人類輔助生殖培養(yǎng)液的質(zhì)量控制和安全性評價

【作 者】趙丹妹，黃元禮，王春仁，柯林楠，韓倩倩

中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

人類輔助生殖技術(shù)（human assisted reproductive technology，ART）主要是通過人工方式將配子（卵子和精子）在體外結(jié)合，形成受精卵后將其移植回母親子宮。是繼藥物、手術(shù)解決不孕不育問題后又一有效手段。人類輔助生殖技術(shù)主要包括體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植三個過程。在此過程中尤其在實驗室中，會涉及大量的人類輔助生殖培養(yǎng)液[1]，比如在體外受精階段有精子顯微操作液、取卵-胚胎處理液、配子處理液、卵裂胚培養(yǎng)液、精子制動液；在胚胎培養(yǎng)階段有生長液、卵裂胚培養(yǎng)液、受精培養(yǎng)液、培養(yǎng)用油；在胚胎移植階段有胚胎膠、胚胎移植液等；在胚胎冷凍保存階段有卵裂胚冷凍液、卵裂胚復(fù)蘇液、囊胚玻璃化冷凍液、囊胚玻璃化復(fù)蘇液等。這一系列的培養(yǎng)液主要為配子和受精卵提供生存與發(fā)育的能量組分。而配子、合子及不同細胞階段的胚胎，對于微環(huán)境的變化十分敏感，不同階段使用的培養(yǎng)液的質(zhì)量將直接影響著胚胎及后代的健康，所以，對于輔助生殖培養(yǎng)液的質(zhì)量和風(fēng)險控制尤為重要。

胚胎對于能量的利用有著不同發(fā)育階段的特異性。市場上有多種不同配方的培養(yǎng)基可供選擇，從簡單的鹽溶液到含有合成氨基酸和生長因子的復(fù)雜組織培養(yǎng)基。一般輔助生殖培養(yǎng)液的組成成分有鹽類、碳水化合物、維生素類、重組胰島素、乙二胺四乙酸（EDTA）、人血清白蛋白、抗生素、醇類、氨基酸類、石蠟油等[2]。而在這些產(chǎn)品中，每種組分的作用與其風(fēng)險都應(yīng)予以考慮，因為這些都關(guān)系著體外輔助生殖治療的安全性與有效性。輔助生殖培養(yǎng)液之間的差異能夠影響到胚胎的產(chǎn)前及產(chǎn)后發(fā)展、囊胚形成率、胚胎著床率、活產(chǎn)率、胎兒出生體重等重要環(huán)節(jié)[3-4]，需要嚴格對其進行質(zhì)量控制。

目前，人類輔助生殖培養(yǎng)液在我國被作為第三類醫(yī)療器械進行管理，均需對其中的組分穩(wěn)定性、降解產(chǎn)物與雜質(zhì)的風(fēng)險、添加藥物的質(zhì)量進行控制。

1 人類輔助生殖培養(yǎng)液的成分穩(wěn)定性控制

人類輔助生殖培養(yǎng)液在正常使用過程中，應(yīng)確保不會對于配子、胚胎或者準(zhǔn)媽媽的安全性產(chǎn)生不利影響。這就需要對于培養(yǎng)液中組分的穩(wěn)定性進行控制。需要監(jiān)測其中的關(guān)鍵組分，在產(chǎn)品的有效期內(nèi)適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下，確保其含量在維持產(chǎn)品功能性的要求范圍內(nèi)，且不產(chǎn)生不利影響。對于輔助生殖培養(yǎng)液類產(chǎn)品，在上市前的注冊檢驗過程中，應(yīng)采用相應(yīng)的檢測手段對于培養(yǎng)液中添加的主要成分如各種維生素、丙酮酸、葡萄糖、EDTA、氨基酸、人血清白蛋白、抗生素等的含量進行確定，確保其成分含量的有效性，進而確保產(chǎn)品質(zhì)量。

維生素作為維持細胞生長的活性物質(zhì)，在細胞中大多形成酶的輔基或者輔酶，對于細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素（A、D、E、K）常從血清中得到補充。而水溶性維生素包括維生素B類（生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12）和維生素C。維生素C是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。而引起維生素降解的主要因素包括：培養(yǎng)液pH、氧化、光照（紫外）、加熱以及存在有能引起其它化學(xué)反應(yīng)的活性物質(zhì)。保證各種所需維生素含量的穩(wěn)定性是維系合子、受精卵、胚胎發(fā)育正常的首要條件。如維甲酸（RA）被證明是細胞發(fā)育和分化、胚胎生長和生殖功能的重要調(diào)節(jié)器。RA也可以嚴格控制許多生殖事件，如卵母細胞發(fā)育、卵泡生長和胚胎早期生長。此外，RA還管理細胞的凋亡信號和氧化損傷[5]。再如硫辛酸屬于B族維生素中的一類化合物，是細胞利用糖類等能源物質(zhì)產(chǎn)生能量所需的一種限制性必需營養(yǎng)物質(zhì)，它還是一種有效的抗氧化劑和重金屬螯合劑。硫辛酸在多酶系統(tǒng)中起輔酶作用，可以催化丙酮酸氧化脫羧成乙酸及α-酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酸反應(yīng)中的轉(zhuǎn)?；饔?。有研究結(jié)果表明[6]，無論在培養(yǎng)期間施加的氧氣濃度如何，添加較高濃度的硫辛酸都會導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損，而相對較低濃度的硫辛酸則會改善胚胎質(zhì)量。那么就需要嚴格控制其含量的穩(wěn)定性。需要持續(xù)研究維生素的不穩(wěn)定性和反應(yīng)特性，提高培養(yǎng)液的均一性，進而提高其成分的穩(wěn)定性。

葡萄糖、丙酮酸、乳酸等成分在輔助生殖培養(yǎng)液中起著重要的作用。體外培養(yǎng)液中葡萄糖或丙酮酸鈉的含量過高時，會對卵母細胞的成熟產(chǎn)生抑制作用；而含量過低時，會導(dǎo)致胞質(zhì)和胞核不同步成熟發(fā)育；同時，葡萄糖的濃度會直接影響到所述體外培養(yǎng)液的滲透壓[7]。現(xiàn)在普遍認為丙酮酸是胚胎植入前發(fā)育的所有培養(yǎng)基中的重要成分[8]。丙酮酸、乳酸等[9]三羧酸主要為受精卵的發(fā)育提供能量。體外培養(yǎng)發(fā)育到卵裂階段時，主要由丙酮酸和乳酸為胚胎供能，而后發(fā)育到致密化期及以后，主要依賴葡萄糖供給能量，并且葡萄糖可以抑制卵裂階段胚胎的發(fā)育，但對綿羊、豬植入前胚胎研究表明葡萄糖對其體外發(fā)育無抑制作用。丙酮酸是哺乳動物胚胎生長發(fā)育所必需的物質(zhì)，葡萄糖可以為胚胎提供能量并以關(guān)鍵底物形式調(diào)控生物合成通路。葡萄糖[10]作為幾乎所有培養(yǎng)液必含的能源物質(zhì)，是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，起著重要的作用。而在體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生乳酸。而過量的乳酸對體外培養(yǎng)不利，需要限制培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養(yǎng)供應(yīng)不足，細胞生長抑制。此時則需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達量等參數(shù)進行綜合考慮。限定培養(yǎng)液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸等成分的含量，降低或消除不利因素，維持其正常效用來確保培養(yǎng)液的安全性與有效性極為重要。

氨基酸[11]是合成蛋白質(zhì)的必需原料，也是細胞代謝的關(guān)鍵產(chǎn)物。許多研究表明[12]，單個或多個氨基酸的限制會導(dǎo)致mRNA加工和細胞生長受阻，以及產(chǎn)物的氨基酸序列的改變。谷氨酰胺也是輔助生殖培養(yǎng)液中重要的組成成分。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細胞生長不良甚至死亡。谷氨酰胺對細胞的培養(yǎng)特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的原料。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，可以降解生成不利于人體的氨。另外，天冬酰胺的存在也會降解產(chǎn)生氨。此時，更需控制這些成分的含量。目前，大多采用比其更穩(wěn)定的丙氨酰谷氨酰胺作為谷氨酰胺的替代成分。

2 人類輔助生殖培養(yǎng)液組分的降解產(chǎn)物與雜質(zhì)的風(fēng)險控制

對于某些不穩(wěn)定但關(guān)鍵的組分需要追蹤其降解規(guī)律與趨勢，考慮這些成分產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對于最終的人類輔助生殖培養(yǎng)液的毒性和性能所產(chǎn)生的影響。培養(yǎng)液引入任何一個新的組分，都會有可能增加培養(yǎng)液產(chǎn)生副反應(yīng)的可能性，從而增加培養(yǎng)液穩(wěn)定性風(fēng)險，因此需要結(jié)合每個反應(yīng)特性來決定是否添加某種新的成分，如絡(luò)合劑/螯合劑通常會降低培養(yǎng)基組分的生物活性。結(jié)構(gòu)類似物的選擇需要考慮轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)后，是否可以恢復(fù)其生理活性形式。

氨基酸在溶液中會自發(fā)地脫氨[13]，且已經(jīng)證實培養(yǎng)液只需要培養(yǎng)一段時間就會釋放出大量甚至達到有毒性水平的氨。體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸。乳酸和氨這兩種主要代謝廢物的積累都可以影響細胞生長以及培養(yǎng)液質(zhì)量。所以它們作為代謝產(chǎn)物又需要嚴密追蹤其濃度變化，保證其濃度不會對培養(yǎng)液質(zhì)量產(chǎn)生影響。

培養(yǎng)液中還常加入一些動物源性物質(zhì)，如在“合成”透明質(zhì)酸的生產(chǎn)過程中所用的血清白蛋白、從雞冠中提取的透明質(zhì)酸等。為了盡量消除或減少從動物組織中帶來的風(fēng)險的傳播，也要對這些組分進行相應(yīng)的質(zhì)量控制。

血清白蛋白作為蛋白質(zhì)的主要來源，支持著胚胎的發(fā)育能力。血清白蛋白會帶來血液制品相關(guān)的某些疾病傳播的風(fēng)險。血清白蛋白也給培養(yǎng)液帶來了結(jié)合脂肪酸和其他代謝產(chǎn)物，如檸檬酸鹽和類固醇[14]。有研究已經(jīng)證明商用的用于人類輔助生殖技術(shù)的培養(yǎng)液的血清白蛋白制劑中含有大量未知蛋白質(zhì)和過渡金屬[15-16]。此外，白蛋白的加工可能導(dǎo)致引入已知的化學(xué)物質(zhì)，如用于穩(wěn)定白蛋白卻已被證明對胚胎發(fā)育有害的辛酸[17]。在人類胚胎培養(yǎng)液中，還有研究人員提出作為蛋白質(zhì)補充物的血清白蛋白可能是可檢測到的二（2-乙基己基）鄰苯二甲酸鹽和單（2-乙基己基）鄰苯二甲酸鹽以及多溴二苯醚的來源[18-19]。為了控制血清白蛋白所帶來的代謝廢物及其他未知有害物質(zhì)，既要控制其含量確保有效性，又要跟蹤其有害降解產(chǎn)物的變化來保證安全性。為了降低由此所帶來的風(fēng)險，重組人白蛋白被用作有效替代品，其臨床有效性也得以證實[20]。

為了評估輔助生殖培養(yǎng)液的總體風(fēng)險，還有必要對產(chǎn)品進行臨床前測試。除了需要對于這些特殊組分及其降解產(chǎn)物的含量變化趨勢進行測試外，還應(yīng)對其生物相容性進行評估，來確保產(chǎn)品的安全性。

3 人類輔助生殖培養(yǎng)液中添加藥物的質(zhì)量控制

人類輔助生殖培養(yǎng)液中需要根據(jù)其功能性加入一些輔助藥物，如抗生素等，這些藥物的存在也會存在相應(yīng)的風(fēng)險。需要對這些成分的質(zhì)量、安全性和有效性進行驗證。

細菌污染可以對胚胎的生長發(fā)育造成嚴重影響。細菌快速生長繁殖，既消耗了培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，又釋放大量對胚胎有毒性的代謝物。大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌在繁殖或死亡時還釋放內(nèi)毒素，對胚胎具有細胞毒性作用。而在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目股厝鐟c大霉素可以有效地抑制細菌生長，保證胚胎正常發(fā)育[21]。但抗生素的引入，也可能會存在一定的副作用。氨基糖苷類抗生素在醫(yī)用領(lǐng)域有著不可替代的作用，但其使用上因毒性和耐藥性也受到一定限制。在臨床上氨基糖苷類抗生素是濃度依賴型抗菌藥物，嚴格控制其劑量非常重要[22]。而對于輔助生殖培養(yǎng)液更應(yīng)重視，因為抗生素的存在可能會對胎兒產(chǎn)生風(fēng)險。需要對培養(yǎng)液中的抗生素進行質(zhì)量控制，降低其產(chǎn)生的風(fēng)險。

在培養(yǎng)液中也會根據(jù)其用途加入相應(yīng)的激素和生長因子，這對于維持培養(yǎng)液的功能，保證細胞的生長狀態(tài)等具有重要的作用。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如適宜的胰島素含量可以促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。

雌二醇（E2）作為一種類固醇激素，能夠促進卵泡等雌性生殖器官發(fā)育。促黃體生成素（luteinizing hormone,LH）是一種糖蛋白類促性腺激素，對卵子最后的成熟是必須的。成熟卵子的排出與LH峰的出現(xiàn)相關(guān)，培養(yǎng)液中LH的存在加速卵母細胞的成熟，隨著LH濃度的增高，這種作用越大，同時卵子老化的速度也越快。因此，高LH濃度組中培養(yǎng)48 h的成熟卵子，其受精能力極顯著地低于其他組，也極顯著地低于相同培養(yǎng)條件下24 h組，培養(yǎng)液中LH含量對培養(yǎng)較長時間的成熟裸卵的體外受精率有極顯著的不利影響[23]，故需嚴格控制其含量。

胰島素生長因子[24]（insulin like growth factor，IGF）通過與特異性的靶細胞表面受體IGF-IR結(jié)合，能夠促進顆粒細胞增殖并維持芳香化酶的功能，從而提高了雌激素的合成，并且促進了卵泡進一步發(fā)育；而隨著雌激素的增多，卵泡對激素的敏感性增強，最終達到了促使卵泡迅速生長的效果[5]。表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）通過自分泌和旁分泌的形式調(diào)節(jié)早期胚胎的發(fā)育。在胚胎培養(yǎng)液中加入適當(dāng)濃度的EGF改善體外受精-胚胎移植的培養(yǎng)環(huán)境，將胚胎培養(yǎng)到更合適的階段再移入子宮，就可能提高其成功率[25]。

現(xiàn)在國內(nèi)已經(jīng)有一系列的人類輔助生殖技術(shù)產(chǎn)品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。很多國家監(jiān)管部門也出臺了相關(guān)的文件，如中國國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械審評中心發(fā)布了《人類體外輔助生殖技術(shù)用液注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[26]，歐盟發(fā)布了《Guidelines for Conformity Assessment ofin VitroFertilisation (IVF) and Assisted Reproduction Technologies (ART) Products》[27]。但目前尚未有質(zhì)量技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)對成分含量的指標(biāo)進行明確要求。對于輔助生殖培養(yǎng)液中其他有效成分以及有害降解產(chǎn)物、有關(guān)藥物等成分含量檢驗方法的建立，并建立相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。確保在產(chǎn)品貨架期內(nèi)的安全性和有效性，對輔助生殖培養(yǎng)液進行有效的質(zhì)量控制，才能進而提高輔助生殖技術(shù)的安全性和成功率。