產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106益生特性的研究

賴玉健，陳素梅，羅珮桓，黎 攀，杜 冰*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

乳酸作為世界公認(rèn)三大有機酸之一，在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)上都有著十分廣泛的應(yīng)用，也是生物體機體代謝的重要中間產(chǎn)物，具有重要的生理功效[1-2]。菌株DU-106是一株從內(nèi)蒙古發(fā)酵酸奶中分離出來新菌種，經(jīng)過鑒定屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）[3]，是蠟樣芽孢桿菌種的一個亞種，具有抗逆性強、耐高溫、耐酸、易儲存等芽孢桿菌所具備的獨特性，同時又具有乳酸菌中產(chǎn)生乳酸的特性，在培養(yǎng)基發(fā)酵過程中能產(chǎn)生6.3 g/kg的乳酸，具備較大的潛在應(yīng)用價值。在前期的應(yīng)用研究中，發(fā)現(xiàn)菌株DU-106具有良好的發(fā)酵特性，目前已經(jīng)應(yīng)用在果酒[4-5]、飲料[6]、中草藥[7-8]的在的發(fā)酵上。同時，在對其生理活性的研究中，發(fā)現(xiàn)其在降血脂、抗腹瀉方面有良好的效果，在提高免疫力方面也表現(xiàn)優(yōu)異。本研究以產(chǎn)乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106為研究對象，探討其是否具備益生菌在體內(nèi)存活的能力，并與凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BC30及鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）R11耐受性進(jìn)行比較，對乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106的深層次開發(fā)利用頗為重要，不僅可以提高其功能在生產(chǎn)應(yīng)用中發(fā)揮的效能，還便于開發(fā)出新的用途。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106：本實驗室保藏菌種；凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BC30：美國杜邦公司；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）R11：法國拉曼公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：上海哈靈生物科技有限公司；人工胃液、人工腸液：北京雷根生物技術(shù)有限公司；豬膽鹽（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他均為廣州化學(xué)分析廠分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，硫酸鎂1 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸錳10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25型pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150B微機生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計：廣州滬瑞明儀器有限公司；Agilent 6890N高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株DU-106生長曲線及產(chǎn)酸曲線的繪制

將菌株DU-106接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，最終接種量為107個/mL，在37 ℃、120 r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，得到菌株DU-106發(fā)酵液，隔4 h測一次吸光度值（OD600nm值）、pH和總酸[9]，分別繪制菌株DU-106的生長曲線及產(chǎn)酸曲線。

1.3.2 分析檢測

（1）總酸的測定

取發(fā)酵液樣品4 mL，加入1%的酚酞2～3滴，用濃度為0.100 mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定至出現(xiàn)顏色變化，并保持顏色不變色30 s，記錄氫氧化鈉滴定量，再用公式算出總酸的量[10]?？偹嵊嬎愎饺缦拢?/p>

式中：x為總酸含量，mg/mL；C為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V1為滴定NaOH的體積，mL；V2為滴定空白的體積，mL；m為取的菌液的體積，mL；0.09為乳酸換算系數(shù)。

（2）菌株存活率

取不同時間的發(fā)酵培養(yǎng)基樣品1 mL加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h后，用平板計數(shù)法測數(shù)菌落數(shù)，并記錄。菌株存活率計算公式如下：

式中：N0為0 h活菌數(shù)，CFU/mL；Nt為t（t=1.0或3.0）h活菌數(shù)，CFU/mL。

（3）有機酸測定

取37 ℃、120 r/min的搖床中發(fā)酵24 h后的DU-106發(fā)酵液，3 600 r/min離心10 min，取上清液，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其有機酸含量。HPLC色譜條件：色譜柱：AtlantisRR T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相為甲醇，B相為KH2PO4，用磷酸調(diào)pH至2.7；流速為1 mL/min，檢測器為光電二極管陣列檢測器；檢測波長為210 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.3 菌株DU-106生長耐受性試驗

（1）膽鹽的耐受性

以5%接種量接種至含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、0.6%、0.9%豬膽鹽的培養(yǎng)基中，以不加豬膽鹽的培養(yǎng)基為空白對照，在37 ℃、120 r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)4 h，用平板計數(shù)法測定菌落總數(shù)。

（2）模擬液的耐受性

在培養(yǎng)基中添加適量模擬胃液，分別接入菌株DU-106、BC30、R11，在37 ℃、120 r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)4 h后，取5 mL樣品接入腸液中，以不加模擬液的培養(yǎng)基為空白對照，培養(yǎng)24 h后，測定菌落總數(shù)。

（3）pH耐受性

以5%接種量將菌株DU-106、BC30、R11菌種分別加入pH值為2、3、4、5的培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 h、3 h后，分別測定菌落總數(shù)。

1.3.4 菌株DU-106抗生素敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法[11]，在96孔板里，1～10孔抗菌藥物青霉素G、慶大霉素、克林霉素、頭孢曲松、加替沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、四環(huán)素、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢吡肟、利福平、紅霉素、氯霉素、諾氟沙星、甲氧氨芐嘧啶/磺胺甲基異惡唑、頭孢噻肟、亞胺培南、萬古霉素、磷霉素、硫酸卡那霉素、氨芐西林、蔡啶酮酸等24種，2倍稀釋，第11孔加菌不加藥作為生長對照，第12孔兩者都不加作為空白對照。每種抗菌藥物做兩個重復(fù)。將用直接菌懸液法制備濃度為0.5麥?zhǔn)希ㄏ喈?dāng)于1.5×108CFU/mL）的菌懸液，經(jīng)MH肉湯（Mueller-Hinton Broth）培養(yǎng)基1∶20稀釋后加入1～11孔。密封后置35 ℃生化培養(yǎng)箱中，孵育48 h判斷結(jié)果。第1孔至第10孔藥物質(zhì)量濃度分別為128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS version 22.0進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DU-106的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

2.1.1 菌株DU-106的生長曲線

由圖1可知，菌株DU-106的OD600nm值隨發(fā)酵時間增加呈逐步上升的趨勢，OD600nm值由0增加至2左右。發(fā)酵時間為0～12 h，OD600nm值幾乎沒有增加，這是由于菌株剛剛接種到培養(yǎng)基中，正在緩慢適應(yīng)生長環(huán)境，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)來生長繁殖，這是菌株DU-106的生長遲緩期。發(fā)酵時間為12～36 h，OD600nm值急劇增加，這是由于菌株DU-106逐漸適應(yīng)環(huán)境，經(jīng)歷指數(shù)增長階段，不斷地生長繁殖，這是菌株DU-106的對數(shù)生長期。發(fā)酵時間為36～48 h，OD600nm值增加相對緩慢，最后趨于穩(wěn)定，這是因為菌株DU-106菌落數(shù)前期急劇增加，對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、有害代謝產(chǎn)物積累[12]、pH值等條件不適宜，這是菌株DU-106的穩(wěn)定期。發(fā)酵時間為48 h后，菌株DU-106生長不再增加，開始進(jìn)入衰亡期。綜上所述，菌株DU-106在0～12 h處于生長遲緩期，12～36 h處于對數(shù)生長期，36～48 h處于穩(wěn)定期，48～60 h處于衰亡期。

圖1 菌株DU-106的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain DU-106

2.1.2 菌株DU-106的產(chǎn)酸曲線

菌株DU-106屬于產(chǎn)乳酸芽孢桿菌，在適宜的生長條件下，能夠產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致培養(yǎng)液pH降低和總酸升高，因此，可以通過pH和總酸的變化了解菌株DU-106的產(chǎn)酸情況[13]。

圖2 菌株DU-106的產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid production curve of strain DU-106

由圖2可知，總酸含量表現(xiàn)出先增加后平穩(wěn)的趨勢，進(jìn)過36 h發(fā)酵，總酸由0增加至1.7 g/L；pH測定表現(xiàn)出先增加后降低再趨向平穩(wěn)的趨勢，pH由6.20上升至6.50，再降低至5.00并保持。0～8 h，總酸增加緩慢，pH值先上升，可能是因為菌株DU-106剛剛接種到MRS培養(yǎng)基中，其代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境，同時要合成酶、輔酶、其他代謝中間代謝產(chǎn)物等[14]，因此，0～8 h是DU-106的遲緩期。8～24 h，總酸急劇增加，pH急劇降低，可能是因為DU-106逐漸適應(yīng)環(huán)境，從環(huán)境中獲得營養(yǎng)物質(zhì)，不斷地生長繁殖，以及大量產(chǎn)酸。因此，8～24 h是菌株DU-106的對數(shù)生長期。24～36 h時總酸繼續(xù)增加，但是增加的趨勢較為緩慢，pH值變化相對緩和，可能進(jìn)入菌群生長穩(wěn)定期，但是由于生長空間有限，營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗、有害代謝產(chǎn)物積累、pH值等理化條件不適宜，導(dǎo)致菌落之間進(jìn)行競爭式生長，不斷有新菌產(chǎn)生，也有舊菌凋亡的階段[15]。36 h后pH和總酸變化不大，表明菌落進(jìn)入生長穩(wěn)定期。

2.2 菌株DU-106生長耐受性

2.2.1 膽鹽耐受性

圖3 三組菌株經(jīng)不同濃度的膽鹽處理后的活菌數(shù)（A）和存活率（B）Fig.3 Viable count (A) and survival rate (B) of three groups of strains treated with different concentrations of bile salt

由圖3A可知，菌株DU-106在經(jīng)過0.3%、0.6%、0.9%濃度的膽鹽處理后，活菌數(shù)分別為8.7×1010CFU/mL、7.0×1010CFU/mL、4.0×1010CFU/mL。由圖3B可知，菌株DU-106在經(jīng)過0.3%、0.6%、0.9%濃度的膽鹽處理后，存活率分別為91.8%、73.9%、42.2%，與空白對照組（9.3×1010CFU/mL）相比，活菌數(shù)和存活率均有所下降，而且隨著膽鹽濃度升高，耐受性顯著降低，0.3%膽鹽濃度下存活率能超過90%，而在0.9%膽鹽濃度下存活率僅有42.2%。同時，對比菌株R11在經(jīng)過0.3%、0.6%、0.9%濃度的膽鹽處理后，活菌數(shù)分別為8.5×1010CFU/mL、7.0×1010CFU/mL、未檢出，存活率分別為91.8%、73.9%、0，與空白對照組（9.0×1010CFU/mL）相比，活菌數(shù)和存活率均有所下降，特別明顯的是，菌株R11對0.9%濃度的膽鹽不能耐受。而對于凝結(jié)芽孢桿菌BC30來說，經(jīng)過0.3%、0.6%、0.9%濃度的膽鹽處理后，活菌數(shù)分別為9.2×1010CFU/mL、7.9×1010CFU/mL、5.7×1010CFU/mL，存活率分別為98.9%、84.9%、61.3%，與空白對照組（9.3×1010CFU/mL）相比，在0.3%濃度的膽鹽下活菌數(shù)和存活率幾乎沒有變化，而在0.6%和0.9%濃度下則降低，而且隨著膽鹽濃度升高，耐受性顯著降低。眾所周知，芽孢桿菌的抗逆性是比較好的，所以菌株BC30對0.3%濃度的膽鹽的耐受性也是最好的，存活率達(dá)到98.9%。而菌株DU-106組在0.3%濃度下也能保持90%以上的存活率，說明菌株DU-106對0.3%濃度的膽鹽具有良好的耐受性。

2.2.2 模擬胃腸液耐受性

經(jīng)過4 h模擬胃液和腸液處理后，菌株DU-106和其他兩株對比菌種的活菌數(shù)和存活率見圖4。

圖4 三組菌株經(jīng)模擬胃液和腸液處理后的活菌數(shù)（A）和存活率（B）Fig.4 Viable count (A) and survival rate (B) of three groups of strains treated with simulated gastric juice and intestinal juice

由圖4A可知，菌株DU-106、R11、BC30在經(jīng)胃液處理4 h之后，活菌數(shù)均降低，分別由9 CFU/mL降至5.97×1010CFU/mL、4.65×1010CFU/mL、6.07×1010CFU/mL，其中，菌株R11降低幅度最大，菌株DU-106和BC30的活菌數(shù)變化不大，均能保持在6×1010CFU/mL左右。再經(jīng)過腸液處理24 h后測得活菌數(shù)有所增加，分別為6.43×1010CFU/mL、6.02×1010CFU/mL、6.23×1010CFU/mL，其中菌株DU-106組經(jīng)腸液處理后的活菌數(shù)要略優(yōu)于其他兩組對比菌株，但都比空白對照組（即MRS培養(yǎng)基組）的活菌數(shù)要低。由圖4B可知，菌株DU-106經(jīng)過胃液和腸液處理后仍然能保持66.5%和71.7%的存活率，菌株R11經(jīng)過胃液和腸液處理后的存活率僅為52.48%和67.95%，菌株BC30進(jìn)過胃液和腸液處理后的存活率也能達(dá)到68.31%和70%。因此，結(jié)果表明菌株DU-106對胃液和腸液具有一定的耐受性，在胃液和腸液中能保持良好的存活率，耐受性和存活率相比對比菌株均優(yōu)異。

2.2.3 酸耐受性

圖5 菌株DU-106經(jīng)過不同pH值處理1 h（A）和3 h（B）后活菌數(shù)Fig.5 Viable count of strain DU-106 treated with different pH for 1 h (A) and 3 h (B)

由圖5可知，菌株經(jīng)過不同pH值的環(huán)境處理對活菌數(shù)的影響不一樣，酸性越強，則存活率越低，酸性越弱，存活率越高。由圖5A可知，經(jīng)過1 h處理，在pH值為2、3、4、5中的活菌數(shù)分別為6.0×1010CFU/mL、8.0×1010CFU/mL、9.9×1010CFU/mL、11.6×1010CFU/mL，而空白對照的活菌數(shù)為10.2×1010CFU/mL，存活率分別為58.8%、78.4%、97.1%和113.7%。由圖5B可知，經(jīng)過3h處理后，在pH值為2、3、4、5中的活菌數(shù)分別為8.7×1010CFU/mL、10.0×1010CFU/mL、11.5×1010CFU/mL、11.7×1010CFU/mL，存活率分別為85.3%、98.0%、112.7%和114.7%。由于在pH值較強的環(huán)境中仍然存活，所以使得菌株DU-106在經(jīng)過1 h和3 h處理后的活菌數(shù)超過空白對照組，存活率超過100%。結(jié)果表明，菌株DU-106在pH值為2的強酸性環(huán)境中仍然能保持58%以上的存活率，說明菌株DU-106對強酸環(huán)境也具有良好的耐受性。

2.2.4 菌株DU-106抗生素敏感性

試驗所用抗菌藥物對菌株DU-106的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）見表1。

表1 抗生素對菌株DU-106的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of antibiotics against strain DU-106

由表1可知，菌株DU106敏感的抗菌藥物有慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、克林霉素、磷霉素、亞胺培南11種。處于中介的抗菌藥物有鏈霉素、硫酸卡那霉素、萘啶酮酸、氯霉素4種。耐藥的抗菌藥物有青霉素G、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、甲氧氨芐嘧啶/磺胺甲基異惡唑9種。菌株DU-106對常用的部分抗生素具有敏感性，在后續(xù)的研發(fā)和服用中，應(yīng)盡量避免與敏感性抗生素共同食用。

2.3 菌株DU-106產(chǎn)有機酸結(jié)果

菌株DU-106代謝產(chǎn)有機酸的HPLC檢測結(jié)果見表2。

表2 菌株DU-106代謝產(chǎn)有機酸種類及含量Table 2 Types and contents of organic acids produced by strain DU-106 metabolism

由表2可知，菌株DU-106代謝產(chǎn)生的有機酸種類有乳酸、草酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸等有機酸。其中，乳酸含量最高，達(dá)6.3 g/kg，其他種類的有機酸含量為草酸0.25～2.7 g/kg。結(jié)果表明，菌株DU-106發(fā)酵過程中能產(chǎn)生較多的乳酸，具備良好的乳酸發(fā)酵特性。

3 討論

菌株DU-106屬于產(chǎn)乳酸芽孢桿菌屬，其特點為能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量的乳酸，因此，培養(yǎng)基中的糖類、無機鹽等成分對其的生長至關(guān)重要。當(dāng)菌株DU-106擁有適宜生長條件之后，其產(chǎn)酸活動隨著菌的生長繁殖也增加，當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被菌株DU-106消耗完畢，以及菌株DU-106的菌數(shù)逐漸增加，菌株DU-106的生長和產(chǎn)酸活動也就減少，乳酸積累接近飽和狀態(tài)，生長進(jìn)入衰亡期[16]。因此，該菌株在發(fā)酵產(chǎn)乳酸時，如果要獲得較高的乳酸產(chǎn)量，需要及時補充營養(yǎng)物質(zhì)。

對于益生菌來說，必須進(jìn)入人體的胃腸道才能發(fā)揮其有益功能，從口腔到人體腸道過程中，人體的胃部是益生菌的必經(jīng)之路[17]，胃液pH的大小由飲食結(jié)構(gòu)不同有所差異，通常在3左右[18]，空腹或食用酸性食物時，胃酸pH可達(dá)1.5。膽鹽是人體內(nèi)一道重要的消化液，對人體消化吸收營養(yǎng)有著重要的作用。然而，益生菌要達(dá)到人體小腸內(nèi)發(fā)揮功效，需要擁有耐受高濃度膽鹽的能力[19]。人體小腸中膽酸鹽含量在0.03%～0.30%范圍內(nèi)波動[20]，而益生菌經(jīng)攝入后，經(jīng)過胃和小腸，最終才能定植。菌株DU106在經(jīng)過模擬胃腸道液和膽鹽處理數(shù)小時后，仍能保持較高的存活率，說明其具備良好的抗逆性，能夠經(jīng)受住人體胃腸道中的強酸性環(huán)境。

4 結(jié)論

本實驗對乳酸芽孢桿菌DU-106的生長性能進(jìn)行探討，通過對其生長曲線、產(chǎn)酸曲線、生長耐受性、抗生素耐受性的研究。結(jié)果顯示，乳酸芽孢桿菌DU-106具備較好的生長能力、產(chǎn)酸能力和生長耐受性，具有潛在益生菌候選菌株的開發(fā)潛力。