白簕粗多糖的脫色純化及其產物降糖活性研究

何冠成，張旭紅，周露，程軒軒，潘育方，楊慧文

（廣東藥科大學藥學院，廣東廣州510006）

白簕粗多糖的脫色純化及其產物降糖活性研究

何冠成，張旭紅，周露，程軒軒，潘育方，楊慧文

（廣東藥科大學藥學院，廣東廣州510006）

【目的】探討白簕粗多糖的最優(yōu)脫色工藝條件參數(shù)，并考察脫色后多糖的降糖活性?！痉椒ā恳远嗵潜Ａ袈?、脫色率為指標，比較AB-8、D-101、DM-301、HPD-600型大孔樹脂和聚酰胺樹脂的脫色效果，通過單因素考察與正交實驗優(yōu)化靜態(tài)吸附脫色條件；并通過鏈脲霉素（STZ）誘導糖尿病小鼠模型考察脫色后多糖的降糖藥理活性?！窘Y果】HPD-600大孔樹脂的脫色效果最好，其最佳脫色條件為：多糖溶液pH=4.0，液固比為30∶1（mL/g），20℃時慢速振搖吸附4 h。最佳條件下，粗多糖的脫色率為（80.09±1.06）%，多糖保留率為（87.90±2.04）%。降糖藥理實驗結果表明，脫色后白簕多糖對STZ誘導的糖尿病小鼠具有降血糖作用，多糖高劑量組小鼠的血糖抑制率達43.04%?！窘Y論】該脫色工藝穩(wěn)定可靠，適用于白簕粗多糖的脫色純化，且脫色后多糖有一定的降血糖功效。

白簕/生產和工藝；粗多糖/分析；大孔樹脂；脫色；糖尿病/中藥療法；疾病模型，動物；小鼠

白簕Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.，又稱三加皮、刺三加，為五加科植物，廣泛分布于長江以南地區(qū)，廣東地區(qū)資源豐富。白簕味苦而甘辛涼，作為民間草藥和野蔬有著悠久的歷史，具有清熱解毒、祛風利濕、舒筋活血、止咳平喘之功效[1]。白簕的化學成分有黃酮、三萜皂苷、色素、多糖等，近年來關于白簕中皂苷、黃酮、色素的提取和理化性質研究常有報道[2-7]，但鮮有關于多糖的純化及藥理鑒定研究的報道。研究顯示，植物多糖具有抗腫瘤、增強免疫、抗衰老、抗病毒等作用[8]，而白簕中含有豐富的多糖。本實驗室的前期研究已發(fā)現(xiàn)白簕粗多糖具有抗炎鎮(zhèn)痛[9]、抗疲勞[9]、降血糖[10]功效，若要得到作用效果更明確的多糖，尚須進行粗多糖深加工。粗多糖含有色素，顏色較深，脫色是多糖提取純化過程中一個十分重要的環(huán)節(jié)[11]。本課題組就本實驗室制備的棕褐色固體粗多糖進行脫色研究，探討其最優(yōu)脫色工藝條件參數(shù)，并考察脫色后多糖的降糖活性，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物與試劑白簕莖經廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為五加屬植物白簕Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.的莖，標本保存于廣東藥科大學中藥學院標本室及恩平響山簕菜茶廠；AB-8、D-101、DM-301、HPD-600型大孔樹脂，聚酰胺樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；生理鹽水（500 mL，廣東艾希德藥業(yè)有限公司，批號：H15010106）；鏈脲佐菌素（STZ，上海晶純生化科技股份有限公司，批號45543）；二甲雙胍（石家莊市普力制藥有限公司，批號：1404031004）；檸檬酸、檸檬酸三鈉為分析純，購自天津福晨化學試劑廠；苯酚、體積分數(shù)為95%的乙醇、雙氧水、硫酸、鹽酸（HCl）及氫氧化鈉（NaOH）均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器FA1004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；KQ5200型超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限責任公司）；XW-80A型微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；HY-2型調速多用振蕩器（常州金壇金城教學儀器廠）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市澳華儀器有限公司）；LD4-2A型臺式離心機（北京京立離心機有限公司）；BGZ-30型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；721型紫外分光光度計（上海精密儀器有限公司）；安穩(wěn)型血糖儀（三諾生物傳感技術有限公司）。

1.3 實驗動物雄性KM小鼠60只，體質量（20±2）g，SPF級，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（粵）2013-0020。

1.4 白簕粗多糖的制備白簕粗多糖按照文獻[9]的方法進行制備富集。

1.5 樹脂的預處理及再生預處理：AB-8、D-101、DM-301及HPD-600型大孔樹脂，聚酰胺樹脂→體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡過夜→去離子水清洗至無醇味。再生：樹脂→50 g/L NaOH浸泡攪拌4 h→大量清水沖洗至接近中性→50 g/L HCl浸泡攪拌4 h→大量清水沖洗至接近中性→體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡12 h→大量清水沖洗至無醇味。

1.6 白簕粗多糖脫色工藝優(yōu)化

1.6.1 多糖保留率的測定按照苯酚—硫酸法[12]測定脫色前后的白簕多糖溶液多糖含量，按照以下公式計算多糖保留率[12]：p多糖保留率（%）=m脫色后多糖含量÷m脫色前多糖含量×100%。

1.6.2 多糖脫色率的測定對脫色前后的多糖溶液進行200～800 nm范圍的全波長掃描，結果表明溶液無最大吸收波長。參考文獻[13]并利用互補色原理，確定以λ=450 nm為吸收波長，測定多糖溶液脫色前后的吸光度（D），并按照以下公式計算脫色率[12]：p脫色率（%）=（D脫色前-D脫色后）÷D脫色前× 100%。其中，D脫色前和D脫色后分別為脫色前后多糖溶液的吸光度。

1.6.3 樹脂材料的篩選配制濃度為4 mg/mL的粗多糖溶液，量取該溶液35 mL和50 mL，加入4種型號大孔樹脂和聚酰胺樹脂各1 g，考察在2種不同溶液體積條件下不同樹脂的脫色效果；在室溫下振搖吸附10 h后取濾液，測定脫色率與多糖保留率，并根據(jù)這兩個指標對不同樹脂進行評價。

1.6.4 HPD-600大孔樹脂脫色法單因素實驗以脫色率和多糖保留率為指標，對HPD-600大孔樹脂脫色法的各個影響因素進行考察，方法如下：

1.6.4.1 考察液固比（V∶m）對脫色效果的影響固定HPD-600樹脂用量為1 g，分別加入20、30、40、50、60 mL濃度為4 mg/mL的粗多糖溶液，室溫下振搖吸附10 h后，抽濾、取濾液，測定脫色率與多糖保留率，考察不同液固比對脫色效果的影響。

1.6.4.2 考察pH值對脫色效果的影響固定HPD-600樹脂用量為1 g，加入4 mg/mL粗多糖溶液30 mL，分別調整溶液pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，室溫下振搖吸附10 h后，抽濾、取濾液，測定脫色率與多糖保留率，考察不同pH值對脫色效果的影響。

1.6.4.3 考察溫度對脫色效果的影響固定HPD-600樹脂用量為1 g，加入4 mg/mL粗多糖溶液30 mL，將pH值調整至4.0，分別在20、30、40、50、60℃時振搖吸附10 h后，抽濾、取濾液，測定脫色率與多糖保留率，考察不同溫度對脫色效果的影響。

1.6.4.4 考察吸附時間對脫色效果的影響固定HPD-600樹脂用量為1 g，加入4 mg/mL的粗多糖溶液30 mL，將pH值調整至4.0，30℃時振搖吸附，分別于第30、60、90、120、180、240、270、300、330及360 min時取少許上清液，抽濾后測定濾液吸光度，計算其脫色率，每組平行測定3次，考察不同吸附時間對脫色效果的影響。

1.6.5 正交實驗設計利用L9（34）正交設計表設計正交實驗，以多糖保留率和脫色率作為指標，綜合考察脫色時間、脫色溫度、脫色pH值以及液固比等4個因素對脫色效果的影響。采用加權評分法[14]對兩項指標進行綜合評分，把各項數(shù)值與該列最大值相除，再乘以100%得到該項得分；確定兩項指標的權重系數(shù)：色素脫除率（X）權重系數(shù)為0.6、多糖保留率（Y）權重系數(shù)為0.4，對色素脫除率、多糖保留率兩項指標進行加權求和，綜合評分Z=0.6X+0.4Y，評分高者為最優(yōu)工藝。篩選最優(yōu)工藝實驗因素及水平設計見表1，并對最優(yōu)工藝進行重復性考察。

表1 正交試驗因素與水平表Table 1Factors and levels of orthogonal test

1.7 白簕多糖對糖尿病小鼠降血糖效果

按照最優(yōu)脫色工藝制備多糖樣品，考察脫色后多糖的降糖效果。

1.7.1 糖尿病小鼠模型50只（20±2）g健康昆明（KM）小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，禁食不禁水12 h，腹腔注射150 mg/kg STZ，72 h后測定造模小鼠空腹血糖，以血糖濃度高于11.1 mmol/L為標準，選取造模成功的小鼠進行降糖實驗[15]。

1.7.2 實驗分組將10只未造模的正常小鼠作為正常對照組；對已造模成功的高血糖小鼠進行隨機分組：模型組、二甲雙胍組、白簕多糖低劑量組及白簕多糖高劑量組，每組10只，用苦味酸進行編號標記。其中多糖低、高劑量組分別給予小鼠灌胃100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1脫色后多糖，二甲雙胍組給予小鼠灌胃125 mg·kg-1·d-1二甲雙胍，正常對照組及模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。于灌胃最后1 d禁食12 h測定空腹血糖及體質量，分析脫色后的白簕多糖對STZ誘導糖尿病小鼠的降糖效果。

1.8 統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，實驗結果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樹脂材料的篩選將4種大孔樹脂和聚酰胺樹脂材料按照1.6.3項方法進行白簕粗多糖溶液的脫色處理，計算脫色后的多糖保留率和脫色率。表2結果顯示，在實驗條件下，HPD-600大孔樹脂與其他樹脂材料比較具有較優(yōu)的多糖保留率與脫色率。因此，我們選用HPD-600大孔樹脂作為脫色劑進行脫色工藝的優(yōu)化。

表2 不同大孔樹脂脫色結果Table 2Comparison of decoloration results of various macroporous resinsp/%

2.2 單因素實驗考察結果

2.2.1 不同液固比考察結果固定其他脫色條件，分別加入20、30、40、50、60 mL多糖溶液，測定計算多糖保留率和脫色率，結果見圖1。由圖中數(shù)據(jù)可知，隨著液固比增加，脫色率持續(xù)下降，其主要原因可能是大孔樹脂的吸附以物理吸附為主，存在吸附飽和的現(xiàn)象，而溶液用量越多，越易達到飽和，因此吸附脫色效果就越差；相反，多糖保留率隨液固比增加而逐漸上升。綜合考慮多糖保留率與脫色率，選擇液固比為30∶1，該比例有利于后期濃縮。

圖1 不同液固比對脫色效果的影響Figure 1 Effect of ratios of liquid to solid on decoloration results

2.2.2 脫色pH值考察結果固定其他脫色條件，將多糖溶液pH值分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，測定多糖保留率和脫色率，結果見圖2。結果表明，隨著pH值增大，多糖脫色率明顯下降，多糖保留率開始略有上升，隨后即下降，綜合考慮選擇pH=4.0最優(yōu)。

2.2.3 脫色溫度考察結果固定其他脫色條件，考察脫色溫度分別為20、30、40、50、60℃時的多糖保留率與脫色率，結果見圖3。圖3表明，隨著溫度升高，脫色率有所下降，且溫度在40℃以上時，脫色率下降明顯，其原因可能為溫度過高時，色素的吸附也加快，導致脫色率下降[16]。根據(jù)結果綜合考慮，選擇30℃為最優(yōu)吸附溫度。

圖2 不同pH值對脫色效果的影響Figure 2Effect of pH values on decoloration results

圖3 不同溫度對脫色效果的影響Figure 3Effect of temperatures on decoloration results

圖4 不同脫色時間對脫色效果的影響Figure 4Effect of decoloration time on decoloration results

2.2.4 脫色時間考察結果固定其他脫色條件，考察脫色時間分別為30、60、90、120、180、240、270、300、330及360 min的脫色率，結果見圖4。圖4表明，隨著時間的延長，脫色率逐漸增加，當吸附時間達到300 min時，脫色率基本不變，吸附基本趨于穩(wěn)定，達到飽和。為了節(jié)約成本和資源，最終選擇5 h作為吸附時間。

2.3 正交實驗按1.6.5正交實驗方案進行實驗，實驗結果如表3、4所示。從表3的極差結果可得出各因素對實驗結果影響的主次順序：溶液pH值＞液固比＞反應溫度＞反應時間；表4的方差分析結果顯示，脫色溶液的pH值與液固比對實驗結果有顯著影響（P＜0.05），時間和溫度影響則不顯著（P＞0.05），從經濟效益的角度出發(fā)，選擇其最短時間和最低溫度。因此，最優(yōu)組合為A1B1C1D1，最優(yōu)工藝即為：30 mL多糖溶液中加入1 g HPD-600大孔樹脂，調整pH值為4.0，在20℃時振搖吸附4 h。

表3 L9（34）正交試驗結果表Table 3L9（34）orthogonal test

表4 正交優(yōu)化大孔樹脂脫色效果工藝方差分析表Table 4Variation analysis for the decoloration results of various macroporous resins optimized by orthogonal test

2.4 工藝驗證按照正交結果最優(yōu)方案，稱取HPD-600大孔樹脂1 g，加入4 mg/mL多糖溶液30 mL，調整pH值為4.0，20℃吸附4 h后抽濾，收集濾液，測定脫色率和多糖保留率，做5次重復驗證實驗，結果脫色率為（80.09±1.06）%，多糖保留率為（87.90±2.04）%，實驗結果穩(wěn)定。

2.5 藥理實驗結果

2.5.1 小鼠一般狀況與體質量造模成功的糖尿病小鼠有明顯的“三多一少”癥狀，給藥14 d后，二甲雙胍組和白簕多糖各劑量組的“三多”癥狀均有所減輕。分別記錄給藥前后小鼠的體質量，進行比較分析，結果見圖5。圖5結果顯示，與給藥前比較，正常對照組小鼠體質量明顯增加，模型組與各治療組小鼠體質量基本維持不變（P＞0.05），表明在實驗時間內治療藥物對體質量影響不大。

圖5 各組小鼠體質量變化Figure 5Comparison of mice body mass in various groups

2.5.2 對小鼠血糖影響各組小鼠給藥前后空腹血糖（FBG）測定結果見表5。表5結果顯示：STZ造模后，小鼠血糖顯著升高，實驗期間模型組小鼠FBG穩(wěn)定，證明該模型較為可靠。給藥14 d后，各給藥組小鼠FBG均顯著降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與給藥前FBG比較，各劑量白簕多糖均可顯著降低小鼠FBG（P＜0.05或P＜0.01）；給藥14 d后，高劑量組的血糖抑制率達43.04%。

表5 各組小鼠血糖測定結果Table 5Comparison of mice blood glucose levels in various groups

3 討論

多糖是一類重要的分子量較大的生物活性物質[17]，黏度較大且水溶性較小，純化的天然多糖一般為白色，但由于多糖的來源不同以及提取方法的缺陷，再加上來源植物組織成分的復雜性，提取得到的往往是含有一些色素雜質的粗多糖，呈棕褐色，這對多糖的定性定量分析等均存在較大影響；另外，有些粗多糖的有色小分子物質可能會發(fā)生轉化，對后續(xù)測定結果進一步產生影響。因此，本課題組著眼于大孔樹脂法對白簕多糖中色素的脫除工藝研究，并優(yōu)化該工藝條件。

目前，去除粗多糖中的色素主要采用大孔樹脂吸附法、活性炭吸附法及雙氧水氧化脫色等方法[18]。前期預實驗比較了后2種脫色法，結果發(fā)現(xiàn)：采用活性炭法脫色存在活性炭粉難以除盡的問題，對實驗結果影響較大；采用雙氧水氧化法進行脫色，雖然脫色率較高，但是多糖保留率偏低，可能是由于雙氧水有較強的氧化性，大量多糖被破壞所致，故本課題組未采用這兩種常用的脫色法。我們對5種不同樹脂材料的脫色效果進行考察，發(fā)現(xiàn)HPD-600大孔樹脂脫色效果較好，該法脫色率高且多糖損失較少，是較理想的白簕多糖色素脫色方法。通過正交試驗優(yōu)化HPD-600大孔樹脂靜態(tài)脫色工藝，最佳工藝條件為30 mL多糖溶液中加入1 g HPD-600大孔樹脂，調整pH值為4.0，在20℃振搖吸附4 h。并對該條件下脫色得到的白簕多糖進行了降糖活性研究。通過建立STZ誘導糖尿病小鼠模型，測定給藥前后小鼠FBG的變化，結果顯示與模型組比較，各白簕多糖劑量組小鼠FBG均明顯降低，F(xiàn)BG抑制率達40%左右，提示脫色后白簕多糖具有較好的降糖活性。本研究已確定白簕粗多糖最優(yōu)脫色工藝參數(shù)，并驗證了脫色后多糖的降糖活性。在本實驗結果的基礎上，今后可進一步開展對白簕多糖活性部位的探討及其降糖作用機制的研究。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，1978：12-113.

［2］高俠，黎云祥，蔡凌云，等.大孔吸附樹脂對白簕葉總皂苷的純化工藝研究［J］.中藥材，2009，32（5）：780.

［3］高俠，黎云祥，蔡凌云.白簕葉總皂苷提取工藝和含量測定研究［J］.光譜實驗室，2009，26（4）：814.

［4］申林，駱磊，肖華華，等.白簕果實中總黃酮的測定［J］.光譜實驗室，2013，30（2）：609.

［5］肖杭，黎云祥，蔡凌云，等.白簕葉總黃酮的提取和純化及其抑菌試驗初探［J］.光譜實驗室，2010，27（6）：2130.

［6］肖杭，黎云祥，蔡凌云.白簕葉總黃酮的體外抗氧化活性研究［J］.西華師范大學學報（自然科學版），2011，32（2）：156.

［7］何可群，李相興.白簕果色素提取及其性質研究［J］.江蘇調味副食品，2013（4）：13.

［8］邱琳，辛現(xiàn)良，耿美玉，等.多糖構效關系研究進展［J］.現(xiàn)代醫(yī)學生物研究進展，2009，9（9）：1764.

［9］楊慧文，張旭紅，陳婉琪，等.白簕莖多糖對大、小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛及抗疲勞作用研究［J］.中國藥房，2015，26（31）：4364.

［10］潘育方，楊慧文，劉莉.白簕多糖在制備治療糖尿病藥物中的應用［P］，2014.07.16，中國，ZL 2013.1.0035607.9

［11］付學鵬，楊曉杰.植物多糖脫色技術的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，128（11）：166.

［12］李元元，李鑫，廉宜君，等.沙棗多糖脫色材料及脫色條件的優(yōu)選［J］.食品開發(fā)，2012，37（3）：210.

［13］羅璽，唐慶九，張勁松，等.靈芝多糖樹脂法脫色工藝優(yōu)化［J］.食品科學，2011，32（16）：5.

［14］李倩，田春芳，劉雯霞，等.超聲波復合酶法提取軟紫草多糖的工藝優(yōu)化［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2012，29（6）：498.

［15］鄧航，賀敏，李江，等.柿葉多糖對糖尿病小鼠降血糖作用及其機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（4）：114.

［16］孔凡利，張名位，鄺瑞彬，等.大孔吸附樹脂對荔枝粗多糖的脫色條件研究［J］.食品科技，2012，37（5）：179.

［17］高續(xù)春.多糖提取純化方法研究進展［J］.榆林學院學報，2009，19（4）：65.

［18］吳君，劉波，梁偉玲，等.大孔樹脂對蛹蟲草粗多糖的脫色工藝研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2015，32（4）：739.

【責任編輯：黃玲，侯麗穎】

Decoloration and Purification of Crude Polysaccharides from Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.and Hypoglycemic Activities of Its Products

HE Guancheng，ZHANG Xuhong，ZHOU Lu，CHENG Xuanxuan，PAN Yufang，YANG Huiwen
（School ofPharmacy，GuangdongPharmaceutical University，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the optimum decoloration technological conditions of crude polysaccharides from A canthopanan trifoliatus（L.）Merr.and hypoglycemic activities of its products.MethodsWith the decolorization rate and retention rate as indexes，we compared the decoloration results among AB-8，D-101，DM-301，HPD-600 macroporous resins and polyamide resin.And then we optimized the static absorption and decolorationprocedure by single-factor investigation and orthogonal test.In addition，we applied the streptozotocin-induced hyperglycemia mice to study the hypoglycemic activities of the decolored crude polysaccharides.ResultsHPD-600 macroporous resin was chosen as the optimal resin.The optimum decoloration technological conditions were as follows：Polysaccharide solution pH value was 4.0；Ratio of liquid to solid was 30∶1（mL/g）；Shaking slowly and adsorbing lasted for 4 hours at 20℃.Under the optimal conditions，decolorization rate and retention rate were（80.09±1.06）%and（87.90±2.04）%respectively.The results of the pharmacological experiment showed that decolorized polysaccharides from Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.were able to lower the blood glucose of hyperglycemia mice induced by streptozotocin.The blood glucose inhibition ratio reached to 43.04%in the group of high-dose polysaccharide.ConclusionThe bleaching process is stable and feasible，and can be used for the purification of crude polysaccharides from Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr..And the crude polysaccharides after decoloration can lower blood glucose in our experitment.

Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr./production＆preparation；crude polysaccharides/analysis；macroporous resin；decoloration；diabetes mellitus/TCD therapy；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）06-0840-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.06.020

2016-03-08

何冠成（1993-），男，本科生；E-mail：howardhe1017@163.com

楊慧文（1983-），女，高級實驗師；E-mail：halley_yang@hotmail.com

廣東省建設中醫(yī)藥強省科研課題（編號：20151267，粵中醫(yī)[2015]11號）；廣東藥科大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃—創(chuàng)新訓練項目（編號：201510573044）