青花菜BoSCL3基因的克隆和漬水脅迫下的表達特征分析

裴徐梨, 付雙, 荊贊革,*, 唐征, 林燕, 黃麗

青花菜基因的克隆和漬水脅迫下的表達特征分析

裴徐梨1, 付雙1, 荊贊革1,2*, 唐征2, 林燕1, 黃麗1

(1. 昆明學院農(nóng)學與生命科學學院, 昆明 650214; 2. 溫州科技職業(yè)學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院, 浙江 溫州 325006)

為了解(scarecrow-like 3)基因的功能，從青花菜(var.)中克隆得到1個基因，命名為，其cDNA全長1 355 bp，編碼446個氨基酸。BoSCL3分子量為49.96 kD，為疏水性蛋白，與油菜()、蕪菁()中SCL3蛋白的親緣關系最近，同科植物的SCL3具有較高的同源性。熒光定量PCR分析結果表明，青花菜基因表達量隨漬水脅迫時間延長先下降后上升，推測其可能參與漬水脅迫響應。這為探討青花菜基因響應漬水脅迫的分子機制提供理論依據(jù)。

青花菜；；基因克??；漬水脅迫

基因是植物特有的一類轉錄因子，由、和等3個基因家族成員的特征字母命名而來[1–2]。GRAS家族通常包含SAW、亮氨酸重復序列I (LFRI)、NLS、VHIID和亮氨酸重復序列II (LHRII)、PFYRE和LXX-LL等幾個典型的結構域，可分為SHR、SCL、SCR、RGA、RGL (RGA- like)、GAI和PAT1等8個分支[3]。目前，GRAS轉錄因子已在擬南芥()、水稻(a)、白菜()、蓖麻()、玉米()和番茄()等植物中克隆出來[4–9]。

GRAS家族成員數(shù)量眾多，在植物逆境脅迫應答中發(fā)揮著重要作用。Torres-Galea等的研究表明干旱、鹽、低溫等非生物脅迫可促進擬南芥的表達[1]。李雪燕等報道檉柳()的GRAS轉錄因子啟動子含有多個逆境相關元件，推測其可參與植物的逆境脅迫響應[10]。過表達水稻中的基因和甘藍型油菜中的基因，可提高植株對干旱脅迫的耐受性[11]。

青花菜(var.)為十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬一二年生草本植物。水分是青花菜生長發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子，水分過多會嚴重影響生長，甚至造成整株死亡。因此對青花菜漬水脅迫的響應機理進行研究，對于青花菜生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。

本試驗從青花菜中克隆得到1個基因,對其編碼的BoSCL3蛋白進行生物信息學分析，并采用熒光定量PCR技術檢測基因在漬水脅迫下的表達特性，為揭示青花菜基因響應漬水脅迫的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為青花菜(var.‘WN12-95’)。種子催芽后，播種到營養(yǎng)缽中, 放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。晝夜溫度為25℃/ 18℃, 光照周期為16 h/8 h。待植株長至五葉期時開始漬水脅迫處理，每處理3次重復。分別在處理后0、2和6 d采集葉片，液氮冷凍后置于超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa公司)的操作說明提取青花菜葉片的總RNA?？俁NA質量檢測合格后，使用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)反轉錄合成cDNA第一條鏈。

1.3 基因的克隆

根據(jù)轉錄組unigene庫中青花菜基因設計全長克隆引物，F(xiàn)：5?-TCGCTTTGATATGGTGGTT- ATGT-3?；R：5?-TCATTCACTTCTTGCATCTCCA-3?。PCR反應體系包括1L cDNA，上、下游引物各1L、10Lmixture，7L ddH20。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃復性50 s，72℃延伸1 min，36個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收后進行TA克隆，選取陽性克隆測序。

1.4 生物信息學分析

采用InterPro軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進行結構域分析；采用在線軟件ProtParamtool(http://web.expasy.org/protparam/)預測氨基酸多肽鏈的氨基酸組成、等電量、相對分子量、分子式等[12–14]; 使用DNAMAN軟件預測多肽鏈的親/疏水性; 采用GOR4工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cginbin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)對編碼蛋白的二級結構進行預測。蛋白序列同源性比對和進化樹的構建采用Mega 6.0軟件[15]。

1.5 BoSCL3基因的表達分析

根據(jù)獲得青花菜基因的cDNA序列，設計定量引物，F(xiàn): 5?-CTTAACGCAACTCAGACAA-3?和R: 5?-CCATCTTCTCACCTTCCA-3?。以基因(引物分別為5?-GACAACTTACAACTCCATCAT-3?和5?-CTCATACGGTCAGCGATA-3?)為內(nèi)參基因。使用SYBR Premix Ex Taq (大連TaKaRa公司)試劑盒在ABI Prism 7500定量擴增儀上進行實時熒光定量分析。反應體系為：cDNA 1L，上、下游引物各1L, SYBR 10L，ddH2O 12L。反應程序為94℃預變性2 min；94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。每個反應設3次重復，采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

2 結果和分析

2.1 BoSCL3基因的克隆及序列特征分析

采用特異引物，經(jīng)PCR擴增后，從青花菜葉片中克隆了基因(圖1)。序列分析表明該基因cDNA全長1 355 bp，推導編碼446個氨基酸(圖2)。InterPro分析表明，該基因具有保守的結構域，屬于基因家族。

圖1 青花菜BoSCL3基因的PCR擴增。L: DL 2000 Marker; 1: BoSCL3。

2.2 BoSCL3蛋白的生物信息學分析

青花菜BoSCL3蛋白的分子量為49.96 kDa，理論等電點為6.14；帶負電殘基總數(shù)為51，帶正電殘基總數(shù)為45；疏水性最大值為3.04，親水性最大值為2.38，同時疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，說明該蛋白為疏水性蛋白。

通過GOR4工具對蛋白氨基酸序列的二級結構進行分析, 結果表明，青花菜BoSCL3蛋白的二級結構包括無規(guī)則卷曲(Cc)(44.62%)、延伸鏈(Ee) (12.33%)和-螺旋(Hh)(43.05%)。

2.3 系統(tǒng)進化樹

利用BLAST對BoSCL3蛋白的氨基酸序列同源性進行分析，結果表明，基因編碼的氨基酸序列與甘藍()、油菜()、蕪菁()、白菜、蘿卜()、擬南芥中的SCL3氨基酸序列的同源性分別是100%、98%、98%、98%、91%和90%, 與煙草、長葉馬先蒿、可可、毛果楊的相似性也都在60%以上。

將青花菜BoSCL3蛋白的氨基酸序列與甘藍、油菜、蕪菁、白菜、蘿卜、擬南芥(subsp.)、榴蓮()、長蒴黃麻()、黃花蒿()、除蟲菊()、萵苣()、絨毛煙草()、蓖麻(）、毛果楊()等14種植物的SCL3氨基酸序列進行多重比對并構建進化樹(圖3)，可見，青花菜的BoSCL3與甘藍、油菜的SCL3親緣關系較近。同屬于十字花科的甘藍、油菜、蕪菁、蘿卜、白菜和擬南芥聚在同一分支上，表明同科植物的SCL3蛋白具有較高的同源性。

圖2 BoSCL3基因的全長序列和推測的氨基酸序列。下劃線為引物序列。

圖3 基于SCL3蛋白氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹

2.4 漬水脅迫下BoSCL3基因的表達

利用實時熒光定量PCR技術檢測青花菜漬水處理不同時間的表達特征。結果表明(圖4)，青花菜基因在漬水脅迫處理2 d時的表達受到抑制，相對表達量僅為0.11。其后隨著漬水脅迫時間的延長，表達量呈現(xiàn)上升的趨勢，處理6 d的相對表達量為1.18。

圖4 漬水脅迫下BoSCL3基因的表達

3 結論和討論

本研究從青花菜中成功克隆到基因,對其編碼蛋白的親/疏水性、結構域、二級結構和同源性進行了預測分析并構建了系統(tǒng)進化樹。對漬水脅迫下青花菜基因的表達進行了分析，為進一步揭示青花菜基因響應漬水脅迫的應答機制提供了一定的理論依據(jù)。

轉錄因子對于增強植物對逆境的抵抗力和適應能力具有重要作用[16–17]。本試驗克隆得到1個青花菜基因，其編碼的蛋白具有GRAS家族的保守結構域，為疏水性蛋白。石瑞等[18]報道的佛手(var.)的GRAS和陳裕坤等[19]報道的龍眼()胚性愈傷組織DlGRAS4與DlGRAS54的結構、性質相似。將BoSCL3蛋白的氨基酸序列與薺藍、油菜、蘿卜、白菜、擬南芥等植物中GRAS家族的SCL3的氨基酸序列進行比對，表明約有80%以上的同源性，推測SCL3在功能上存在一定的保守性。

逆境脅迫是限制作物生長的重要因子，嚴重時可導致植株形態(tài)發(fā)生變化?；蚩稍谥参锸艿侥婢趁{迫時，產(chǎn)生應答機制來提高植物的抗逆性，直接表現(xiàn)為表達量的變化。本研究中，漬水脅迫處理可對基因的表達量產(chǎn)生影響，說明基因可能參與了青花菜的漬水脅迫響應。前人的研究表明，水稻的表達量在受到鹽、干旱和外源ABA的脅迫時表達上調(diào)[20]。郭華軍等的研究也表明擬南芥13個基因在干旱和滲透脅迫處理下的表達均比對照顯著上升[21]。本試驗中青花菜基因的表達量隨著漬水脅迫時間的延長，呈先急劇下降后快速上升的變化趨勢，表明基因可能在青花菜漬水脅迫調(diào)控過程中具有重要作用。

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CloningGene fromvar.and Expression Analysis under Waterlogging Stress

PEI Xu-li1, FU Shuang1, JING Zan-ge1,2*, TANG Zheng2, LIN Yan1, HUANG Li1

(1. College of Agriculture and Bioscience, Kunming University,Kunming 650214, China; 2. College of Agriculture and Biotechnology, Wenzhou Vocational College of Science and Technology,Wenzhou 325006, Zhejiang, China)

In order to understand the function of(scarecrow-like 3) gene, agene was cloned fromvar., named, which full length of cDNA sequence was 1355 bp and encoding 446 amino acids. The molecular weight of BoSCL3 was 49.96 KD, predicted to be hydrophobic protein. Phylogenetic analysis showed that the SCL3 invar.(BoSCL3) was closely related to those inand, and SCL3 in the same family had high homology. The real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression ofdecreased at first and then increased with waterlogging stress time, indicating that this gene might be involved in response to waterlogging stress. Therefore, these would provide a theoretical basis for studying the molecular mechanism of BoSCL3 gene in response to waterlogging stress.

var.;; Gene clone; Waterlogging stress

10.11926/jtsb.4263

2020–06–10

2020–08–31

浙江省自然科學基金項目(LY18C150006); 云南省地方本科高校(部分)基礎研究聯(lián)合專項(2018FH001-044); 云南省科技廳基礎研究專項青年項目(2019-1-C-25318000002236); 浙江省科技廳項目(2016C051-5-3); 溫州市科技項目(2019ZX007-2)資助

This work was supported by the Project for Nature Sciences in Zhejiang (Grant No. LY18C150006); the Project for Fundamental Research of Local Undergraduate Universities (Partial) in Yunnan Province (Grant No. 2018FH001-044); the Special Project for Basic Research of Youth in Yunnan Science and Technology Department (Grant No. 2019-1-C-25318000002236); the Project of Department of Science and Technology in Zhejiang (Grant No. 2016C051-5-3); and the Project for Science and Technology in Wenzhou (Grant No. 2019ZX007-2).

裴徐梨(1990~ )，女，博士，講師，主要從事蔬菜分子生物學研究。E-mail: xuliP@163.com

. E-mail: jingzange@aliyun.com