甘松乙酸乙酯部位改善低壓和低氧誘導(dǎo)的心肌組織損傷作用及機(jī)制△

孫楊，魏崇莉，趙彤，馬慧萍，景臨林*

1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 第一門診部，甘肅 蘭州 730050；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院 藥劑科/全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050

心臟是專屬耗氧器官，容易遭受高原缺氧的損傷[1]。研究表明，低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心臟損傷的重要因素之一，而抗氧化劑能夠通過抑制氧化應(yīng)激改善心肌損傷[2]。天然抗氧化劑更是具有活性高、毒性低的優(yōu)勢(shì)，近年來備受關(guān)注[3]。甘松NardostachyschinensisBatal.以其干燥根及根莖入藥，具有理氣止痛、開郁醒脾的功效[4]。研究表明，甘松富含倍半萜烯、香豆素、黃酮、多酚和糖苷等化合物，具有抗癲癇、抗焦慮、抗驚厥、抗抑郁、抗瘧、抗氧化、抗炎、抗心肌缺血再灌注損傷、抑菌和改善血糖代謝等廣泛的生物活性[5-7]。課題組前期研究表明，甘松乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract fraction ofN.chinensis，EFNC)具有較好的體外抗氧化活性[8]。本研究考察EFNC對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)的心肌組織氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為其合理應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

EFNC按照課題組報(bào)道的方法制備[8](總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)>150 mg·g-1)；蘆丁(純度>98%)購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定和蛋白定量BCA法試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)等抗體購(gòu)自Abcam公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL) Plus超敏發(fā)光液和聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

FLYDWC50-IIC型低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)；CriterionTM型電泳槽(Bio-Rad公司)；Spectramax i3型多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；Microfuge 22R型冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter公司)；Tissuelyser-24型多樣品組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 動(dòng)物

雄性清潔級(jí)BABL/c小鼠，4周齡，體質(zhì)量(20±2) g，由聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍)2014-0029。

2 方法

2.1 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

將50只清潔級(jí)雄性BABL/C小鼠隨機(jī)分為缺氧模型組、蘆丁組(500 mg·kg-1)和EFNC高(500 mg·kg-1)、中(250 mg·kg-1)、低(125 mg·kg-1)劑量組，每組10只。按照相應(yīng)劑量連續(xù)灌胃給藥5 d，每日1次，缺氧模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液，末次給藥后，將小鼠置于250 mL廣口瓶中(瓶?jī)?nèi)放置5 g鈉石灰用于吸收二氧化碳)，密閉瓶蓋后開始計(jì)時(shí)，以最后一次大喘氣為小鼠死亡指標(biāo)，紀(jì)錄小鼠的存活時(shí)間[9]。

2.2 低壓低氧誘導(dǎo)心肌組織損傷模型

將36只清潔級(jí)雄性BABL/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低壓低氧模型組、蘆丁(500 mg·kg-1)組、EFNC(500 mg·kg-1)組，每組9只，連續(xù)灌胃給藥5 d，對(duì)照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。末次給藥后，除對(duì)照組外，其余小鼠置于低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙中，以10 m·s-1升至海拔8000 m，12 h后再以10 m·s-1將實(shí)驗(yàn)艙中氣壓升至環(huán)境大氣壓。小鼠眼眶取血，隨即脫臼處死，摘除心臟，并按照測(cè)定要求對(duì)其進(jìn)行處理[10]。

2.3 血清中心肌損傷指標(biāo)測(cè)定

每組分別取6只小鼠的血液標(biāo)本，3000 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清。LDH、CK和CK-MB活性按照相關(guān)試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。

2.4 心肌組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

每組分別取6只小鼠的心肌組織，稱定質(zhì)量后按1∶9加入冰0.9%氯化鈉溶液，使用組織研磨儀制備心肌組織勻漿，3500 r·min-1低溫(4 ℃)離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清。MDA、H2O2和GSH水平及SOD、CAT和GSH-Px活性按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

2.5 心肌組織蛋白表達(dá)水平測(cè)定

每組分別取3只小鼠的心肌組織標(biāo)本，稱定質(zhì)量后按1∶9加入RIPA裂解液，使用組織研磨儀制備心肌組織勻漿，12 000 r·min-1低溫(4 ℃)離心15 min(離心半徑為10 cm)，取上清，BCA法計(jì)算蛋白濃度。取等量蛋白樣品上樣，采用SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別加入Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)和β-actin(1∶1000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，室溫孵育2 h，ELC發(fā)光，暗室曝光，灰度值用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測(cè)定。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 EFNC對(duì)常壓密閉缺氧小鼠存活時(shí)間的影響

如圖1所示，與模型組比較，EFNC中、高劑量組小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，具有一定的劑量依賴性。與蘆丁組比較，EFNC高劑量組小鼠存活時(shí)間略長(zhǎng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用EFNC高劑量進(jìn)行低壓低氧實(shí)驗(yàn)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 EFNC對(duì)常壓密閉缺氧小鼠存活時(shí)間的影響

3.2 EFNC對(duì)低壓低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活力的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活力顯著升高(P<0.01)，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以顯著降低LDH、CK和CK-MB的活力(P<0.01)。

表1 EFNC對(duì)低壓低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活性的影響

3.3 EFNC對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中H2O2和MDA含量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌組織中H2O2和MDA水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以顯著降低H2O2和MDA水平(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；圖3同。圖2 EFNC對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中H2O2和MDA含量的影響

3.4 EFNC對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中抗氧化體系的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌組織中GSH水平和SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以顯著提高GSH水平(P<0.01)和SOD、CAT、GSH-P活力(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 EFNC對(duì)高原缺氧小鼠心肌組織中GSH、SOD、CAT和GSH-Px的水平的影響

3.5 EFNC對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，經(jīng)EFNC和蘆丁預(yù)處理可以進(jìn)一步升高缺氧小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 EFNC對(duì)低壓低氧小鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

4 討論

高原是以低壓低氧為特征的極端環(huán)境，暴露其中會(huì)對(duì)包括心臟在內(nèi)的多個(gè)臟器造成損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，低壓低氧模型組小鼠血清中LDH、CK和CK-MB等心臟功能指標(biāo)均升高。血清中LDH、CK和CK-MB水平是反映心肌細(xì)胞膜喪失完整性的定量指標(biāo)，其水平的升高提示低壓低氧影響了心肌細(xì)胞膜的完整性，造成了心肌損傷[11]。有報(bào)道指出，甘松揮發(fā)油能夠降低心肌缺血再灌注大鼠血清中CK-MB和心肌肌鈣蛋白(cTnT)水平，具有較好的心肌保護(hù)作用[12]。與前期的結(jié)果類似，EFNC預(yù)處理能顯著降低低壓低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB水平，提示EFNC能夠維持心肌細(xì)胞膜的完整性，從而減輕心肌細(xì)胞損傷。

高原缺氧誘發(fā)心肌損傷的機(jī)制尚不完全明確。一個(gè)被普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)認(rèn)為，氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮著重要作用[13]。低壓低氧能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和組織中活性氧(ROS)的蓄積[14]，過量的ROS能夠與生物膜中的脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而改變生物膜的功能；也能夠攻擊DNA和蛋白質(zhì)，造成DNA損傷和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成損傷[15]。很多研究證明，通過減輕機(jī)體氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化能力，能夠減輕高原缺氧損傷[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低壓低氧模型組小鼠心肌組織中H2O2和MDA含量較對(duì)照組顯著升高。H2O2是ROS的重要成員，其含量代表了ROS的水平。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量與脂質(zhì)過氧化水平呈正相關(guān)，能夠間接反映組織的損傷程度。而給予EFNC預(yù)處理能夠顯著降低心肌組織中H2O2和MDA水平，說明EFNC能夠通過抑制低壓低氧誘導(dǎo)的自由基蓄積和脂質(zhì)過氧化，緩解心肌組織損傷。

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者[19]。正常生理情況下，Nrf2與Keap1蛋白結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過靶向蛋白酶降解而保持Nrf2的低轉(zhuǎn)錄活性。ROS或親電子基團(tuán)能夠促進(jìn)Nrf2與Keap1中解離，游離的Nrf2從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而調(diào)控包括HO-1在內(nèi)的一系列抗氧化酶基因的表達(dá)[20]。HO-1是一種限速酶，可催化血紅素降解為一氧化碳、膽綠素和Fe2+等內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[21]。最新研究表明，甘松能夠通過激活Nrf2/HO-1途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低壓低氧條件下，心肌組織中ROS的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致Nrf2和HO-1水平上調(diào)，通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路應(yīng)激性的抵抗低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。經(jīng)EFNC預(yù)處理能夠進(jìn)一步上調(diào)Nrf2和HO-1的表達(dá)，提示EFNC對(duì)低壓低氧誘導(dǎo)心肌組織損傷的保護(hù)作用可能部分是通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑介導(dǎo)的。

綜上所述，EFNC對(duì)高原缺氧小鼠心肌組織的保護(hù)作用機(jī)制與其清除過量自由基、激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑、緩解機(jī)體氧化應(yīng)激有關(guān)。