脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷性勃起功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究

提運(yùn)榮 楊孟波 張 明 肖冬冬 呂向國 盧慕峻*

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（上海 200127）2.上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指陰莖無法勃起或維持勃起以完成滿意的性生活[1]。ED的原因包括血管性、神經(jīng)性、內(nèi)分泌性和心理性等多個(gè)方面。其中盆腔手術(shù)（如前列腺癌根治手術(shù)）是造成神經(jīng)性ED的常見原因，手術(shù)中不可避免造成海綿體神經(jīng)切斷、灼傷和器械牽拉造成的海綿體神經(jīng)損傷（cavernous nerve injury，CNI），其對患者術(shù)后生活質(zhì)量造成很大影響。盡管近年來保留雙側(cè)性神經(jīng)的前列腺癌根治術(shù)(radical prostatectomy，RP)得到有效推廣，其術(shù)后海綿體神經(jīng)損傷性勃起功能障礙（cavernous nerve injury related erectile dysfunction,CNI-ED）的發(fā)生率依然達(dá)到20%-90%[2]。由于神經(jīng)損傷造成的海綿體纖維化，CNI-ED較一般的ED更加難以治療，其對ED的一線治療方法口服PDE-5抑制劑反應(yīng)往往不佳[3]。

海綿體注射干細(xì)胞用于治療勃起功能障礙且取得一定療效[4,5]。干細(xì)胞來源多樣，脂肪、骨髓和臍帶條索均可以分離出具有分化潛能的干細(xì)胞。其中，脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,ASCs）以其獲取容易、來源廣泛和一定的旁分泌功能廣泛用于組織修復(fù)[6,7]。本研究擬采用脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞治療雙側(cè)海綿體神經(jīng)損傷ED大鼠，檢測其勃起功能和組織恢復(fù)情況，并詮釋其治療機(jī)制。

材料和方法

一、大體設(shè)計(jì)

本研究分為3組，為年齡匹配組（age-matched control,AMC,n=8），對照組（雙側(cè)海綿體神經(jīng)損傷后陰莖海綿體注射PBS,n=8）和ASCs組（雙側(cè)海綿體神經(jīng)損傷后陰莖海綿體注射人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量為106個(gè)細(xì)胞，n=8）

二、材料

ASCs的提取、培養(yǎng)：取得患者的知情同意后，取年輕女性患者抽脂所得腹部脂肪廢棄液，0.25%氯霉素溶液沖洗后PBS（上海賽戈生物有限公司）沖洗，剪刀剪碎后按1：1的比例加入0.1%的IV型膠原酶（Sigma-Aldrich，Germany）放入37℃的恒溫?fù)u床搖晃直至乳糜狀，把上述液體放入離心機(jī)，300g，37℃離心5分鐘。去掉上層液體后用含有10%胎牛血清（Gibco，USA）和1%抗生素（Gibco，USA）的完全培養(yǎng)基(DMEM,Gibco，USA)重懸后，懸液濾過2μm的濾網(wǎng)，過濾后的細(xì)胞懸液接種到10cm的培養(yǎng)皿中，放到37℃5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天換液，在細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)傳代。

三、方法

（一）海綿體神經(jīng)損傷和海綿體注射

CNI-ED模型構(gòu)建方法按文獻(xiàn)所述方法構(gòu)建[8]。10到12周的雄性Sprague-Daw ley大鼠(300-350克)提前適應(yīng)環(huán)境一周，腹腔注射水合氯醛（Sigma-Aldrich，Germany），失去意識后放到溫度可控平板上，腹部正中切開后用鑷子提起膀胱，暴露前列腺，在前列腺后外側(cè)葉小心分離海綿體神經(jīng)（cavernous nerve，CN）。年齡匹配組大鼠隨即關(guān)閉腹腔。對照組大鼠和實(shí)驗(yàn)組大鼠在距盆大神經(jīng)節(jié)（major pelvic ganglia,MPG）5毫米處用顯微鑷子夾住30s后松開，間隔30s后再夾30s（成功的損傷后海綿體神經(jīng)應(yīng)有顏色改變），隨后關(guān)閉腹腔。按下述方法進(jìn)行海綿體注射[9]，剪開對照組大鼠陰莖中段包皮，用顯微注射器注入100微升PBS到大鼠海綿體內(nèi)，隨后縫合切口。實(shí)驗(yàn)組執(zhí)行相似的操作，注入100微升P3代人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞懸液（含106細(xì)胞）到大鼠海綿體內(nèi)。

（二）勃起功能檢查

所有大鼠在CNI-ED建立后4周和12周進(jìn)行勃起功能評估。利用如前所述方法記錄最大海綿體內(nèi)壓（intracavernous pressure,ICP）和實(shí)時(shí)動脈壓（mean arterial pressure，MAP）[10]。麻醉后，暴露完整的陰莖和前列腺。定位MPG和CNs后，將一根26號針連接到導(dǎo)管的一端插入海綿體。導(dǎo)管的另一端連接到采集測量海綿體內(nèi)壓（ICP）的壓力數(shù)據(jù)的裝置（BL-420s，中國成都泰盟軟件有限公司）。接下來，暴露右側(cè)頸動脈，并在動脈中放置一個(gè)裝有肝素生理鹽水的20口徑套管，以測量平均動脈壓。套管的另一端通過壓力傳感器與BL-420s相連。用BL-420s連接的信號發(fā)生器，在海綿體神經(jīng)上放置刺激電極，刺激參數(shù)設(shè)置為6v、25hz、60s。計(jì)算每只大鼠的最大ICP/MAP比值（ICP/MAP）以比較勃起功能。

（三）馬松三色染色(Masson trichrome staining)

取材后將陰莖中段組織浸泡于4%多聚甲醛（Sigma，USA）中，程序性脫水后石蠟包埋，切成4um厚的組織切片后。經(jīng)二甲苯酒精梯度脫水后，利用馬松染色試劑盒（Masson trichrome stain kit,Solarbio,USA）對組織進(jìn)行染色。

（四）免疫熒光染色

取材后將陰莖中段組織浸泡于4%多聚甲醛,4小時(shí)后放入30%的蔗糖PBS溶液，4度冰箱過夜，OCT(Sakura Finetek USA) 包埋后于冷凍切片機(jī)切成6um厚的切片。稍晾干后即可使用10%驢血清封閉，封閉后孵一抗，平滑肌組織檢測使用nNOS抗體（abcam,USA）,4度冰箱過夜，后傾掉一抗，PBS潤洗3次，每次5分鐘。標(biāo)記的熒光二抗稀釋后加入組織，室溫孵育一小時(shí)，傾掉二抗，PBS潤洗。每個(gè)組織加入30uLPBS稀釋后的DAPI，室溫孵育5分鐘，PBS清洗后加入5uL抗熒光衰減封片劑，蓋上蓋玻片，室溫干燥后于熒光顯微鏡下拍照。

統(tǒng)計(jì)方法

本研究使用Graphpad Prism v7.0 software進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示，組間差異使用one-way ANOVA和T檢驗(yàn)檢測，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、ASCs形態(tài)

培養(yǎng)皿培養(yǎng)至P3代，ASCs呈現(xiàn)紡錘形，貼壁生長，如圖1所示。

二、勃起功能評價(jià)

圖2 大鼠陰莖海綿體測壓和平均動脈壓波形（ICP/MAP）

圖3 大鼠陰莖海綿體測壓和平均動脈壓波形（ICP/MAP）

大鼠在4周和12周分別進(jìn)行功能學(xué)檢測，結(jié)果如圖2所示。對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠ICP/MAP比值較AMC組顯著降低（0.33±0.08,0.45±0.10，0.74±0.06，P＜0.001，P＜0.01），差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組較對照組大鼠勃起功能顯著恢復(fù)（0.45±0.10，0.33±0.08，P＜0.05），12周后，對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠ICP/MAP比值仍低于AMC組（0.38±0.11,0.48±0.10,0.71±0.12），但比起4周有一定提升（0.48±0.10，0.45±0.10）。

三、馬松三色染色

馬松染色可以顯示平滑肌膠原成份和比例。如圖3所示，4周后，AMC組大鼠的平滑肌，膠原比例明顯高于對照組和實(shí)驗(yàn)組（0.42±0.20，0.19±0.18，0.34±0.19），細(xì)胞組平滑肌/ 膠原成份比例明顯高于對照組（0.34±0.19，0.19±0.18，P＜0.01），12周后，AMC組大鼠的平滑肌比膠原比例仍高于PBS組和實(shí)驗(yàn)組（0.43±0.12,0.19±0.13,0.38±0.15），實(shí)驗(yàn)組平滑肌比膠原比例比起4周時(shí)有升高（0.38±0.15，0.34±0.19）。

四、免疫熒光染色

圖4 大鼠陰莖海綿體Masson染色結(jié)果

nNOS染色可以顯示海綿體神經(jīng)型一氧化氮合酶數(shù)量和分布情況。如圖4所示，4周后，AMC組大鼠平滑肌數(shù)量顯著高于對照組和實(shí)驗(yàn)組（0.37±0.29,0,11±0.27，0.19±0.25，P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組（0.11±0.27，0.19±0.25，P＜0.05）。12周后，AMC組大鼠平滑肌數(shù)量仍高于PBS組和實(shí)驗(yàn)組（0.40±0.32,0.13±0.23,0.23±0.27，P＜0.001），細(xì)胞組平滑肌數(shù)量比起4周有一定提高（0.23±0.27，0.19±0.25，P＜0.05）。

圖5 大鼠陰莖nNOS免疫熒光染色結(jié)果和統(tǒng)計(jì)結(jié)果

討論

男性勃起是一項(xiàng)復(fù)雜的生理活動，需要神經(jīng)、血管、心理和內(nèi)分泌等共同調(diào)節(jié)[1]。ED病因眾多，其中盆腔手術(shù)或外傷造成的海綿體神經(jīng)損傷是ED的常見病因。早期研究認(rèn)為造成CNI-ED的原因是包含一氧化氮合酶的軸突變性，進(jìn)而導(dǎo)致無法完成正常和夜間勃起[11]。透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠海綿體神經(jīng)損傷28天后神經(jīng)纖維已部分再生而海綿體平滑肌卻持續(xù)纖維化[12]。因此，海綿體神經(jīng)損傷后修復(fù)海綿體神經(jīng)損傷和抗海綿體纖維化是治療CNI-ED的關(guān)鍵。

組織工程和干細(xì)胞研究的興起給CNI-ED治療帶來了新的可能。目前，海綿體注射間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)證實(shí)了其療效[13]。間充質(zhì)干細(xì)胞種類繁多，其中，ASCs以其廣泛的來源和一定的旁分泌能力而普遍用于組織和器官修復(fù)[14,15]。同時(shí)，其低表達(dá)MHC-II類免疫復(fù)合物也讓不同種屬之間使用成為可能[16]。在這項(xiàng)研究中，海綿體神經(jīng)損傷4周和12周后，對照組無論在勃起功能還是海綿體神經(jīng)型一氧化氮合酶數(shù)量上比起AMC組均降低，而ASCs細(xì)胞治療組大鼠勃起功能和nNOS數(shù)量均得到提高。4周和12周后，實(shí)驗(yàn)組的平滑肌比膠原成份比例也顯著高于對照組。

目前國際關(guān)于海綿體注射間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷的機(jī)制多認(rèn)為旁分泌作用（Paracrine effect）[17]。間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌生物活性因子如神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），胰島素樣生長因子（insulin like growth factor,IGF）和腦源性生長因子（brain derived nerve growth factor,BDNF）等，其中，NGF、IGF和BDNF均具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，VEGF則具有血管營養(yǎng)和再生作用[18,19]。在我們的前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)ASCs可以分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal derived factor-1,SDF-1)從而促進(jìn)膀胱血管化[20]。這項(xiàng)研究中，我們推測，ASCs分泌的生長因子促進(jìn)了損傷部位的神經(jīng)修復(fù)，進(jìn)而減少了海綿體組織的纖維化，恢復(fù)了CNI-ED大鼠的勃起功能。

同時(shí)，我們的研究存在一些不足，如沒有探究ASCs治療CNI-ED的具體作用因子及機(jī)制，沒有使用老齡大鼠來精確模擬老齡人口CNI-ED患者的真實(shí)生理狀態(tài)，這在我們今后的研究中將會得到改進(jìn)。

結(jié)論：本項(xiàng)研究建立CNI-ED大鼠動物模型并通過海綿體注射ASCs對CNI-ED進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)ASCs可以通過促進(jìn)神經(jīng)再生和保護(hù)海綿體平滑肌，來改善CNI-ED大鼠的勃起功能，提示ASCs治療神經(jīng)損傷性ED具有良好前景。