冬季南亞熱帶森林演替中后期優(yōu)勢樹種幼葉光保護策略

林威, 俞正超, 羅燕娜, 施楚亮, 賴宇波, 彭長連

冬季南亞熱帶森林演替中后期優(yōu)勢樹種幼葉光保護策略

林威, 俞正超, 羅燕娜, 施楚亮, 賴宇波, 彭長連*

(廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，華南師范大學生命科學學院, 廣州 510631)

為了解演替中期和后期優(yōu)勢樹種對冬季不同光強的適應性，對在全光照(100%自然光強)和低光照(30%自然光強)下生長的演替中期優(yōu)勢種木荷()、錐栗()和黧蒴()及演替后期優(yōu)勢種華潤楠()、黃果厚殼桂()和厚殼桂()的生理生化響應進行了研究。結果表明，與全光照相比，低光照下演替中期優(yōu)勢樹種幼葉的非光化學猝滅(NPQ)、類胡蘿卜素與葉綠素的比值(Car/Chl)和花色素苷含量下降，細胞質膜滲透率增加；而演替后期優(yōu)勢樹種幼葉的花色素苷含量增加、細胞質膜滲透率降低，且受光抑制的程度低(Fv/Fm高)。此外，除總抗氧化能力外，演替中期優(yōu)勢樹種幼葉的花色素苷含量、NPQ和Car/Chl均顯著低于演替后期優(yōu)勢種。因此，演替后期優(yōu)勢樹種可以通過靈活多樣的光保護策略來提高對冬季強光環(huán)境的適應能力，而演替中期優(yōu)勢種在光保護策略的多樣性及光保護能力上均弱于演替后期優(yōu)勢種。

群落演替；花色素苷；非光化學猝滅；光保護；冬季

光對植物具有重要意義，是植物進行光合作用的能源基礎，不僅影響植物的生長，同時對植物的分布具有重要影響。在森林演替過程中光也是促進群落內物種更替的主要環(huán)境因素之一[1]。在森林更替和群落演替過程中，不同物種及同種物種在不同的生長階段對不同光照環(huán)境的響應與適應特性的差異是推動群落演替的重要內在驅動力[2–3]。在南亞熱帶森林，隨著群落演替的進行，群落內部郁閉度逐漸增加，從林冠層往下光照強度逐漸下降，同時光質的組成也發(fā)生著變化，造成了群落內部復雜的光照環(huán)境。因此光因子成了制約植物生長的關鍵環(huán)境因子。光照過高或過低都會影響植物的生長。高光環(huán)境會導致植物體內活性氧的積累[4–5]，這是由于高光環(huán)境下植物葉片捕獲的光能超過光合作用所需光能，過剩光能可以誘導活性氧的產生，積累的活性氧會在植物體中引發(fā)氧化損傷，最終會導致生物大分子的破壞及植物細胞的死亡[6]。低光環(huán)境對有些植物也會造成脅迫，特別是陽生植物，原因在于低光環(huán)境下植物葉片中Rubisco含量下降,光合中間產物合成減少, 從而限制了葉片對CO2的吸收和傳遞電子能力, 在一定程度上限制了植物NADP+再生能力, 使較多電子流向O2, 提高了活性氧自由基的產生速率[7–8]。

過剩光能的產生和活性氧的積累對植物的生長必然是嚴重的阻礙，因此在脅迫環(huán)境下如何耗散過剩光能及清除活性氧對植物來說尤為重要。植物在長期的進化過程中已形成多種策略來抵御環(huán)境脅迫?；ㄉ剀帐且环N水溶性的非光合色素，分布于植物表皮細胞、葉肉細胞的液泡或植物的表皮毛中[9–11]。大多數(shù)學者認為花色素苷具有屏蔽光能的作用[12–13]。也有學者認為花色素苷在清除活性氧方面起著重要作用[14–15]?；ㄉ剀盏姆e累是植物抵御環(huán)境脅迫的手段之一。在沒有花色素苷積累的植物中，其他抗氧化物質在抵御環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用。在夏季南亞熱帶森林中演替后期樹種在不積累花色素苷的情況下依靠類黃酮、總酚和類胡蘿卜素的協(xié)調作用提高了幼葉對高溫高光的光保護潛力[16]。暴露于高UV-B輻射的煙草()通過提高總抗氧化能力來防止自身受到光氧化破壞[17]?？寡趸芰νǔＪ怯梢恍┑头肿拥目寡趸镔|貢獻的，包括類黃酮、花色素苷、類胡蘿卜素、抗壞血酸、谷胱甘肽等[18–20]，在植物體內構成非酶促抗氧化系統(tǒng)，起到清除活性氧的作用。此外，體內吸收的多余光能的耗散也是植物進行自我保護的一種重要機制[21–22]。許多研究表明，脅迫下植物通過上調NPQ進行過量光能的耗散，從而避免活性氧的形成[23–24]。

目前對鼎湖山森林群落演替的研究多數(shù)集中于研究不同演替階段優(yōu)勢種對夏季光照環(huán)境的響應機制上，很少報道對冬季光照環(huán)境的響應機制。本研究通過比較物種幼葉的花色素苷、總抗氧化能力和熱耗散能力，探討不同演替階段優(yōu)勢種對冬季光照環(huán)境的光保護機制的差異，以闡明其對冬季光照環(huán)境的適應能力。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗以廣東鼎湖山南亞熱帶森林3種演替中期優(yōu)勢樹種木荷()、錐栗()、黧蒴()和3種演替后期優(yōu)勢樹種華潤楠()、黃果厚殼桂()、厚殼桂()為材料。從鼎湖山自然保護區(qū)采挖幼苗(株高1 cm左右)，每樹種20棵，在華南師范大學生命科學學院試驗場以盆栽的方式種植，種植的土壤為3∶1混合的粘土和泥炭土，容器直徑為50 cm，高35 cm，每盆種植1棵幼苗。夏季每天澆水1次, 冬季每3 d澆水1次, 每3個月使用復合肥施肥1次，定期進行除草。待幼苗成活后進行光處理，設置全光照(100%自然光強, full light, FL)，模擬冠層光照；低光照(30%自然光強, low light, LL)，模擬林下光環(huán)境[25]。樹苗經遮光處理3~4 a后進行試驗。

1.2 細胞質膜滲透率的測定

采集6種優(yōu)勢樹種的新鮮幼葉和成熟葉，用水清洗葉片表面。避開主葉脈用8 mm打孔器獲取5片葉圓片，放入裝有10 mL去離子水的15 mL試管中。室溫靜置2 h，然后用電導儀(PP-15-P11, Sarto- rius, Germany)測溶液的電導值(1)。將試管置于沸水中30 min，冷卻后測電導值(2)，以相對電導率表示葉片細胞質膜的滲透率(1/2)。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)測定

使用多功能植物測量儀MultispeQ (PhotosynQ, USA)測定優(yōu)勢樹種葉片的最大光化學效率(Fv/Fm)和非光化學猝滅(NPQ)。在晴朗天氣下，通過手機藍牙將手機與多功能植物測量儀配對，打開手機PhotosynQ軟件與儀器連接，通過儀器上部的感光裝置接收自然光進行測定。每樹種選取3~5株，分別測量5片幼葉和成熟葉，在不損傷植物葉片和保持環(huán)境狀態(tài)不變的情況下用多功能植物測量儀夾住葉片進行測定，將數(shù)據(jù)上傳至PhotosynQ官網,從PhotosynQ官網下載數(shù)據(jù)。

1.4 花色素苷含量測定

將采集的新鮮幼葉和成熟葉用水清洗干凈，用8 mm打孔器取5片葉圓片(避開主葉脈)放入15 mL試管中，加入4 mL 1%鹽酸-甲醇()在黑暗下4℃浸提24 h，向浸提液中加入2 mL蒸餾水和4 mL氯仿，待溶液充分混勻分層后取上清液用UV2450型分光光度計(Shimadzu, Tokyo, Japan)在400和700 nm處進行光譜吸收掃描。使用矢車菊素-3--葡萄糖苷來制作標準曲線，以吸收光譜中達到峰值時的吸光值計算葉片中花色素苷的含量。

1.5 總抗氧化能力測定

清洗新鮮的幼葉和成熟葉，避開主葉脈，用8 mm打孔器取2片葉圓片放入試管中，向試管中加入3 mL 95%甲醇，黑暗下4℃浸提24 h。樣品的總抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)根據(jù)提取液對DPPH的清除能力進行評估[26]。在避光條件下吸取20L提取液和3 mL 0.1 mol/L DPPH (用95%甲醇配制)加入4 mL離心管中，混勻靜置5 min后測定517 nm波長處的吸光值，以95%甲醇溶液為空白對照。以梯度稀釋的DPPH溶液(10~100mol/L)建立標準曲線，以單位葉面積清除DPPH的mol數(shù)來表示葉片的總抗氧化能力。

1.6 類胡蘿卜素含量測定

新鮮葉片清洗干凈后用8 mm打孔器取2片葉圓片，放入10 mL離心管中，加入少量的液氮并用金屬棒將葉圓片搗碎成粉末狀，加入4 mL 80%丙酮在4℃冰箱中浸提過夜。將提取液充分搖勻，靜置后吸取上清液，在波長663、645和470 nm處測定吸光值，以80%的丙酮作為空白對照。參考Wellburn的公式[27]計算葉綠素a (Chl a)、葉綠素b (Chl b)、總葉綠素(Chl a+b)及類胡蘿卜素(Car)的含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

以平均值±標準誤表示數(shù)據(jù)。采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和多重比較。Duncan多重比較法檢驗不同演替階段植物葉片在不同光強下生理指標的差異顯著性，顯著性水平為0.05。使用Sigma- plot 12.5軟件進行作圖。

2 結果和分析

2.1 細胞質膜滲透率的變化

植物在遭受非生物脅迫時通常會積累活性氧,從而出現(xiàn)膜脂過氧化現(xiàn)象。結果表明，在全光照(FL)下，演替后期的華潤楠、黃果厚殼桂和厚殼桂幼葉的細胞質膜滲透率高于演替中期的木荷、錐栗和黧蒴幼葉(表1)，其中黃果厚殼桂幼葉的膜滲透率最高,為0.271，是演替中期優(yōu)勢種木荷、錐栗和黧蒴幼葉的2倍。與FL相比，低光照(LL)下演替后期優(yōu)勢種幼葉的細胞質膜滲透率降低，其中黃果厚殼桂幼葉的降幅最大，為23%。而演替中期優(yōu)勢種幼葉細胞質膜滲透率則上升，其中黧蒴幼葉升幅達到68%。

表1 光照強度對優(yōu)勢種葉片細胞質膜滲透率的影響

2.2 葉綠素熒光參數(shù)的變化

Fv/Fm的變化反映了植物受到光抑制的程度。從圖1可見，在不同光照條件間，演替中期和后期優(yōu)勢種成熟葉的Fv/Fm差異不顯著。與演替中期優(yōu)勢種相比，F(xiàn)L下演替后期優(yōu)勢種幼葉的Fv/Fm明顯更低，演替中期優(yōu)勢種幼葉的Fv/Fm大于0.6，而演替后期優(yōu)勢種幼葉的Fv/Fm小于0.6；LL下演替后期優(yōu)勢種幼葉的Fv/Fm顯著高于FL，F(xiàn)v/Fm值與演替中期優(yōu)勢種相近，而演替中期優(yōu)勢種幼葉在LL和FL間的Fv/Fm沒有顯著差異。無論是LL還是FL，演替后期優(yōu)勢種幼葉的NPQ都明顯高于演替中期, 尤其是黃果厚殼桂和厚殼桂幼葉，分別為0.64和0.63，是演替中期優(yōu)勢種錐栗的3倍。與FL相比, LL下2個演替階段優(yōu)勢種幼葉的NPQ都出現(xiàn)顯著下降(圖2)，其中演替后期優(yōu)勢種降幅最大，黃果厚殼桂和厚殼桂幼葉的NPQ都比FL下降一半。

2.3 花色素苷含量變化

從圖3可見，2個演替階段優(yōu)勢種的成熟葉都不積累花色素苷。演替中期優(yōu)勢種除黧蒴幼葉積累少量花色素苷外，木荷和錐栗的幼葉在FL和LL下都不積累花色素苷。然而，在演替后期優(yōu)勢種的幼葉在FL和LL下都會積累花色素苷，其中FL下華潤楠幼葉花色素苷的積累最高，分別為FL下木荷和錐栗幼葉的40和10倍。并且LL下演替后期優(yōu)勢種幼葉花色素苷的積累明顯大于FL，其中黃果厚殼桂幼葉花色素苷的積累達到了0.841mol/cm2，為FL下的2倍。

2.4 總抗氧化能力的變化

從表2可見，幼葉的總抗氧化能力顯著大于成熟葉。在FL下，2個演替階段優(yōu)勢種幼葉的總抗氧化能力要顯著高于LL下。與演替后期優(yōu)勢種相比,演替中期優(yōu)勢種葉片的總抗氧化能力更強。FL下3個演替中期優(yōu)勢種幼葉的總抗氧化能力均超過500mol/cm2,而演替后期優(yōu)勢種幼葉的總抗氧化能力均低于500mol/cm2。LL下演替中期優(yōu)勢種幼葉的總抗氧化能力盡管明顯低于FL下，但依舊維持在與演替后期樹種相等水平。

圖1 光照強度對優(yōu)勢種葉片最大光化學效率(Fv/Fm)的影響。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。FL: 100%自然光強; LL: 30%自然光強。下圖同。

圖2 光照強度對優(yōu)勢種葉片非光化學淬滅(NPQ)的影響

圖3 光照強度對優(yōu)勢種葉片花色素苷含量的影響

表2 光照強度對優(yōu)勢種葉片總抗氧化能力(TAC)的影響

2.5 Car/Chl的變化

Car/Chl是反映植物對光氧化防護能力的一個重要指標。從圖4可見，在FL下，演替后期優(yōu)勢種幼葉的Car/Chl明顯高于演替中期優(yōu)勢種，其中以黃果厚殼桂和厚殼桂最高，Car/Chl值超過0.5，為演替中期優(yōu)勢種的2~5倍。在LL下, 演替中期優(yōu)勢種木荷幼葉的Car/Chl顯著增加，錐栗和黧蒴幼葉的Car/Chl與FL無顯著差異。而在LL下，演替后期優(yōu)勢種華潤楠幼葉的Car/Chl略微下降，但與FL間無顯著差異，而黃果厚殼桂和厚殼桂幼葉的Car/Chl顯著下降，但仍高于演替中期優(yōu)勢種。

圖4 光照強度對優(yōu)勢種葉片Car/Chl的影響

3 結論和討論

在南亞熱帶森林群落演替過程中，隨著不同生長特性的植物入侵，森林群落內部逐漸形成復雜多樣的光照環(huán)境，而不同演替階段優(yōu)勢種對光照的要求是不同的。這就要求不同演替階段優(yōu)勢種采用不同的光保護策略來適應復雜的光環(huán)境。冬季不同光照環(huán)境下演替后期優(yōu)勢種在花色素苷含量、總抗氧化能力、NPQ和Car/Chl的變化上比演替中期更加靈活多樣，因而展現(xiàn)出了對冬季不同光照環(huán)境較強的適應能力，而演替中期優(yōu)勢種只在高光環(huán)境下具有較強的光保護能力。

在南亞熱帶森林中植物的生長受制于環(huán)境因子的多變性，尤其是復雜多變的光照環(huán)境對植物的影響最為明顯。由于不同植物的生長在森林中形成了不同層次的森林群落，因此造就了不同層次群落之間復雜多變的光照條件[28]。在林冠層往往是高光照，而在林冠層以下，太陽輻射量逐層遞減。然而，光強過高或過低都會影響植物的生長，因此植物對多變的光照環(huán)境的適應尤為重要。活性氧的積累是植物遭受脅迫傷害的結果。研究表明，當植物處于高光環(huán)境時，其捕獲的光能中僅有部分用于光合作用，因此必然會產生過剩光能，這就導致了葉片中活性氧的增加[29–30]。另有學者認為遮陰環(huán)境也會導致植物體內活性氧的增加[31]。如果活性氧得不到及時清除就會破壞植物細胞膜，使膜脂出現(xiàn)過氧化現(xiàn)象。細胞膜滲透率的變化是衡量細胞膜損傷程度的一個重要指示，也是衡量脅迫環(huán)境下植物細胞膜結構完整性的重要指標[32]。從膜滲透率來看，與全光照相比，30%光照下的演替中期優(yōu)勢種幼葉膜滲透率更高，因此演替中期優(yōu)勢種在30%光照下受到更大的膜損傷，而演替后期優(yōu)勢種的生長在全光照下受到限制，因為全光照下演替后期優(yōu)勢種幼葉膜滲透率高于30%光照。植物對環(huán)境脅迫的響應也可體現(xiàn)在植物葉綠素熒光的變化上。Fv/Fm下降一般可用于衡量植物遭受光抑制的程度,Fv/Fm越低說明植物遭受的光抑制強度越強[33–34]。從Fv/Fm來看，演替后期優(yōu)勢種在全光照下受到的光抑制大于演替中期，但是在30%光照下演替后期優(yōu)勢種面臨的環(huán)境脅迫壓力明顯變小，因為全光照下演替后期優(yōu)勢種幼葉的Fv/Fm要低于演替中期，并且30%光照下演替后期優(yōu)勢種幼葉的Fv/Fm顯著更高。

植物在遭受到脅迫傷害時往往采用多種防御手段抵御環(huán)境脅迫?；ㄉ剀盏姆e累被認為是植物抵御環(huán)境脅迫的一種有效手段。在多數(shù)研究中，花色素苷都被發(fā)現(xiàn)具有清除活性氧及濾光的功能[35–36], 包括在高溫、高光、低溫、干旱和營養(yǎng)缺乏等脅迫環(huán)境中。本研究結果表明，花色素苷的積累模式與Fv/Fm的變化趨勢一致。2種光強下演替后期優(yōu)勢種幼葉都積累了花色素苷，但是30%光照下花色素苷含量明顯更高，這與30%光照下演替后期優(yōu)勢種幼葉Fv/Fm高于全光照的一致。而2種光強下演替中期優(yōu)勢種幼葉除黧蒴幾乎不積累花色素苷外, 2種光強下花色素苷的變化也與其幼葉的Fv/Fm變化一致。這說明高含量的花色素苷為演替后期優(yōu)勢種提供較強防御光抑制的能力，尤其是在30%光照下。植物通過積累花色素苷來抵御環(huán)境脅迫只是其防御策略的一種，植物在面對環(huán)境脅迫時還可以通過積累其他的抗氧化物質來達到抗氧化作用，例如類黃酮、總酚等[37–38], 這體現(xiàn)在總抗氧化能力上。本研究結果表明，與演替后期優(yōu)勢種相比，總抗氧化能力在全光照下演替中期優(yōu)勢種幼葉中表現(xiàn)出更強的光保護潛力，表明在全光照下，演替中期優(yōu)勢種比演替后期優(yōu)勢種積累更多其他的抗氧化物質，這些抗氧化物質的積累可以彌補花色素苷積累缺少的缺陷而起到抵御環(huán)境脅迫的作用。然而與全光照相比，30%光照下演替后期優(yōu)勢種幼葉的總抗氧化能力僅略微下降，而演替中期的總抗氧化能力則明顯下降，這與30%光照下演替中期優(yōu)勢種幼葉膜滲透率顯著上升的趨勢正好相反，表明30%光照下演替中期優(yōu)勢種抗氧化能力的下降導致環(huán)境脅迫對植物葉片的傷害增加。類胡蘿卜素是植物進行光抑制防御的一種重要物質[39]，Car/Chl在一定程度上反映了植物的光保護潛力[40]。無論是全光照還是30%光照，演替后期優(yōu)勢種幼葉的Car/Chl都大于演替中期的，這與Zhang等[41]報道演替后期優(yōu)勢種的葉黃素含量大于演替中期的結果是一致的，表明提高熱耗散潛能是演替后期優(yōu)勢種幼葉應對不同光照環(huán)境的適應策略，尤其是在全光照下。NPQ是植物用于光保護的一種保護機制，通常用于耗散多余的吸收光能，防止活性氧的形成[42–43]。我們的研究表明，無論是全光照還是30%光照，演替后期優(yōu)勢種幼葉的NPQ都高于演替中期，表明利用NPQ來提高熱耗散也是演替后期優(yōu)勢種對不同光照環(huán)境的一種適應策略。并且在全光照下，演替后期優(yōu)勢種除華潤楠外，黃果厚殼桂和厚殼桂幼葉的NPQ比30%光照下高1倍，這可能是通過提高NPQ來彌補花色素苷積累的不足。

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Photoprotection Strategies in Young Leaves of Dominant Species in Mid- and Late-Successional Stages of Low Subtropical Forest in Winter

LIN Wei, YU Zheng-chao, LUO Yan-na, SHI Chu-liang, LAI Yu-bo, PENG Chang-lian*

(Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

In order to understand the mechanism of photoprotection strategies of dominant species at different successional stages under different light environments in winter, the physiological and biochemical responsethree dominant species at mid-successional stage, i.e.,andand three dominant species at late-successional stage, i.e.,,grown on full light (100% natural light) and low light (30% natural light) were studied. The results showed that, compared with full light, the non-photochemical quenching (NPQ), ratio of carotenoid to chlorophyll (Car/Chl) and anthocyanin content in young leaves of dominant species at mid-successional stage under low light decreased, and the relative cytoplasmic membrane leakage increased. On the contrary, the anthocyanin content in young leaves of dominant species in the late-successional stage increased, the relative cytoplasmic membrane leakage decreased, and the degree of light inhibition was low (high Fv/Fm). In addition, the anthocyanin content, NPQ and Car/Chl in young leaves of mid-successional species were significantly lower than those of late- successional species except of total antioxidant capacity. So, the dominant species at late-successional stage could improve their adaptability to high light environments in winter through their flexible light protection strategies. However, the diversity of light protection strategies and light protection ability of dominant species at mid- successional stage were weaker than those at late-successional stage.

Community succession; Anthocyanin; Non-photochemical quenching; Photoprotection; Winter

10.11926/jtsb.4264

2020–06–13

2020–09–20

國家自然科學基金項目(31870374, 31570398)；廣東省自然科學基金項目(2017A030313167, 2015A030311023)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31870374, 31570398), and the Projects for Natural Science in Guangdong (Grant No. 2017A030313167, 2015A030311023).

林威，男，碩士，主要從事植物生理生態(tài)研究。E-mail: 1844052102@qq.com

. E-mail: pengchl@scib.ac.cn