UPLC同時測定通宣理肺膠囊中9個成分含量

楊曉璐，張曉珺，王濤

山東省青島市市立醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266000

通宣理肺膠囊是由紫蘇葉、前胡、桔梗、苦杏仁、麻黃、甘草、陳皮、姜半夏、茯苓、枳殼(炒)、黃芩11味中藥制成的中藥復(fù)方制劑，其中麻黃(含鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿)、紫蘇葉(含迷迭香酸)宣肺達(dá)表；前胡(含白花前胡甲素)、杏仁(含苦杏仁苷)、陳皮(含橙皮苷)、桔梗、半夏止咳化痰；茯苓清利生痰之源；枳殼(含柚皮苷、新橙皮苷)寬胸下氣；黃芩(含黃芩苷)防肺氣郁久化熱；甘草(含甘草苷、甘草酸銨)補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥。用于感冒咳嗽、發(fā)表惡寒、鼻塞流涕、頭痛無汗、肢體酸痛等癥狀[1]。《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版以麻黃中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿作為通宣理肺膠囊的質(zhì)量控制指標(biāo)，缺少其他有效成分質(zhì)量控制方法。周軍等[2]建立高效液相色譜法(HPLC)同時測定通宣理肺丸中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、黃芩苷及甘草酸6種成分含量的方法；唐德智[3]建立HPLC測定通宣理肺膠囊中柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷含量的方法；趙磊等[4]建立HPLC同時測定通宣理肺顆粒中黃芩苷和柚皮苷含量的方法。為了提高通宣理肺膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本實驗采用超高效液相色譜法(UPLC)，建立同時測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、橙皮苷、甘草苷、新橙皮苷、黃芩苷、柚皮苷、苦杏仁苷、甘草酸銨9種成分的分析方法，且方法快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為通宣理肺膠囊質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC系統(tǒng)、Empower工作站(Waters公司)；Quintix 224型電子天平(0.01 mg，德國賽多利斯公司)；KQ-250DBG型數(shù)控超聲波清洗器(功率：250 W，頻率：40 kHz，昆山超聲波儀器有限公司)。

對照品鹽酸麻黃堿(批號：171241-201508，純度：99.8%)、鹽酸偽麻黃堿(批號：171237-201208，純度：99.9%)、苦杏仁苷(批號：110820-201607，純度：90.7%)、甘草苷(批號：111610-201607，純度：93.1%)、柚皮苷(批號：110722-201613，純度：94.3%)、橙皮苷(批號：110721-201818，純度：96.2%)、新橙皮苷(批號：111857-201703，純度：99.2%)、黃芩苷(批號：110715-201720，純度：93.5%)、甘草酸銨(批號：110731-201619，純度：93.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院。

苦杏仁(內(nèi)蒙古產(chǎn)，批號：20161016)、麻黃(吉林產(chǎn)，批號：20170814)、甘草(陜西產(chǎn)，批號：20160921)、陳皮(內(nèi)蒙古產(chǎn)，批號：20161002)、枳殼(湖南產(chǎn)，批號：20170524)、黃芩(山東產(chǎn)，批號：20161119)、紫蘇葉(湖南產(chǎn)，批號：20180812)、前胡(甘肅產(chǎn)，批號：20181119)、桔梗(云南產(chǎn)，批號：20171207)、姜半夏(湖南產(chǎn)，批號：20170821)、茯苓(河北產(chǎn)，批號：20181005)，以上飲片均購于南京同仁堂藥業(yè)有限公司責(zé)任公司，經(jīng)青島市市立醫(yī)院吳靜芳副主任藥師鑒定符合《中國藥典》2015年版一部規(guī)定；通宣理肺膠囊由山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.36 g/粒，批號分別為170108、170202、170529、170611、180617、180822，市售藥品；水為娃哈哈純凈水；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純(美國天地公司)；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～3 min，10%A；3～14 min，10%～55%A；14～17 min，55%～60%A；17～23 min，60%A；23～25 min，60%～10%A)；檢測波長：210 nm(0～14 min鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿[5-6]、苦杏仁苷、甘草苷)、278 nm(14～25 min柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.3 mL·min-1；運行時間：25 min。

2.2 溶液的配制

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨適量，用甲醇分別制成含鹽酸麻黃堿23.20 μg·mL-1、鹽酸偽麻黃堿10.8 μg·mL-1、苦杏仁苷24.4 μg·mL-1、甘草苷52.2 μg·mL-1、柚皮苷51.4 μg·mL-1、橙皮苷32.8 μg·mL-1、新橙皮苷35.8 μg·mL-1、黃芩苷188.2 μg·mL-1、甘草酸銨12.2 μg·mL-1的混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，作為對照品溶液備用。

2.2.2供試品溶液的制備 通宣理肺膠囊20粒，取內(nèi)容物，研細(xì)，混合均勻后取約1.0 g[7]，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL[8]，稱定質(zhì)量，置水浴上加熱回流1 h[9]，放至室溫，并用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，3000 r·min-1(離心半徑為13.5 cm)離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液備用。

2.2.3陰性對照溶液制備 按處方比例分別制備缺麻黃、缺陳皮、缺枳殼、缺黃芩、缺杏仁、缺甘草的陰性對照品，并按照2.2.2項下方法處理，即得陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1專屬性考察 取2.2.2項下供試品溶液(批號：170108)、2.2.1項下混合對照品溶液及陰性對照品溶液分別按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果供試品色譜圖中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和甘草酸銨的保留時間與對照品溶液中相應(yīng)色譜峰一致；對照品色譜圖中相鄰峰分離度均大于1.5，對稱因子按鹽酸麻黃堿計為1.01，理論塔板數(shù)按鹽酸麻黃堿計高于6000，見圖1。

注：1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿；3.苦杏仁苷；4.甘草苷；5.柚皮苷；6.橙皮苷；7.新橙皮苷；8.黃芩苷；9.甘草酸銨。圖1 混合對照品溶液、供試品溶液及各陰性對照品溶液UPLC圖

2.3.2線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、1.0、1.2、1.6 μL，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(X，μL)對平均峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

2.3.3精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液1 μL，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄9種有效成分峰面積并計算相應(yīng)的峰面積RSD。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨的峰面積RSD分別為1.76%、1.33%、1.25%、1.85%、1.27%、0.74%、0.99%、1.88%、1.61%，表明儀器精密度良好。

表1 通宣理肺膠囊9種有效成分的回歸方程及線性范圍

2.3.4穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(批號：170108)，室溫放置0、4、6、12、16、18、24 h，按2.1項下色譜條件分析，記錄色譜圖并計算9種有效成分峰面積RSD。結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨的峰面積RSD分別為1.13%、1.88%、1.63%、1.71%、1.25%、1.39%、1.42%、1.46%、1.76%，表明該批號供試品溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性較好。

2.3.5重復(fù)性試驗 取同一供試品(批號：170108)6份，按2.2.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.1項下色譜條件分析，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各組分含量及RSD。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和甘草酸銨平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.14、0.55、1.22、2.62、2.55、1.67、1.75、9.46、0.63 mg·g-1，RSD分別為1.61%、0.77%、1.01%、0.82%、1.19%、1.38%、0.67%、1.12%、0.99%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.6加樣回收率試驗 取供試品(批號：170108)9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分成3組。每組分別精密加入含鹽酸麻黃堿(0.228 mg·mL-1)、鹽酸偽麻黃堿(0.112 mg·mL-1)、苦杏仁苷(0.244 mg·mL-1)、甘草苷(0.522 mg·mL-1)、柚皮苷(0.510 mg·mL-1)、橙皮苷(0.334 mg·mL-1)、新橙皮苷(0.351 mg·mL-1)、黃芩苷(1.896 mg·mL-1)、甘草酸銨(0.126 mg·mL-1)的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.1色譜條件分析，記錄色譜圖，計算各成分的平均加樣回收率及其RSD。結(jié)果見表2。

表2 通宣理肺膠囊9個成分的加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

續(xù)表2

2.4 樣品含量測定

取6批通宣理肺膠囊按2.2.2項下供試品溶液的制備方法處理，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，用外標(biāo)法計算9個有效成分含量。結(jié)果見表3。

3 討論

通宣理肺膠囊含有多味中藥，成分復(fù)雜，本研究考察超聲提取法和加熱回流提取法對有效成分提取的影響，結(jié)果超聲提取法雜質(zhì)成分較多，影響有效成分的測定。回流提取分別考察了提取時間(0.5、1、1.5、2 h)和提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)對含量測定結(jié)果的影響，綜合考慮色譜峰的數(shù)量和響應(yīng)值，最終確采用70%甲醇加熱回流提取1 h作為供試品溶液的制備方法。

本研究運用二極管陣列檢測器對供試品溶液和對照品溶液在190～400 nm波段全波長掃描并結(jié)合參考文獻(xiàn)[10]確定采用210 nm(鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷)、278 nm(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸銨)雙波長分段采集技術(shù)，克服單一波長某些色譜峰峰面積小的缺點，增強(qiáng)了測定方法的專屬性，提高了試驗的準(zhǔn)確度和靈敏性。

表3 通宣理肺膠囊樣品含量測定結(jié)果(n=3)

本實驗流動相考察了乙腈和甲醇作為有機(jī)相，0.1%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液做為水相的等度和梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈做為有機(jī)相時，210 nm波長區(qū)基線漂移小，水相比較0.05%磷酸溶液和0.1%磷酸溶液，發(fā)現(xiàn)兩者對峰形沒有太大影響，但是考慮0.05%磷酸溶液酸度小，更適于柱子的分析使用條件，故綜合色譜峰的分離效果、不對稱度、理論塔板數(shù)等條件，選擇乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脫作為本實驗的流動相。

含量測定結(jié)果可以看出，同一生產(chǎn)廠家的不同批次藥品，9個成分的含量有明顯差異，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿2種成分含量差異較小，兩者總量的RSD為1.74%，但是其他成分各批次之間含量差距較大，這與《中國藥典》2015年版僅以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量作為通宣理肺膠囊的控制指標(biāo)而缺乏對其他成分的監(jiān)管有很大關(guān)系，故建議增加多指標(biāo)成分的含量測定，完善產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格篩選原材料的產(chǎn)地、質(zhì)量，對生產(chǎn)工藝從嚴(yán)把控，提高通宣理肺膠囊的整體質(zhì)量。

本實驗建立的UPLC同時測定通宣理肺膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和甘草酸銨9個有效成分含量，經(jīng)上述線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、耐用性等方法學(xué)驗證，該方法行之有效、結(jié)果準(zhǔn)確、方法簡便有效、重復(fù)性高，可用于通宣理肺膠囊質(zhì)量控制。