天然橡膠生物合成分子調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

楊起航，劉坤杰，劉 樂，王 斐，李鴻彬，謝全亮

（石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院和農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

天然橡膠（NR）是產(chǎn)膠植物自身合成的類異戊二烯聚合物。到目前為止，巴西橡膠樹（H.brasiliensis，以下簡稱橡膠樹）幾乎是NR唯一來源，由于受橡膠樹種植面積有限、難以遺傳改良、葉枯病危害大以及人力物力有限的影響，全球NR產(chǎn)量達(dá)到極限[1]，這一問題至今無法突破。2019年我國自主生產(chǎn)NR 85.6萬t（約占總消費(fèi)量的20%），80%的NR仍然依賴進(jìn)口，面臨著進(jìn)口集中度高、貿(mào)易限制和國內(nèi)需求不斷增長等問題，一旦NR進(jìn)口來源阻斷，對(duì)我國各行各業(yè)都十分不利[2]。當(dāng)前，NR生物合成的精確調(diào)控機(jī)制仍然不清楚，這也成為限制提高NR產(chǎn)量進(jìn)度最主要因素。因此，橡膠樹和其他產(chǎn)膠植物的橡膠生物合成機(jī)制仍然有待深入解析。NR生物合成機(jī)制的精確解析有利于開發(fā)新的產(chǎn)膠植物，以解決橡膠樹橡膠來源單一的問題，同時(shí)也對(duì)NR生物合成的遺傳機(jī)制研究具有深遠(yuǎn)的意義。

1 產(chǎn)膠植物基因組學(xué)的研究進(jìn)展

世界上有超過2 500種產(chǎn)膠植物，但僅少數(shù)產(chǎn)膠植物可被人類利用，例如：橡膠樹、橡膠草、杜仲以及銀膠菊。2013年，橡膠樹基因組草圖首次破解[3]，2016年，C.R.TANG等[4]進(jìn)一步深度測序，獲得橡膠樹93.8%（1.47 Gb）的基因組，約43 792個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。在橡膠樹基因組中鑒定了94個(gè)屬于20個(gè)基因家族的橡膠生物合成相關(guān)基因。18個(gè)基因?qū)儆诩琢u戊酸（MVA）途徑，22個(gè)基因?qū)儆?-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑，15個(gè)基因?qū)儆诩?xì)胞質(zhì)中引發(fā)劑合成；39個(gè)基因?qū)儆谙鹉z粒子相關(guān)的橡膠延伸基因，這其中包括18個(gè)橡膠延伸因子（REF）/小橡膠粒子蛋白質(zhì)（SRPP）。2020年，J.LIU等[5]將基因組裝配到橡膠樹18條假染色體上，鑒定了許多與產(chǎn)膠相關(guān)的候選基因。2018年我國完成首個(gè)杜仲基因組測序，其環(huán)境適應(yīng)機(jī)制可歸因于逆境反應(yīng)或次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的高表達(dá)/顯著擴(kuò)張。杜仲與橡膠樹的異戊二烯焦磷酸（IPP）主要來自MVA途徑。而杜仲與真菊Ⅰ和Ⅱ類分化時(shí)間可追溯到約1.29億年前，經(jīng)古老的基因組3倍化復(fù)制，卻無近期基因組復(fù)制發(fā)生[6]。研究顯示，雖然橡膠樹和杜仲中SRPP/REF基因家族都存在顯著擴(kuò)張的現(xiàn)象，但橡膠樹中SRPP和REF基因同時(shí)參與順式-1，4-聚異戊二烯的NR合成，而杜仲橡膠合成只有SRPP基因參與。杜仲中法尼基焦磷酸（FPS）基因家族存在擴(kuò)張并出現(xiàn)功能分化，產(chǎn)生了具有反式長鏈橡膠合成功能的Ⅱ類FPS基因，所以杜仲合成以反式-1，4-聚異戊二烯為主的NR。此外，橡膠樹和杜仲SRPP/REF和FPS基因家族成員屬不同分支，說明雙子葉植物中橡膠生物合成為多起源。

2017年橡膠草基因組測序由中國科學(xué)家率先完成并正式對(duì)外公布[7]，基因組約為1.29 Gb，46 000多個(gè)基因，共鑒定102個(gè)橡膠生物合成相關(guān)候選基因，其中MVA途徑有6個(gè)步驟，40個(gè)基因；MEP途徑有8個(gè)步驟，23個(gè)基因，以及19個(gè)基因用于引發(fā)劑合成和20個(gè)基因用于橡膠粒子相關(guān)的橡膠延伸蛋白質(zhì)。深入分析橡膠草基因組數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)一些橡膠草自交衰退相關(guān)的可能候選區(qū)域。然而，銀膠菊基因組的研究還未系統(tǒng)展開。

2 NR生物合成分子調(diào)控機(jī)制

NR生物合成主要發(fā)生于產(chǎn)膠植物細(xì)胞溶質(zhì)中MVA途 徑 和 質(zhì)體 中MEP途 徑。MVA和MEP途徑合成橡膠前體單分子IPP，其中參與IPP和橡膠聚合物（IPP×n）形成的基因稱為橡膠生物合成基因，這些基因在橡膠樹中已被初步鑒定[4]。在MVA途徑所有基因家族中，每個(gè)基因家族至少有一個(gè)基因成員在橡膠樹的膠乳中鑒定并高調(diào)。然而，在MEP途徑的22個(gè)基因中，僅DXS7和DXS10基因在膠乳中顯著表達(dá)，這表明在橡膠樹中IPP的合成以MVA途徑為主，也進(jìn)一步說明MVA途徑是NR生物合成的主要途徑。

在短角蒲公英中，鑒定了3種羥基甲基戊二酰-CoA還原酶（HMGR）基因，其功能分析表明TbHMGR1參與NR生物合成前體的調(diào)控[8]。橡膠草基因組的TkHMGR1和TkHMGR2主要在根中表達(dá)，在根膠乳中表達(dá)最高[7]。HMGR上游的3個(gè)基因，即三磷酸腺苷（ATP）、檸檬酸裂解酶（ACL）和乙酰乙酰-CoA硫解酶（AACT）的表達(dá)，與短角蒲公英膠乳中類異戊二烯合成前體的合成相關(guān)。此外，短角蒲公英膠乳中ACL，AACT和HMGR在擬南芥中過量表達(dá)導(dǎo)致這3種酶的活性和積累增加，從而導(dǎo)致甾醇、五環(huán)三萜、順式-1，4-聚異戊二烯以及角鯊烯等次生代謝產(chǎn)物增加，這可能具有一定的工業(yè)價(jià)值[9]。目前，在蒲公英屬和其他產(chǎn)膠植物中，已鑒定了幾種NR生物合成相關(guān)基因，其中包括維持橡膠粒子穩(wěn)定性的SRPP和REF以及控制橡膠鏈延長的順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（CPT）和與CPT相互作用[橡膠轉(zhuǎn)移酶（RTA）或類CPT（CPTL）]的橡膠轉(zhuǎn)移酶活化劑等[10]。然而，它們的相互關(guān)系以及精確調(diào)控機(jī)制仍不清楚，不同產(chǎn)膠植物的NR生物合成機(jī)制仍有待深入解析。

在橡膠樹基因組中MVA途徑6個(gè)基因已被克隆并分析了它們的表達(dá)水平。其中，HbAACT1，HMGS1，HbMVK，HbPMK和 HbMVD在 膠 乳 中 高度表達(dá)，并且在酵母中MVA途徑缺失突變已補(bǔ)充鑒定。然而，羥甲基戊二酰-CoA合成酶（HMGS）和HMGR的多個(gè)基因具有不同的表達(dá)模式[11]。據(jù)報(bào)道[12]，HMGR1參與NR生物合成，而HMGS活性與膠乳中橡膠含量正相關(guān)。HbHMGR1的過表達(dá)增加了煙草植物中的甾醇積累[12]。橡膠樹和非橡膠植物朝鮮薊（Cynara scolymus）在MEP途徑和橡膠引發(fā)劑合成中酶的基因數(shù)相似，但產(chǎn)膠植物中MVA途徑和橡膠延伸蛋白質(zhì)中基因數(shù)更多[7]。橡膠粒子涉及橡膠聚合酶和蛋白質(zhì)的位置，橡膠轉(zhuǎn)移酶（RT-ase）復(fù)合物可能包括參與底物結(jié)合、催化、相對(duì)分子質(zhì)量調(diào)節(jié)和橡膠聚合物正確引導(dǎo)到橡膠粒子內(nèi)部的蛋白質(zhì)。然而，許多其他蛋白質(zhì)也與橡膠粒子有關(guān)。這些蛋白質(zhì)包括膜結(jié)合蛋白質(zhì)和其他僅與橡膠粒子相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們可以很容易地被置換[13]，在沒有可溶解RT-ase活性的情況下，明確鑒定哪些蛋白質(zhì)直接參與NR生物合成的調(diào)節(jié)仍具有挑戰(zhàn)性，并且遺傳方法在鑒定嘗試中也起關(guān)鍵作用。一些橡膠粒子蛋白質(zhì)似乎與橡膠粒子的結(jié)構(gòu)和完整性有關(guān)。在轉(zhuǎn)錄組研究方面，橡膠樹鑒定了1 709個(gè)新的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）簡單重復(fù)序列（SSR），并且在MVA和MEP途徑的NR生物合成途徑中共驗(yàn)證了78個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記[14]。橡膠草與橡膠樹相比，轉(zhuǎn)錄組中橡膠產(chǎn)量相關(guān)性狀的標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了與高橡膠相關(guān)的更多SNP標(biāo)記[15]。有趣的是，橡膠樹的MEP途徑中各基因的表達(dá)豐度表明，MEP途徑比MVA途徑參與該物種的橡膠產(chǎn)量更重要。此外，在參與菊粉生產(chǎn)的基因中發(fā)現(xiàn)了比在NR生物合成中更多的SNP，表明NR生物合成基因的高度保守性。冷馴化的銀膠菊轉(zhuǎn)錄組中總共有11 748個(gè)EST，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)EST來自編碼應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)基因，而只有1%的EST鑒定與NR生物合成相關(guān)[16]。

3 小橡膠粒子蛋白質(zhì)在NR合成中作用的研究進(jìn)展

橡膠粒子膜上豐富的SRPP能與REF相互作用，這表明REF可能在橡膠粒子膜上以同多聚體或異多聚體的形式存在。SRPP同源基因已在橡膠植物和非橡膠植物（擬南芥）中鑒定，并指出SRPP家族成員是與抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)家族[17]。REF是橡膠粒子膜上的蛋白質(zhì)，可能與膠乳植物的NR生物合成有關(guān)，盡管橡膠粒子膜上蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用并未給出更多定義，但在各種橡膠樹中REF的轉(zhuǎn)錄水平已顯示與膠乳產(chǎn)量成正相關(guān)。通過無細(xì)胞翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)將重組REF引入橡膠粒子洗脫液會(huì)降低其凝結(jié)作用，REF可能參與了橡膠粒子的穩(wěn)定或維持。使用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選REF相互作用蛋白質(zhì)導(dǎo)致分離橡膠橋鏈蛋白（HRBP）作為相互作用蛋白[18]。橡膠樹中橡膠粒子結(jié)合蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明，REF可以與HRBP相互作用。盡管REF（14.7 kDa）比SRPP（22.3 kDa）短得多，REF也可歸為SRPP系列，因?yàn)镽EF與SRPP同源。但是在其他植物物種中并未發(fā)現(xiàn)REF直系同源物，這兩種蛋白質(zhì)具有顯著的同源性（約72%的氨基酸有同源性）。REF與HRBP之間相互作用表明，HRT1-HRBP復(fù)合物可以進(jìn)入橡膠粒子膜上包含豐富SRPP和REF的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中，從而錨定在橡膠粒子膜上產(chǎn)生功能。SRPP和REF確實(shí)在橡膠樹膠乳凝固和橡膠粒子穩(wěn)定中起重要作用[19]。SRPP通過在脂質(zhì)頭基上顯示一種“覆蓋效應(yīng)”而不干擾膜完整性來穩(wěn)定橡膠粒子[20]。脂質(zhì)液滴的相關(guān)研究進(jìn)一步驗(yàn)證了這種想法，脂質(zhì)液滴分隔的是三酰基甘油而不是橡膠聚合物，其中HbSRPP的同源物被鑒定為脂質(zhì)液滴相關(guān)蛋白質(zhì)，并且在應(yīng)激條件下是維持脂質(zhì)液滴所必需的[21]。銀膠菊和橡膠草中橡膠粒子均分別含有HbSRPP同源物PaGHS和TkSRPP[22]。

在橡膠草基因組中，檢測到1個(gè)TkREF和9個(gè)TkSRPP基因組成的家族成員。基于產(chǎn)膠和非產(chǎn)膠植物的REF/SRPP蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育的樹，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)橡膠草與橡膠樹SRPP基因?qū)儆趦蓚€(gè)獨(dú)立的分支，這表明橡膠粒子穩(wěn)定機(jī)制在兩個(gè)物種中是不同的。以前的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論，可能是由于NR生物合成是植物界的一個(gè)獨(dú)立演化過程[7]。橡膠草基因中大多數(shù)REF/SRPP基因在膠乳和根中表現(xiàn)出特異性高表達(dá)水平。其中SRPP有4種 同 種 型（TkSRPP1，TkSRPP2，TkSRPP3和TkSRPP4）在膠乳中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平比在其他組織中高得多，而其他4種異構(gòu)體在根中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著高于其他組織。這說明REF/SRPP基因可能在橡膠草的NR生物合成中起重要作用。短角蒲公英膠乳中TbREF定位于橡膠粒子中，屬于非典型SRPP家族蛋白質(zhì)[23]。據(jù)報(bào)道，排除TbREF在橡膠中的積累具有負(fù)面影響，該蛋白質(zhì)在NR生物合成中有一定的作用，但仍不清楚是否與其他組分（如TbRTA）有相互作用。

4 產(chǎn)膠植物產(chǎn)膠機(jī)制的研究進(jìn)展

目前研究比較廣泛的橡膠植物是菊科蒲公英屬的橡膠草[24]。對(duì)橡膠草環(huán)境適應(yīng)性的研究[25]表明，橡膠草可廣泛種植在高緯度或低緯度地區(qū)。多年生橡膠草根部可產(chǎn)生比橡膠樹NR具有更高相對(duì)分子質(zhì)量的NR。此外，橡膠草還可以產(chǎn)生菊粉，其為生產(chǎn)生物乙醇的原材料[26]。由于橡膠草具有種植面積廣、成熟時(shí)間短、機(jī)械化種植和采收容易等優(yōu)勢(shì)，使得其成為第二大或替代橡膠樹的產(chǎn)膠植物。由于對(duì)橡膠草更容易進(jìn)行遺傳改良、橡膠合成機(jī)制以及分子育種等研究，使其成為探討NR生物合成機(jī)制的理想模式植物。野生橡膠草馴化在未來有較好的前景[27]，但由于其高雜合性和自交不親和性等因素，未來橡膠草作為商業(yè)上可行的第二大或替代傳統(tǒng)橡膠樹的產(chǎn)膠植物，其NR生物合成調(diào)控機(jī)制的研究仍然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

5 結(jié)語

產(chǎn)膠植物NR生物合成調(diào)控機(jī)制精確解析與NR產(chǎn)量提升緊密相關(guān)，盡管研究者們對(duì)類異戊二烯生物合成途徑以及NR生物合成中涉及的基因和蛋白質(zhì)的解析已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但對(duì)NR生物合成分子機(jī)制的精確解析仍然存在諸多問題。目前，NR生物合成可能是從多萜醇合成酶/十一烯醇/丙烯共聚物和CPT失去了它們特定的寡聚鏈終止基序，使它們能夠催化縮合合成。細(xì)菌、酵母和植物中的互補(bǔ)和異源表達(dá)，未能使長鏈橡膠分子產(chǎn)生，并且對(duì)類異戊二烯終產(chǎn)物的增強(qiáng)有限[28]。在遺傳改良試驗(yàn)中使用順式或無標(biāo)記基因載體可以改善類異戊二烯最終產(chǎn)物。類似方法也可用于提高NR產(chǎn)率和相對(duì)分子質(zhì)量。到目前為止，NR生物合成機(jī)制及其底物和活化劑的復(fù)雜性阻止了橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物及其橡膠轉(zhuǎn)移酶活性的完全重構(gòu)[29-30]。深入分析細(xì)胞溶質(zhì)中MVA途徑和質(zhì)體中MEP途徑之間的代謝通量，包括區(qū)室串?dāng)_和反饋環(huán)，將非常有助于選擇最合適的遺傳轉(zhuǎn)化，以獲得轉(zhuǎn)基因植物并提高橡膠含量。類異戊二烯生物合成基因/蛋白質(zhì)的過表達(dá)未能提高最終產(chǎn)物的產(chǎn)量，這可能與負(fù)反饋機(jī)制或下游限速酶的功能有關(guān)，但這還未解析清楚。新基因編輯、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等其他先進(jìn)技術(shù)工具的出現(xiàn)，應(yīng)該可以研究單個(gè)或多個(gè)NR相關(guān)基因的作用，并可能提高產(chǎn)膠量。

NR合成生物學(xué)的出現(xiàn)及其與代謝工程的協(xié)同作用為創(chuàng)造定制的體外模擬細(xì)胞橡膠合成提供了巨大的機(jī)會(huì)。產(chǎn)膠植物的基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)可能為增加橡膠基質(zhì)提供有效的策略。橡膠草是一個(gè)潛在替代橡膠樹的最有前景的菊科植物，此外，對(duì)橡膠REF/SRPP兩個(gè)重要基因家族來說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它們不同的進(jìn)化軌跡。 但是SRPP基因家族精確調(diào)控機(jī)制還未解析清楚，相信SRPP對(duì)NR生物合成調(diào)控機(jī)制的研究會(huì)為提高NR產(chǎn)量提供寶貴的技術(shù)，并促進(jìn)替代橡膠樹的產(chǎn)膠作物開發(fā)和利用。這些研究結(jié)合分子機(jī)制、育種、農(nóng)藝，并將收獲技術(shù)與提取工藝相結(jié)合，將有助于精確解析橡膠草的NR合成機(jī)制和提高其產(chǎn)膠量。預(yù)計(jì)此舉可以將橡膠草的NR產(chǎn)量提高到商業(yè)上可行的水平，在未來幾年極大地加快其替代橡膠樹的研究進(jìn)程。