的復合衍生物，是傳統(tǒng)使用毒性較小的抗錐蟲藥。該藥物主用于馬、駱駝、牛和犬的錐蟲病治療，但也有人證明對馬媾疫錐蟲的治療效果并不明顯。使用該藥物進行治療時，可配伍氯化鈣等興奮網狀內皮系統(tǒng)藥物，療效更佳。本品對馬屬動物的毒性反應比較敏感，偶見發(fā)熱，水腫，跛行，步行困難甚至倒地不起。為防止毒性反應，可將一次治療量分2次注射，中間間隔24 h。

5.2.2 三氮脒（商品名：血蟲凈、貝尼爾）屬于芳香雙脒類，為傳統(tǒng)廣譜抗錐蟲藥，對家畜錐蟲病具有治療作用。戴曉俐等[10]對比了氯喹、甲硝唑、Mel Cy和三氮脒四種抗原蟲藥物對馬媾疫錐蟲的治療作用，結果表明，貝尼爾（7 mg/kg）具有良好的治療效果。三氮脒毒性較大，安全范圍較窄，治療量有時也會出現不良反應，通常能自行耐過，但其價格便宜,臨床使用較為普遍。

5.2.3 喹嘧胺（商品名：安錐賽、喹匹拉明）為傳統(tǒng)的抗錐蟲藥，其毒性略強于萘磺苯酰脲。主要有喹嘧氯胺和甲硫喹嘧胺兩種。喹嘧氯胺難溶于水，注射后吸收緩慢，藥物吸收后主要分布在肝臟、腎臟等組織，常用于馬媾疫錐蟲的預防。甲硫喹嘧胺易溶于水，注射后吸收迅速，主要用于馬媾疫錐蟲的治療。馬屬動物應用該藥品時，常出現呼吸急促、肌肉震顫、抖動、頻排糞尿、全身出汗、腹痛打滾等，但多自行耐過，嚴重者可致死。因此，用藥后必須注意觀察，嚴格控制劑量或分點注射。

5.2.4 Mel Cy（中文名：三氧化二砷半胱胺、鹽酸美拉索明、美拉索明二鹽酸鹽）為抗錐蟲新藥，該藥含有毒成份砷,較低劑量時能夠殺滅錐蟲。戴曉俐等[10]研究了Mel Cy對伊氏錐蟲、馬媾疫錐蟲和布氏錐蟲感染的治療作用，結果表明，1.6 mg/kg的Mel Cy對3種錐蟲都有完全的治愈作用。Z.R.Lun等[11]使用0.5 mg/kg的Mel Cy能夠完全治愈自然感染伊氏錐蟲的水牛。P.Tager-Kagan等[12]發(fā)現使用0.625～1.25 mg/kg的Mel Cy能有效治愈駱駝伊氏錐蟲病。Mel Cy對宿主毒性較大，劑量較大時會引起注射部位壞疽。

5.2.5 其他抗錐蟲藥物：新胂凡納明（商品名：九一四）對伊氏錐蟲和馬媾疫錐蟲有效，常與萘磺苯酰脲交替使用。氯化氮胺菲啶鹽酸鹽（商品名：沙漠林、錐滅定）對錐蟲、梨形蟲和邊蟲均有作用，主要用于錐蟲病的治療。二氟甲基鳥氨酸（別名：依氟鳥氨酸）能夠殺死錐蟲，常被用于由布氏岡比亞錐蟲引起的非洲昏睡病的治療。硝呋莫司、芐硝唑等抗錐新藥，目前多用于人感染錐蟲病的治療。

5.3 疫苗研制

由于錐蟲具有抗原變異逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的特性,至今尚未見有用于臨床使用的疫苗。盡管如此,研發(fā)安全、高效的疫苗仍是控制錐蟲病最有效地方法，研究人員對錐蟲疫苗的研究從未中斷。

5.3.1 弱毒疫苗。研究人員利用錐蟲病免疫機理，通過輻射、藥物、傳代等方式致弱錐蟲，制備成各種錐蟲疫苗。J.F.Fermandes等[13]用放線菌素致弱馬媾疫錐蟲也產生良好保護力。但因錐蟲抗原具有易變性,疫苗所用蟲株很難與自然感染蟲株保持一致,因此各種減毒疫苗臨床使用效果不佳。

5.3.2 亞細胞疫苗。研究人員利用寄生于宿主血液型錐蟲的變異表面糖蛋白(VSG)，用來制成預防錐蟲病的疫苗。T.Baltz等[14]對小鼠免疫馬媾疫錐蟲的VSG,可使小鼠獲得特異性保護。王云飛等[15]采用凍融法將純凈錐蟲與阿氏液混合獲得可溶性抗原，制成單一或混合抗原。單一抗原免疫鼠對同株克隆攻蟲保護率達80%,異株克隆攻蟲保護率低于17%,混合抗原免疫鼠對各株錐蟲攻擊保護率亦在80%以上。但錐蟲VSG誘導產生的抗體對特定的錐蟲蟲株可以產生有效的保護性，對異源錐蟲不能產生有效保護。

5.3.3 其他類型的疫苗。針對錐蟲抗獨特型抗體疫苗和基因工程類疫苗尚處于研究階段。以免疫網絡學說為理論基礎的抗獨特型抗體疫苗的問世,讓研究人員看到了錐蟲病疫苗的希望。楊漢春等[16]成功制備出兔抗獨特型血清和大白鼠抗獨特型血清(Ab2),攻擊感染具有明顯保護效應。李三強等[17]利用重組的伊氏錐蟲beta-微管蛋白免疫小鼠，使小鼠短期內獲得了對馬媾疫錐蟲、布氏錐蟲和伊氏錐蟲較好的保護效果。

6 展望

當前，國內主要通過病原學和血清學進行馬媾疫錐蟲病的診斷和檢疫。病原學診斷雖然可以確診，但費時費力，而且檢出率低。血清學診斷中補體結合試驗和間接熒光抗體試驗操作復雜，專業(yè)化要求較高；ELISA試驗雖然可進行大范圍篩檢，但所用的抗原或抗體特異性不強，無法與其他錐蟲進行鑒別。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，可通過基因芯片、高通量測序、基因工程等技術，制備馬媾疫錐蟲特異性抗原和抗體，提高血清學檢測的特異性。充分利用PCR技術靈敏、快速、特異的優(yōu)點，設計特異性引物，建立適合動物疫病診斷、流行病學調查和檢疫的快速診斷方法。

與大部分寄生蟲不同，錐蟲對藥物的抵抗力很強。由于少數幾種抗錐蟲藥物的長期使用,導致具有抗藥性的蟲株不斷出現,錐蟲病的防治逐漸成為臨床治療的技術難題。特別是錐蟲感染晚期，蟲體進入到宿主中樞神經系統(tǒng)(CNS),而現有的抗錐蟲藥物多不能穿越血腦屏障,雖然個別抗錐蟲藥可穿過血腦屏障,但也因價格昂貴、毒性大、操作不便等原因無法用于動物錐蟲病的治療。因此,研發(fā)更為安全的新藥，以及現有藥物的配伍研究，將是研究人員關注的方向。

由于錐蟲抗原變異程度較其他寄生蟲更為頻繁，疫苗研制的難度也更大。目前研究人員僅探究到錐蟲抗原變異的部分機制,但對錐蟲免疫應答和宿主誘導保護機制研究進展還不大。因此，掌握誘導機體保護性免疫的機制和特征，尋找更多有效的保護性抗原是錐蟲疫苗研制成功關鍵。近年來，研究人員正在嘗試尋找具有免疫原性的非變異抗原、功能酶以及起框架作用的蛋白質，拓寬疫苗研究渠道。