抗生素清腸對丁酸梭菌保護腸炎小鼠腸黏膜屏障的影響及初步機制研究

徐婧，徐豪明，周有連，彭瑤，趙沖，何杰，黃紅麗，趙海蘭，黃文琪，聶玉強

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種以反復(fù)腹痛、腹瀉為特征的炎癥性疾病，常呈慢性，主要包括克羅恩病(Crohn′s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)這兩個類型。IBD的發(fā)病原因復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與遺傳、環(huán)境、免疫和腸道菌群等有關(guān)。隨著微生物-宿主相互作用的深入研究，大量研究表明益生菌或糞菌移植等菌群干預(yù)方法可調(diào)節(jié)宿主腸道菌群、改善腸道屏障功能，進(jìn)而發(fā)揮療效[1-4]。丁酸梭菌是一種以產(chǎn)丁酸為主要特點的專性厭氧菌，其產(chǎn)生的丁酸可直接為結(jié)腸細(xì)胞提供能量，緩解炎癥癥狀[5]。在菌群失調(diào)誘導(dǎo)的小鼠腹瀉模型中，丁酸梭菌可調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，改善屏障功能和黏膜免疫細(xì)胞失調(diào)，促進(jìn)小鼠恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[6]。在炎癥性疾病和自身免疫病中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮重要作用，激活后的NF-κB可轉(zhuǎn)位入核，并顯著上調(diào)如TNF-α、IL-6、IL-1β等眾多促炎因子的表達(dá)，擴大機體炎癥級聯(lián)反應(yīng)。此外，NF-κB抑制劑可明顯減弱腸上皮屏障功能損害[7]。適當(dāng)應(yīng)用抗生素可抑制部分腸道致病菌的過度增長，也有研究證實糞菌移植前應(yīng)用抗生素可增強移植后菌群的定植。本實驗通過設(shè)置有無抗生素清腸預(yù)處理后葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)造模組，并給予丁酸梭菌干預(yù)。通過小鼠體質(zhì)量、疾病活動指數(shù)、屏障改變情況和炎癥因子表達(dá)情況等指標(biāo)，觀察聯(lián)合抗生素預(yù)處理后丁酸梭菌對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎療效的作用，并初步探討丁酸梭菌對于腸黏膜屏障保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Balb/c小鼠購買于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(動物許可證號：SCXK[粵]2018-0002)，6～8周齡，體質(zhì)量24～26 g，飼養(yǎng)于廣州市第一人民醫(yī)院動物實驗室。

1.2 實驗試劑

丁酸梭菌購于ATCC(ATCC 19398)；DSS購于美國MP biomedical公司；氨芐西林、萬古霉素、新霉素、甲硝唑購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、TB Green Premix Ex TaqⅡ(RR820A)購自日本Takara公司；兔抗鼠NF-κB p65單抗(#8242)、兔抗鼠磷酸化NF-κB p65單抗(#3033)、兔抗鼠IκBα單抗(#4812)和兔抗鼠磷酸化IκBα單抗(#2859)購自美國Cell Signaling TECHNOLOGY公司；兔抗鼠ZO-1多抗(ab216880)、兔抗鼠occludin多抗(ab168986)和兔抗鼠GAPDH單抗(ab181602)購自英國Abcam公司；羊抗兔HRP二抗(S0001)購自Affinity公司；小鼠ACTB內(nèi)參引物購自上海生工公司(B661302-0001)。

1.3 腸炎小鼠模型的建立

進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將30只小鼠隨機分為5組，具體為空白組(Control)、DSS組(DSS)、抗生素清腸+DSS組(DSS+Antibiotic)、DSS+丁酸梭菌組(DSS+CB)和抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組(DSS+Antibiotic+CB)?？股厍迥c方案為：四聯(lián)抗生素(氨芐西林1 g/L、新霉素1 g/L、萬古霉素0.5 g/L、甲硝唑1 g/L)作為飲用水，待自由飲用7 d后更換為正常飲用水3 d，并循環(huán)3次。將3%(w/w)DSS添加到飲用水讓小鼠自由飲用12 d，以構(gòu)建急性結(jié)腸炎模型。每日據(jù)體質(zhì)量下降程度、腹瀉情況及血便情況評分，并按公式DAI=(體質(zhì)量評分+腹瀉評分+血便評分)/3計算DAI分?jǐn)?shù)[8]。所培養(yǎng)出的丁酸梭菌活菌調(diào)整濃度為1×106CFU，于DSS造模期間用于干預(yù)組連續(xù)灌胃；空白組用等量生理鹽水灌胃作為對照。于實驗終點用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，頸椎脫臼法處死小鼠。新鮮結(jié)腸取出后分裝于1.5 mL EP管，并快速放入液氮；取靠近肛門約1 cm的直腸進(jìn)行石蠟包埋切片及HE染色，并進(jìn)行評分[9]。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

沾取丁酸梭菌菌液后于TSA固體培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)，并將該平板置于37 ℃溫箱厭氧孵育24 h。待出現(xiàn)可視菌落后，將其挑出并培養(yǎng)于TSB液體培養(yǎng)基中，繼而轉(zhuǎn)移到37 ℃溫箱厭氧培養(yǎng)14～16 h。待培養(yǎng)管底部出現(xiàn)3～5 mm乳白色沉淀時，將培養(yǎng)管以3 000 rpm/min轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心5 min收集菌體，PBS洗滌菌體3次后，調(diào)整菌液濃度為1×106CFU。

1.5 指標(biāo)檢測方法

1.5.1 RT-QPCR測定促炎因子表達(dá)水平 所用TNF-α、IL-1β因子引物由上海生工有限公司合成，具體序列為：TNF-α上游引物 5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物 5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；IL-1β 上游引物 5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物 5′-CAGTTG-TCTAATGGGAACGTCA-3′。

用Trizol法提取組織總RNA，并據(jù)說明書使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行cDNA的合成。QPCR的反應(yīng)體系為10 μL SYBR Green Supermix，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，6 μL去離子水和2 μL的cDNA模板(50 ng/μL)。QPCR運行程序設(shè)定為95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。確保每次結(jié)果中擴增產(chǎn)物溶解曲線為單峰，CT值在可信范圍內(nèi)。

1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測緊密連接蛋白表達(dá) 將已進(jìn)行石蠟包埋切片的結(jié)腸組織依次進(jìn)行脫蠟、修復(fù)、封閉，繼而由一抗與抗原特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，4°過夜，抗體濃度為ZO-1抗體(1∶200)、Occludin抗體(1∶1 000)；復(fù)溫后孵育二抗40 min，用DAB顯色劑進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞為管腔、隱窩上皮細(xì)胞膜和上皮細(xì)胞連接處呈棕黃色的細(xì)胞。據(jù)切片染色的強度和所判定陽性細(xì)胞百分比分別進(jìn)行評分；兩項相加為最終分?jǐn)?shù)[10]。

1.5.3 Western-blot檢測NF-κB通路表達(dá) 結(jié)腸組織經(jīng)RIPA+PMSF裂解、勻漿后，測蛋白濃度，配制5%、8%聚丙烯凝膠，取總蛋白40 μg上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后孵育一抗，4 ℃過夜，抗體濃度為NF-κB(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)；復(fù)溫后孵育二抗1.5 h；顯像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 丁酸梭菌可改善結(jié)腸炎大體

由圖1可知，空白組小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增加，一般狀況良好。給予DSS造模后，DSS組小鼠于第2天體質(zhì)量下降，并出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)粗糙，以及肉眼血便、大便不成形等結(jié)腸炎表現(xiàn)；給予丁酸梭菌干預(yù)后，DSS+丁酸梭菌組小鼠體質(zhì)量及一般狀況較DSS組稍緩解。給予DSS造模后，抗生素清腸+DSS組小鼠體質(zhì)量從第2天起略微下降，自第7天起下降不明顯；但給予丁酸梭菌干預(yù)后，抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組小鼠體質(zhì)量逐漸增加。

由圖1可知，實驗終點時，空白組小鼠疾病活動度趨近于0。DSS組小鼠DAI顯著增高(P<0.001)，給予丁酸梭菌干預(yù)后DAI降低。與空白組比較，抗生素清腸+DSS組DAI顯著增加(P<0.001)，而丁酸梭菌干預(yù)可明顯降低其DAI(P<0.01)。總的來說，抗生素清腸可加強丁酸梭菌降低DAI的效果。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量及末次DAI評分 A：體質(zhì)量；B：末次DAI評分(**P<0.01，***P<0.001)

2.2 丁酸梭菌改善結(jié)腸炎小鼠腸道病理

由圖2可知，光鏡下空白組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，可見大量杯狀細(xì)胞，黏膜固有層及黏膜下層未見明顯免疫細(xì)胞浸潤。DSS組及抗生素清腸+DSS組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，腺體消失，黏膜固有層及黏膜下層出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤；DSS組嚴(yán)重程度大于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整，腺體破損及免疫細(xì)胞浸潤緩解，可見杯狀細(xì)胞；抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組小鼠結(jié)腸病理程度較DSS+丁酸梭菌組輕。

圖2 各組小鼠結(jié)腸HE染色和病理評分 A：空白組；B：DSS組；C：DSS+抗生素清腸組；D：DSS+丁酸梭菌組；E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組；F：組織病理評分(*P<0.05, ** P<0.01)

據(jù)結(jié)腸黏膜損傷程度和炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行評分，可見與空白組相比，DSS組和抗生素清腸+DSS組病理評分顯著升高，且DSS組病理評分高于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預(yù)后，DSS+丁酸梭菌組較DSS組病理評分降低(P<0.05)，抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組較抗生素清腸+DSS組病理評分均減低(P<0.01)，且后者病理評分較前者下降程度更高。

2.3 丁酸梭菌緩解腸道屏障損傷

ZO-1和occludin是重要的腸道屏障緊密連接蛋白，可間接反映腸屏障損害程度；其表達(dá)程度越高，屏障修復(fù)和抵御外界損傷能力越強[11]。如圖3所示，空白組小鼠結(jié)腸ZO-1表達(dá)顯著，其表達(dá)多位于管腔上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞連接處頂端。與空白組相比，DSS組及抗生素清腸+DSS組ZO-1表達(dá)明顯減少，DSS組ZO-1表達(dá)減少程度重于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組管腔上皮細(xì)胞及隱窩上皮細(xì)胞ZO-1表達(dá)增強，且抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組表達(dá)增強最顯著。據(jù)染色強度和炎性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分，可見DSS組和抗生素清腸+DSS組ZO-1表達(dá)評分明顯降低(P<0.001；P<0.05)，而丁酸梭菌干預(yù)組評分均升高(P<0.05)?？股厍迥c+DSS+丁酸梭菌組評分在干預(yù)組中最高。

圖3 各組小鼠結(jié)腸ZO-1免疫組化染色及評分 A： 空白組；B：DSS組； C：DSS+抗生素清腸組； D：DSS+丁酸梭菌組； E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組； F：免疫組化評分(*P<0.05, *** P<0.001)

如圖4所示，occludin在空白組的管腔上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞連接處頂端均可觀察到表達(dá)，DSS組對比空白組其表達(dá)減少，抗生素清腸+DSS組occludin表達(dá)稍減少。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組occludin表達(dá)增高(P<0.05)，其表達(dá)多位于管腔上皮細(xì)胞、隱窩上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞連接處頂端及少部分胞漿，且抗生素清腸后的抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組表達(dá)程度增高更明顯。從免疫組化評分來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組評分較空白組明顯降低(P<0.001；P<0.05)，DSS組降低程度更顯著。給予丁酸梭菌干預(yù)后，DSS+丁酸梭菌組和抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組評分增加(P<0.05)?？股厍迥c+DSS+丁酸梭菌組評分為干預(yù)組中最高。

圖4 各組小鼠結(jié)腸occludin免疫組化染色及評分 A： 空白組；B：DSS組； C：DSS+抗生素清腸組； D：DSS+丁酸梭菌組； E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組； F：免疫組化評分(*P<0.05, *** P<0.001)

2.4 丁酸梭菌下調(diào)促炎因子表達(dá)

據(jù)圖5可知，與空白組比較，DSS組和抗生素清腸+DSS組促炎因子TNF-α的相對表達(dá)增加，而DSS組增加更為明顯 (P<0.001)。給予丁酸梭菌干預(yù)后，干預(yù)組TNF-α相對表達(dá)量均下降，DSS+丁酸梭菌組TNF-α表達(dá)下調(diào)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組其TNF-α的相對表達(dá)量最低。促炎因子IL-1β在DSS組的相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)，給予丁酸梭菌干預(yù)后的DSS+丁酸梭菌組其表達(dá)顯著下降；但抗生素清腸后的抗生素清腸+DSS組IL-1β表達(dá)未見明顯升高。

圖5 小鼠結(jié)腸TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量 A： TNF-α；B：IL-1β (*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.5 丁酸梭菌作用與NF-κB通路相關(guān)

如圖6所示，從P65表達(dá)情況來看，DSS組表達(dá)略低于空白組，兩者差異不大；抗生素清腸+DSS組表達(dá)降低較明顯(P<0.001)。DSS+丁酸梭菌組表達(dá)低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)明顯低于DSS+抗生素清腸組，且差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。從磷酸化P65表達(dá)情況來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組表達(dá)明顯高于空白組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達(dá)低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)略升高，且差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。從IκBα表達(dá)情況來看，DSS組表達(dá)低于空白組，其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；抗生素清腸+DSS組表達(dá)略高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達(dá)高于DSS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)明顯高于DSS+抗生素清腸組，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。從磷酸化IκBα表達(dá)情況來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組表達(dá)明顯高于空白組，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達(dá)低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達(dá)明顯低于DSS+抗生素清腸組，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖6 小鼠結(jié)腸NF-κB通路表達(dá)情況 A：Western blot圖；B：各蛋白相對表達(dá)量(*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.6 緊密連接蛋白與NF-κB通路之間的相關(guān)性分析

如圖7所示，將緊密連接蛋白ZO-1和occludin與P65、IκBα及磷酸化的P65、IκBα做相關(guān)性分析顯示，ZO-1與IκBα存在正相關(guān)，occludin與IκBα、P65存在正相關(guān)，其相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)差異；而ZO-1和occludin與磷酸化的P65(ZO-1：P<0.05；occludin：P<0.01)、IκBα(ZO-1：P<0.01)存在負(fù)相關(guān)。

圖7 緊密連接蛋白與NF-κB通路相關(guān)性分析

3 討論

IBD是一種慢性炎癥性疾病。對IBD的傳統(tǒng)治療主要包括水楊酸制劑藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等，雖然可以控制炎癥、調(diào)節(jié)免疫以緩解IBD癥狀，但是存在復(fù)發(fā)率高、緩解率低等缺點。目前，IBD的菌群治療已成為IBD治療十分重要的一部分[12]，而丁酸梭菌屬于益生菌的一種，對IBD的治療也發(fā)揮著作用。利用DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型是IBD的經(jīng)典動物模型。本實驗中，DSS組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、體質(zhì)量下降、大便形狀改變、排血便等結(jié)腸炎表現(xiàn)；光鏡下見結(jié)腸組織出現(xiàn)黏膜結(jié)構(gòu)紊亂、上皮破損和大量免疫細(xì)胞浸潤，表明結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功。

越來越多的研究表明抗生素清腸準(zhǔn)備對于菌群研究和臨床實踐具有重要意義，如偽無菌小鼠模型以及糞菌移植前提倡的抗生素腸道準(zhǔn)備[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌干預(yù)可以改善模型組小鼠體質(zhì)量下降，降低疾病活動度，并緩解小鼠腸黏膜損傷和免疫細(xì)胞浸潤；抗生素清腸預(yù)處理后，丁酸梭菌對于體質(zhì)量、疾病活動度和結(jié)腸病理的緩解更顯著?？股厍迥c組小鼠體質(zhì)量變化不明顯可能與萬古霉素的特殊氣味有關(guān)[15-17]。這導(dǎo)致清腸期間小鼠每日飲用水量下降，體質(zhì)量下降明顯，而恢復(fù)正常飲水或含DSS的飲用水后小鼠體質(zhì)量較前上升或較預(yù)期下降不明顯。

腸上皮細(xì)胞和黏液組成的腸黏膜屏障是腸道抵抗外來病原菌的第一道防線[18]。在炎癥發(fā)生時，病原菌可產(chǎn)生大量促炎因子損傷腸黏膜屏障，繼而誘發(fā)擴大全身炎癥反應(yīng)。而丁酸梭菌具有產(chǎn)丁酸特性，其產(chǎn)生的丁酸為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量，并具備抗炎作用[19]。在本實驗中，DSS組小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達(dá)明顯降低，而丁酸梭菌干預(yù)可有效升高緊密連接蛋白表達(dá)，緩解腸黏膜屏障損傷。除此之外，與未使用抗生素清腸組比，使用抗生素清腸后的DSS模型組腸屏障損傷較輕，丁酸梭菌緩解效果更明顯。這表明丁酸梭菌活菌能夠減輕腸黏膜屏障損傷，并在抗生素清腸的情況下發(fā)揮更明顯的屏障保護作用。有研究提出抗生素清潔腸道后再進(jìn)行糞菌移植，可更有利于益生微生物定植于患者腸道，并利用與病原菌的競爭可達(dá)到更好的糞菌移植效果[20]。本實驗中，抗生素清腸預(yù)處理后丁酸梭菌維持腸屏障作用增強，原因可能為由于抗生素清腸去除了大部分共生菌和條件致病菌，更利于丁酸梭菌的定植和釋放丁酸，從而修復(fù)和維持腸上皮屏障。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞中，該二聚體由NFKB1(P50)和RelA(P65)這兩個分子組成，常被IκB抑制并以非活化的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)[21]。當(dāng)受到某些促炎因子或脂多糖刺激后，抑制劑IκB將被磷酸化繼而降解，釋放出NF-κB復(fù)合體入核，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)和介導(dǎo)炎癥和自身免疫病的作用[22-23]。在AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癌模型中，丁酸梭菌及所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以有效減低小鼠NF-κB的表達(dá)[6, 24]，從而緩解癥狀和調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫。除此之外，在UC患者的結(jié)腸黏膜上皮和黏膜固有層可檢測到NF-κB表達(dá)增加，眾多促炎因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等均可通過增加NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)[25]。與以往研究相符，丁酸梭菌可以降低促炎因子TNF-α和IL-1β表達(dá)，磷酸化的P65及IκBα的表達(dá)同樣被下調(diào)；抗生素清腸預(yù)處理后，雖然磷酸化IκBα表達(dá)在丁酸梭菌組被下調(diào)，但是丁酸梭菌下調(diào)磷酸化P65表達(dá)的效果并不明顯。這個現(xiàn)象說明丁酸梭菌可能通過抑制磷酸化IκBα的表達(dá)，恢復(fù)IκBα的作用，從而達(dá)到抑制NF-κB通路及TNF-α、IL-1β表達(dá)、緩解炎癥的效果；而抗生素清腸預(yù)處理對磷酸化P65的改變不符合預(yù)期，可能因為其加強丁酸梭菌的作用不涉及NF-κB通路，我們還需要進(jìn)一步的NF-κB入核和定位實驗來確認(rèn)這一結(jié)論。NF-κB的活性形式主要為被磷酸化后由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，而本實驗檢測到總蛋白未磷酸化NF-κB在模型組中表達(dá)略有下調(diào)，丁酸梭菌干預(yù)后其改變不明顯，可能由于所提取的是整個細(xì)胞的總NF-κB，變化無明顯趨勢。此外，在本研究中，緊密連接蛋白表達(dá)與NF-κB和IκBα表達(dá)存在正相關(guān)，而與磷酸化的NF-κB和IκBα表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，說明NF-κB通路可能參與黏膜屏障表達(dá)調(diào)控。但是丁酸梭菌是否通過抑制NF-κB通路進(jìn)而發(fā)揮緩解結(jié)腸炎作用，仍需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，在DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，丁酸梭菌可以緩解小鼠大體癥狀及修復(fù)屏障損傷，其機制可能與NF-κB相關(guān)；抗生素清腸預(yù)處理可以增加其療效，但對NF-κB通路的影響不大。本文仍存在一些不足：①本研究所闡述的可能機制僅為相關(guān)性。對于丁酸梭菌是否通過直接影響NF-κB起作用及作用方式并不明確，仍需要更多的實驗加以闡述；②本研究使用的菌株為單一模式菌株，所展現(xiàn)出的作用對宿主可能具有菌株特異性，若要進(jìn)行后續(xù)研究和應(yīng)用需明確菌株。總之，本研究探討了丁酸梭菌對于腸炎小鼠粘膜屏障和NF-κB通路的改變，并初步探討了丁酸梭菌發(fā)揮抗炎作用的機制，但具體直接作用機制仍待進(jìn)一步研究。