枯草芽孢桿菌在番茄病害防治上的應用與研究進展

甘金佳，毛玲莉，孫成榮，潘美學，蔣水元

（1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，桂林，541006；2.桂林市農業(yè)科學研究中心；3.廣西資源縣生產力促進中心；4.廣西資源縣車田苗族鄉(xiāng)農業(yè)服務中心）

番茄病害種類繁多，其中，灰霉病、青枯病、疫病、立枯病、枯萎病和根腐病等病害發(fā)生較為普遍。半個多世紀以來，化學農藥在防治番茄病害方面發(fā)揮了十分重要的作用，但長期、連續(xù)和不合理地使用，造成病原菌產生抗性、農產品化學殘留及環(huán)境污染等一系列問題，不僅嚴重制約了番茄產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，還威脅著人類健康，這就促使人們探尋一種對人類和環(huán)境均友好并具有良好防治效果的新的植物病蟲害防治策略[1～3]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的嗜溫性好氧革蘭氏陽性桿狀細菌，可以產生內生芽孢，耐熱、抗逆性強，在土壤和植物的表面普遍存在，同時還是植物體內 常見的一種內生菌，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境。由于它生長速度快、營養(yǎng)需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖與繁殖，而且生產枯草芽孢桿菌制劑的工藝簡單，制劑穩(wěn)定，施用方便，儲存期長，所以是一種理想的番茄病害生防微生物[3]。

1 枯草芽孢桿菌的生防機制

枯草芽孢桿菌的生防作用機制多種多樣，概括起來主要有競爭、拮抗、溶菌、誘導植物抗病性和促進植物生長等幾個方面。

1.1 競爭作用

主要包括營養(yǎng)競爭和位點競爭。營養(yǎng)和空間位點的競爭是指存在于同一微小生物環(huán)境中的2個或2個以上微生物之間爭奪這一環(huán)境內的空間、營養(yǎng)、氧氣等的現(xiàn)象。枯草芽孢桿菌具有較強的競爭和定殖能力，從而搶占病原菌的侵染位點，消耗其周圍養(yǎng)分，阻止和干擾病原菌對植物葉面和其他器官的侵染，起到防病抑菌的作用[3]。

1.2 拮抗作用

是指微生物通過同化作用產生抗菌物質抑制有害病原物的生長或發(fā)展或直接殺滅病原物。產生的拮抗物質主要有抗生素、細菌素、細胞壁降解酶類和其他抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌物質[4]。

1.3 溶菌作用

是指拮抗微生物通過吸附在病原真菌的菌絲上，并隨著菌絲生長而生長，產生溶菌物質消解菌絲體，使菌絲發(fā)生斷裂、解體、細胞質消解，有的菌絲原生質凝結；或者是次生代謝產物對病原菌孢子的細胞壁產生溶解作用，致使細胞壁產生穿孔、畸形等現(xiàn)象[2]。

1.4 誘導植物產生抗性

枯草芽孢桿菌不但能直接抑制植物病原菌，而且能通過誘發(fā)植物自身的抗病潛能來增強植物的抗病性。近年研究表明，一些病原菌進入免疫植株的穿入能力因免疫植株抑制其發(fā)育、侵入和增殖而明顯降低[5]。

1.5 促進植物生長

在植物根際生活的一類具有刺激植物生長和抑制植物病原菌等綜合作用的細菌群叫促進植物生長根際細菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）。1998年發(fā)現(xiàn)生防枯草芽孢桿菌能促進植物根系及植株生長，增強植物的抗病性，從而間接減少病害發(fā)生[5]。

2 枯草芽孢桿菌在番茄病害防治上的應用

國內外使用芽孢桿菌防治植物病害非常廣泛，尤其是枯草芽孢桿菌。其因安全性高、能產生多種抗菌物質而受到生物防治工作者的偏愛。目前已有很多優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株在番茄病害防治上進行應用，例如，日本東京技術研究所的枯草芽孢桿菌RB14和NB22分別對Rhizoctonia solani、Fusarium orysporum和Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效[6]。我國利用枯草芽孢桿菌防治番茄病害的應用研究也達到了世界先進水平[2]，已有學者開展利用枯草芽孢桿菌防治番茄灰霉病、青枯病、早疫病、立枯病、枯萎病、根腐病、匍柄霉葉斑病、棒孢葉斑病和莖基腐病等病害的研究。

2.1 枯草芽孢桿菌在番茄灰霉病防治上的應用

番茄灰霉病是由半知菌亞門灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的重要病害，可為害番茄的莖、葉、花和果實，影響番茄的產量和品質。近年來，保護地番茄種植面積不斷擴大，為灰霉病菌在保護地土壤中大量累積及侵染植株提供了有利的小環(huán)境，特別是冬春季節(jié)棚室中低溫、高濕的氣候條件，更利于灰霉病的發(fā)生，通常造成番茄減產20%～30%，嚴重時可達60%[7]。早在2001年，Utkhede等[8]就發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌具有防治番茄灰霉病和提高番茄果實產量的潛力，可挽回溫室番茄生產中因番茄莖傷感染灰霉病導致的經濟損失。Hinarejos等[9]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌IAB/BS03菌株是一種有效的生物防治劑，噴施于番茄葉面后可以降低番茄灰霉病發(fā)病率。而On等[10]發(fā)現(xiàn)，亞麻芽孢桿菌/枯草芽孢桿菌聯(lián)合施用一般比單獨施用對番茄灰霉病菌更有抑制作用，在菌株提取物中發(fā)現(xiàn)了包括表面活性劑在內的抗真菌化合物，表明抗生物活性是其主要作用機制。

國內學者應用枯草芽孢桿菌防治番茄灰霉病的研究也比較早，杜立新等[11]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS-208和BS-209制劑對番茄灰霉病均具有良好的防治效果，其防效隨濃度加大而提高，以800倍液的防效最好，兩菌株制劑800倍液連續(xù)3次施藥后防效均在74%以上，并且BS-208菌株的防效略高于BS-209菌株。侯曉丹等[12]對枯草芽孢桿菌進行了磁場誘變，獲得3株高效拮抗菌，利用注射接種法對番茄灰霉病菌拮抗作用進行研究，發(fā)現(xiàn)先接種BS1.25的處理防效達100%，顯著好于對照，為較理想的拮抗菌?？莶菅挎邨U菌菌劑可以與其他菌劑或者農藥混合使用，徐升運等[13]分別研究了枯草芽孢桿菌M6、木霉10和兩者配成的復合菌劑對番茄灰霉病的防治效果，田間防治結果表明，復合菌劑對番茄灰霉病的防治效果良好，隨濃度的增加防效不斷提高，以800倍液的防效最好，連續(xù)2次施藥后防效在80%以上。紀明山等[14]發(fā)現(xiàn)，1.8%阿維菌素乳油與枯草芽孢桿菌B36可濕性粉劑混用可以明顯提高其防治番茄灰霉病的藥效，其預防效果與治療效果分別提高2.59個百分點與5.84個百分點。目前，我國在開發(fā)利用枯草芽孢桿菌防治植物病害方面已取得一定成績，現(xiàn)有部分商品制劑（主要是可濕性粉劑和水劑）開發(fā)成功并投入生產應用，劉曉剛等[15]結果表明，1 000億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對番茄灰霉病葉片和果實防治效果達到83.16%和89.28%；喬巖等[7]的活體盆栽試驗結果表明，枯草芽孢桿菌菌劑對番茄灰霉病兼有預防和治療作用，最高用量預防效果為75.62%，治療效果為68.75%，預防效果優(yōu)于治療效果。原麗等[16]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對番茄苗期灰霉病有較好的防效，且抑菌強度與枯草芽孢桿菌濃度呈正相關，其防效在第14天時可達60.5%，明顯高于對照。尉文彬等[17]的試驗結果表明，枯草芽孢桿菌是灰霉病的有效防治制劑，枯草芽孢桿菌250倍液對番茄灰霉病的防治效果可達到74.73%，建議在整個生長季共噴藥3次，每次用藥間隔7 d。喬俊卿等[18]研究了枯草芽孢桿菌PTS-394灌根對灰霉病的防治效果，菌株PTS-394灌根番茄后48 h，離體葉片接種番茄灰霉菌病菌，結果顯示，菌株PTS-394處理的番茄葉片病斑面積僅為對照的50%，防控效果達47.1%；盆栽試驗顯示，菌株PTS-394處理后對番茄灰霉的防治效果為58.2%。綜上所述，利用枯草芽孢桿菌菌劑對番茄灌根或噴霧后，可以觸發(fā)番茄植株系統(tǒng)性的抗病性產生，增強植株免疫能力。

2.2 枯草芽孢桿菌在番茄青枯病防治上的應用

番茄青枯病是由茄青枯拉爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種毀滅性土傳病害，目前對該病的防治尚無理想藥劑和抗病品種，因此利用有益微生物防治該病具有廣泛的發(fā)展前景[19]。日本學者Phae等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌株NB22對番茄根腐病和青枯病都有良好的防治效果。Singh等[21]發(fā)現(xiàn)，0.01%的次氯酸鈣和枯草芽孢桿菌聯(lián)合施用可以有效降低番茄青枯病的發(fā)病率。Shiva等[22]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對番茄青枯病具有84%的防治效果，如果與木霉和熒光假單胞菌聯(lián)合施用，可提高對番茄青枯病的防治效果。

Algam等[23]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌拮抗菌株不僅是良好的促生劑，也是有效的抗性誘導劑，用枯草芽孢桿菌處理番茄種子能夠有效控制番茄青枯病，防治效果為80%，充分顯示了枯草芽孢桿菌在番茄青枯病治理上的潛在重要性。黎起秦等[19]用注射法先接種枯草芽孢桿菌B47菌株后接種病原菌的試驗取得92.10%的防效，將枯草芽孢桿菌B47菌株和番茄青枯病菌混合施入土壤后，隨B47數(shù)量增加番茄青枯病菌的數(shù)量顯著降低，接種后第20天，對番茄青枯病的防治效果達79.79%[24]。喬俊卿等[25]發(fā)現(xiàn)，利用枯草芽孢桿菌Bs916灌根處理番茄后14 d，對番茄青枯病的防治效果為55.6%，而連玲麗等[26]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌SB1對番茄青枯病的防治效果達77.78%。由此可見，枯草芽孢桿菌不同菌株對番茄青枯病的防治效果不盡相同。枯草芽孢桿菌商品制劑也已應用于青枯病的防治上，黃永山等[27]研究發(fā)現(xiàn)，1億孢子/mL枯草芽孢桿菌水劑300倍液、400倍液和500倍液對番茄青枯病的防效分別為91.29%、88.06%和84.41%。

2.3 枯草芽孢桿菌在番茄早疫病防治上的應用

番茄早疫病又稱輪紋病，是發(fā)生在番茄莖葉果實上的重要病害之一，其病原真菌（Alternaria solani）除了侵染番茄以外，還為害馬鈴薯、茄子、辣椒等，一般年份可導致番茄產量損失10%～30%，流行年份損失可達30%～40%[28]。Abbasi等[29]研究表明，枯草芽孢桿菌QST713與氫氧化銅制劑聯(lián)合噴施于番茄葉片，可以有效降低番茄早疫病為害程度。Chowdappa等[30]研究了枯草芽孢桿菌OTPB1菌株對番茄早疫病菌的植株體外抗菌、生長刺激和誘導番茄幼苗系統(tǒng)抗早疫病的效果，結果表明，OTPB1處理提高了番茄植株與防御相關酶的水平，包括過氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶，研究還表明，OTPB1在促進植株生長和抗性的同時，通過誘導產生生長激素和防御酶，增強了番茄幼苗的系統(tǒng)抗性。Awan等[31]探討枯草芽孢桿菌單獨及聯(lián)合植物營養(yǎng)物質（氮、磷、鉀、鋅、鎂等）對番茄早疫病的生物防治效果，結果表明，與在番茄葉面單獨施用枯草芽孢桿菌相比，枯草芽孢桿菌與植物營養(yǎng)物質聯(lián)合施用，對早疫病的防治效果可顯著提高67%～83%，并使植株的生長特性提高20%～77%，表明微生物制劑和植物營養(yǎng)物質共同施用可形成正效應。Shoaib等[32]分離得到3株枯草芽孢桿菌，盆栽試驗結果表明，葉面施用枯草芽孢桿菌（BS-01、BS-02和BS-03）可將早疫病的防治效果顯著提高42%～92%，植株生長性狀提高25%～165%，隨著番茄總酚含量的增加，番茄植株抗氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶含量也上調繼而誘發(fā)植株抗性。

楊冬靜等[28]研究表明，枯草芽孢桿菌NJ-18發(fā)酵液噴施處理盆栽番茄苗后接種，14 d后對番茄早疫病的防治效果為72.9%，顯著高于對照處理。李改玲等[33]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌QM3菌株可以產生抗菌物質和胞外水解酶，經顯微直接觀察發(fā)現(xiàn)，QM3菌株對病原菌絲有明顯的抑制生長和致畸作用，此外，還有競爭生長空間和營養(yǎng)物質的趨勢，這一結果揭示枯草芽孢桿菌是通過多種抗菌機制的協(xié)同作用有效抑制番茄早疫病菌的。胡青平等[34]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌QM3發(fā)酵液對番茄早疫病有明顯的防治效果（p＜0.05），最高可達52.94%，且與化學農藥聯(lián)合使用防效更好，最高可達71.80%。馬新等[35]制備枯草芽孢桿菌微囊劑并進行田間藥效試驗，結果表明，該枯草芽孢桿菌微囊劑用量為300 g/hm2（芽孢濃度為1.5×107cfu/m2）時，對番茄立枯病的防效最高，為72.76%。張曉琴等[36]從土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌YA-3菌株，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液可使番茄葉片早疫病發(fā)病率顯著降低，防治效果可達到75.52%，該拮抗菌的發(fā)現(xiàn)，為生物防治植物病害提供了新的、有效的生防資源，具有良好的應用前景。

2.4 枯草芽孢桿菌在番茄其他病害防治上的應用

番茄枯萎病、立枯病、根腐病以及其他病害發(fā)生也較為普遍，番茄枯萎病是由枯萎病菌（Fusarium oxysporum）引起的一種嚴重為害番茄品質和產量的土傳病害，番茄從幼苗期到成株期均易受到枯萎病菌的感染[37]。利用枯草根菌進行番茄枯萎病的生物防治很有前途，在農業(yè)可持續(xù)發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。Solanki等[38]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌菌株MB101在番茄根系上具有較高的定殖度，施用枯草芽孢桿菌能提高番茄植株的株高、生物量和葉綠素含量，田間試驗中，菌株MB101與菌株MB14及對照相比，枯萎病癥狀明顯減輕，果實產量顯著提高。Mohammed等[39]從發(fā)生番茄枯萎病的田間選出健康番茄植株并從其根部分離到52個菌株，在這52個菌株中只有2個菌株對枯萎病菌有拮抗作用，即假單胞菌和枯草基菌。劉郵洲等[37]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌sf628對枯萎病菌的防效為91.46%。而陳雪麗等[40]的盆栽試驗表明，枯草芽孢桿菌菌懸液及其無菌代謝物對番茄枯萎病具有較好的防治效果，防效可達68.42%，而且具有明顯的促進生長作用。

番茄立枯病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），是一種為害嚴重的真菌，可侵染番茄、水稻、棉花、瓜果等多種農作物[41]。Szczech等[42]研究了枯草芽孢桿菌RB14-C（產生抗生素iturin A）作為生物防治劑的有效性，通過種皮或直接將枯草芽孢桿菌引入土壤來防治番茄立枯病病原菌的感染，發(fā)現(xiàn)，種子包衣和聯(lián)合處理（土壤和種子用RB14-C處理）不能保護幼苗免受病原菌R.solani引起的侵染，相比之下，僅將RB14施入土壤就能控制立枯病病害。馬新等[41]的田間藥效試驗表明，枯草芽孢桿菌可有效防治番茄立枯病，當微囊劑用量為300 g/hm2（芽孢濃度為1.5×107cfu/m2）時防效為72.76%。

根腐病是加工番茄主產區(qū)發(fā)生非常普遍的病害，平均發(fā)病率在30%～40%，嚴重地塊出現(xiàn)大面積植株枯死[43]。根腐病由Pythiuma phanidermatum引起，侯彩霞等[43]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌菌株對加工番茄根腐病有較好的防治作用，防效可達69.02%，還可以提高番茄產量，防治根腐病的主要機理是抑制病原菌菌絲生長和促進加工番茄植株體內多酚氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的提高。王震等[44]的研究結果表明，10億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑通過育苗期田間滴灌綜合應用能顯著改善番茄植株生長發(fā)育狀況和提高產量，對番茄根腐病防治效果顯著，防效達到66.7%，具有良好的應用價值，為有機番茄高產提供了重要技術支撐。

番茄棒孢葉斑病是由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的一種重要病害，在世界多數(shù)番茄種植區(qū)域都有發(fā)生，近年來傳入我國，對我國番茄生產造成了嚴重的影響[45]。黃大野等[45]采用活體盆栽試驗研究其對番茄棒孢葉斑病的防治效果，結果表明，枯草芽孢桿菌NBF809菌株對番茄棒孢葉斑病的防治效果達到73.26%。

番茄匍柄霉葉斑病由茄匍柄霉（Stemphylium solani）和番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）引起，其中茄匍柄霉是主要病原菌，番茄匍柄霉葉斑病主要為害番茄的葉片、莖蔓和果實，全生育期均可發(fā)病，從局部發(fā)病到全株感染只需要2～3 d，防治難度較大[46]。李新宇等[46]的番茄盆栽試驗結果表明，枯草芽孢桿菌菌株ZF161對番茄匍柄霉葉斑病的防治效果達到63.27%，菌株ZF161對番茄匍柄霉葉斑病具有良好的防治效果，且可抑制多種病原真菌，具有開發(fā)應用的潛力。

3 枯草芽孢桿菌在番茄病害生防中存在問題、解決措施

枯草芽孢桿菌在番茄病害生防的研究及開發(fā)應用方面已取得了令人矚目的成就，但其發(fā)展過程中仍存在不少問題，如枯草芽孢桿菌在番茄同一病害中的防治效果大不相同，其原因可能是田間條件下，枯草芽孢桿菌易受土壤溫濕度、pH值、作物生長狀況及土壤生態(tài)系統(tǒng)等微環(huán)境因素的影響，生長不穩(wěn)定，分泌的有效殺菌物質被降解，因此防治效果不穩(wěn)定。為解決這一問題，目前主要采用與化學農藥復配和與其他拮抗微生物協(xié)同防病這2種措施[3]。

使用化學農藥復配防病目的是幫助枯草芽孢桿菌克服在土壤生態(tài)環(huán)境里定殖過程中與其他微生物群落的競爭，形成優(yōu)勢種群，使之有足夠的群體數(shù)量來克服包括病原菌在內的土壤習居微生物的排斥作用，保持其在植物根、葉周圍定殖，分泌抗生素，誘導植物抗病性等作用，同時發(fā)揮化學藥劑殺蟲抑菌速度快、防治效果穩(wěn)定的優(yōu)勢，通過復配協(xié)同作用達到優(yōu)勢互補、用量減少、防效增強的目的[2，3]。

與其他拮抗微生物協(xié)同防病，是將互容的2種以上的拮抗微生物（混用的不同抗生菌之間沒有拮抗、寄生、溶解或競爭等互斥關系）混合，將有利于混合菌株對植物不同部位的空間全面占領，由于混合菌劑能適應不同環(huán)境條件，可在更大的光、溫、氣、濕度變幅內生存繁衍，因此有望實現(xiàn)多種抗生菌功能互補、多種病害兼防、作用持久的協(xié)同防治效果[2，3]。

4 枯草芽孢桿菌在番茄病害防治上的研究趨勢與展望

目前關于枯草芽孢桿菌在番茄病害防控上的應用研究發(fā)展迅速且取得了階段性成果，今后可從以下幾個方面進行下一步的研究，枯草芽孢桿菌對番茄病害的生防作用研究及其開發(fā)應用也會出現(xiàn)新的發(fā)展。

4.1 利用分子生物學技術培育枯草芽孢桿菌優(yōu)良菌株

隨著現(xiàn)代生物技術的廣泛應用，基因組學和蛋白組學的發(fā)展，以及先進的儀器設備的應用[47]，特別是利用先進的CRISPR-Cas9基因編輯技術對枯草芽孢桿菌在基因水平上進行改造，獲得優(yōu)良菌株以提高研究效率，可能會對今后枯草芽孢桿菌在番茄及其他作物上的應用發(fā)展起到十分重要的作用[48]。

4.2 枯草芽孢桿菌與番茄、有機肥及耕作制度的協(xié)同

土壤微生物生物量、土壤酶的活性及作為植物生長必需的三大營養(yǎng)元素氮、磷、鉀的含量均是評價土壤肥力的指標。微生物功能的發(fā)揮除受環(huán)境的制約外，番茄種類、有機肥及耕作制度等，也是影響其功能發(fā)揮的重要因素。未來可以在協(xié)調枯草芽孢桿菌與番茄、有機肥及耕作制度間的關系，發(fā)揮其在改良土壤、促進番茄生長等領域開展相關研究[49]。

由于枯草芽孢桿菌能產生耐熱的芽孢，既易于生產、劑型加工，又易于存活、定殖與繁殖；批量生產工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，而且其制劑穩(wěn)定、與化學農藥相容[50]，具有對人畜相對安全、環(huán)境兼容性好、不易產生抗藥性等優(yōu)點，所以隨著經濟的發(fā)展和人們認識的提高，其將在防治番茄病害中發(fā)揮更為重要的作用[3]。