百日咳患兒及密切接觸者的細(xì)菌培養(yǎng)和藥物敏感性檢測

雷炎玲，王紅梅，張交生，鄧?yán)^巋

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東珠海 519090；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東深圳 518038)

百日咳是由百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis，Bp)引起的急性呼吸系統(tǒng)疾病，治療及預(yù)防藥物以紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為首選。自1994年在美國亞利桑那州尤馬縣分離出第一株耐紅霉素百日咳鮑特菌菌株后[1]，國內(nèi)外相繼出現(xiàn)百日咳耐藥菌株；與國外百日咳耐藥情況少見不同，近年來我國百日咳鮑特菌耐紅霉素比例較高[2-5]。同時，百日咳的流行模式已從過去的兒童-兒童模式轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在的青少年(成人)-兒童模式。本研究對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確診的百日咳住院患兒及其密切接觸者進行百日咳鮑特菌培養(yǎng)，并檢測患兒分離株對9種抗生素的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，為了解百日咳傳播模式及臨床合理用藥提供參考。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取深圳市兒童醫(yī)院2015年8月至2017年6月具有臨床癥狀且通過PCR確診的百日咳住院患兒及其密切接觸者。百日咳的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國兒童百日咳診斷及治療建議》2017年版標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2 百日咳鮑特菌培養(yǎng)

在入院當(dāng)天即取患兒及密切接觸者的鼻咽拭子，固定采集對象頭部及四肢，將藻酸鈣拭子(Puritan，美國)貼鼻孔壁，沿垂直于耳垂方向慢慢轉(zhuǎn)動進入其一鼻孔內(nèi)，至鼻腭處(深度約為鼻尖至耳垂距離)，然后邊擦拭邊旋轉(zhuǎn)慢慢取出；取左右兩側(cè)，接種于添加了頭孢氨芐的10%的脫纖維羊血碳瓊脂平皿(OXOID，英國)，立即送檢并以35 ℃普通孵箱(濕度60%～70%)孵育。標(biāo)本采集由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員進行，采集前征得患兒監(jiān)護人知情同意并配合。

1.3 百日咳鮑特菌鑒定

接種孵育48 h后即開始觀測平皿菌落生長情況，每2 d觀測一次，最長孵育10 d。百日咳鮑特菌疑似菌落：細(xì)小、圓形、光滑、凸起、銀灰色、不透明的菌落，革蘭染色鏡下可見革蘭陰性短小的球桿菌；觸酶實驗陽性(取少許可疑菌落均勻涂于含3% H2O2的觸酶試劑的玻片上，有氣泡產(chǎn)生)；百日咳鮑特菌血清(Remel Europe Ltd,英國)凝集反應(yīng)陽性，副百日咳血清凝集反應(yīng)陰性，即可判斷此菌為百日咳鮑特菌，反之為副百日咳鮑特菌。

1.4 百日咳鮑特菌藥敏試驗

采用E-Test法檢測9種抗生素阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲唑、克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素和紅霉素的MIC值，藥敏培養(yǎng)基為含10%脫纖維羊血的碳瓊脂(英國OXOID公司瓶裝碳瓊脂粉)，25 mL/90 mm平皿。E-Test紙條購自法國BIOMERIEUX公司，操作步驟及及判讀方法依照說明書檢測菌株對紅霉素等抗生素的MIC值；MIC 32～>256 mg/L可視為紅霉素及其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥[1-3，7-8]，其他抗生素參考按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI2017年嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)MIC值判定細(xì)菌的藥敏結(jié)果，MIC值在孵育第3日和第7日讀取，取兩者中最大MIC值。質(zhì)控菌株：肺炎鏈球菌ATCC49619、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯菌ATCC700603，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基本情況

本研究共收集PCR確診的百日咳住院患兒373例，其中男223例(59.79%)；中位年齡為3(2，5)月，其中≤3個月200例(53.62%)，≤6個月313例(83.91%)，新生兒8例；經(jīng)培養(yǎng)分離出百日咳鮑特菌136株(36.46%)。在449例密切接觸者中，分離出116株百日咳鮑特菌(25.84%)，主要來自母親(50.00%，58/116)，其次為父親和祖母。見表1。

表1 百日咳患兒密切接觸者百日咳鮑特菌分離情況

2.2 百日咳鮑特菌藥敏試驗結(jié)果

E-Test法提示患兒百日咳鮑特菌對紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感率為47.7%(53/111)，對復(fù)方磺胺甲唑敏感率為100%(112/112)，見表2。

表2 百日咳鮑特菌對9種常用抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

本研究中，PCR確診的百日咳住院患兒共373例，其中≤3個月患兒占53.62%，與2010年美國加利福尼亞州的報告(55.13%，446/809)[9]基本一致，與中國重慶胡云鴿等[10]的研究(48.58%，120/247)也非常接近。一般認(rèn)為，年齡越小，百日咳越容易出現(xiàn)并發(fā)癥，需要住院的比例也越高[11-12]。

百日咳的典型痙攣性咳嗽癥狀多發(fā)生在嬰幼兒人群，在青少年及成人百日咳中較為少見，往往癥狀輕微，或只是表現(xiàn)為慢性咳嗽。由于診斷手段不足和診斷意識缺乏，相當(dāng)數(shù)量的成人百日咳可能被漏診，使治療難以及時進行，造成百日咳在家庭成員中的傳播，<3個月嬰幼兒尚未接種疫苗，無疑是高危人群。本研究調(diào)查了223個百日咳患兒家庭的449例家庭成員，通過培養(yǎng)分離出百日咳鮑特菌116株(25.84%)，絕大多數(shù)為成人，表明成人百日咳不少見，近期國內(nèi)血清學(xué)調(diào)查結(jié)果也支持這一點[13-14]。這些培養(yǎng)陽性的密切接觸者中母親占50%(58/116)，其次為父親和祖母，分別占19.83%和18.10%。母親是小嬰兒的最密切接觸者，可以推測母親是百日咳住院患兒主要的傳染源[15]。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療百日咳的首選藥物。世界范圍內(nèi)細(xì)菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，百日咳鮑特菌對紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的現(xiàn)象屢見報道。目前國際上沒有百日咳鮑特菌抗生素敏感試驗檢測方法及結(jié)果判定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，公認(rèn)紅霉素及其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物MIC為32～256 mg/L即為耐藥。盡管美國首先報道了耐紅霉素百日咳鮑特菌[1]，但在歐美國家耐藥并不多見，如芬蘭對2006-2017年分離的148株百日咳鮑特菌，選取50株進行藥敏檢測，未發(fā)現(xiàn)有耐藥株[16]；法國2012年、美國1997年也只有個別耐藥株的報道[7-8]。但在中國近年來的報道中，北京、陜西西安及浙江地區(qū)對紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類耐藥比例高達(dá)75.4%～91.9%，上海地區(qū)為57.5%，華南地區(qū)目前無相關(guān)數(shù)據(jù)[2-5]。本研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)百日咳鮑特菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感率為47.7%，與上海地區(qū)相近，提示百日咳的耐藥可能與地域有關(guān)。本研究及其他相關(guān)研究中均未發(fā)現(xiàn)對復(fù)方磺胺甲唑耐藥的菌株，提示作為百日咳治療選擇的二線抗生素，復(fù)方磺胺甲唑?qū)Π偃湛弱U特菌保持了相當(dāng)好的敏感性。這些都是體外檢測的結(jié)果，臨床治療效果究竟如何還需更多研究。

綜上所述，百日咳住院患兒以3個月以下小嬰兒多見，母親可能是主要傳染源，深圳地區(qū)百日咳鮑特菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥較常見，未發(fā)現(xiàn)對復(fù)方磺胺甲唑耐藥的菌株。