基于網(wǎng)絡藥理學的藤茶黃酮類成分體內(nèi)潛在作用靶點及可能干預疾病研究△

孫曉媛，李洪祥，馬培，宋顏君，高宇，許利嘉*，肖培根

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥物研究所，北京 100193；3.中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193

藤茶是我國云南、廣東、廣西、江西、貴州、福建、湖南、湖北等地和東南亞一些國家常用的傳統(tǒng)飲品[1]，為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang的莖葉[2]。藤茶味甘、淡，性涼，具有清熱利濕、平肝降壓、活血通絡的功效[3-4]。現(xiàn)代藥理研究表明，藤茶具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、調(diào)血脂、保肝等多種藥理活性[5]。藤茶在民間應用比較廣泛，但臨床研究相對較少。黃酮類化合物為藤茶的主要活性成分，其中雙氫楊梅素含量最高[6]。所以目前對于藤茶的研究主要集中在雙氫楊梅素上。藤茶的其他黃酮類成分如楊梅素、楊梅苷等均發(fā)揮多種藥理作用[7]。因此，進一步探討藤茶中黃酮類成分的藥理作用，發(fā)掘藤茶治療疾病的潛能對其研究及開發(fā)尤為重要。

網(wǎng)絡藥理學結(jié)合生物信息學、結(jié)構(gòu)生物學等技術(shù)，強調(diào)對信號通路多成分、多靶點、多途徑調(diào)節(jié)作用的綜合分析，闡釋中藥及復方的作用靶點及相關(guān)生物過程和通路[8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，通過對藤茶黃酮類成分潛在作用靶點及其涉及的生物過程和通路的富集分析，推測藤茶可能干預的疾病類型，為藤茶的實驗研究及進一步開發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 藤茶化學成分數(shù)據(jù)庫的建立

以“藤茶”“顯齒蛇葡萄”“the Vine tea”“Ampelopsisgrossedentata”作為關(guān)鍵詞，在CNKI、萬方、PubMed數(shù)據(jù)庫中搜索目前藤茶已經(jīng)分離到的化合物，并在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)、網(wǎng)絡藥理學在線數(shù)據(jù)庫(TCMID)等數(shù)據(jù)庫中檢索復核。

1.2 基于吸收、分布、代謝、排泄(ADME)的藤茶中黃酮類成分篩選

主要以口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)作為基本藥動學參數(shù)指標。本研究選取OB≥30%和DL≥0.18作為活性化合物的篩選標準[9]。其中，OB值使用OBioavail 1.1計算機模型進行計算，DL值采用谷本相似度進行計算，通過Dragon軟件(http：//www.talete.mi.it/index.htm)計算。采用ChemDraw軟件繪制活性化合物分子結(jié)構(gòu)式，以MDL SDfile.(*sdf)文件格式保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 潛在作用靶點的識別與確定

利用PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，收集1.2項下得到的活性成分的CID編號及其BioAssay Results項下的活性測試數(shù)據(jù)。在BioAssay Results選項下以cvs格式導出該化合物的生物學測試文件，潛在作用靶點納入標準：1)總體活性評估為“active”“inclusive”或“unspecified”；2)潛在作用靶點的物種來源為human。

1.4 基因本體(GO)生物功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將黃酮類成分的潛在作用靶點利用R語言軟件計算，得到GO和KEGG富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)預測結(jié)果，繪制氣泡圖。

1.5 藤茶中黃酮類成分可能干預疾病的類型分析

基因注釋工具Metascape(https：//metascape.org/gp/index.html)整合了大量的轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學、代謝組學等數(shù)據(jù)庫信息。其中DisGeNET數(shù)據(jù)庫，收錄了人類疾病相關(guān)的基因與突變位點信息的數(shù)據(jù)庫[10]。將1.3獲得的潛在作用靶點利用Metascape計算與人類疾病的相關(guān)性，設定每條目最少覆蓋3個基因，最小富集值為1.5，顯著性閾值為0.01，進行分析。

1.6 網(wǎng)絡構(gòu)建及其可視化

運用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，對藤茶黃酮類成分的潛在作用靶點進行網(wǎng)絡分析與可視化。這些網(wǎng)絡由節(jié)點(node)與邊(edge)組成，節(jié)點代表化合物、靶點、信號通路等，邊表示分子間的相互作用，即節(jié)點之間的鏈接[11]。其中具有定量屬性的參數(shù)度(degree)表示該節(jié)點可以連接其他節(jié)點的個數(shù)或邊數(shù)，度值越大說明節(jié)點所連接的邊越多，在網(wǎng)絡中的作用也更大。

2 結(jié)果

2.1 藤茶中黃酮類成分篩選

通過文本挖掘方法及檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，得到目前藤茶中已分離的化合物136個。以DL≥0.18、OB≥30%作為活性化合物篩選標準，篩選后得到11個化合物，分別為雙氫楊梅素、橙皮素、山柰酚、芹菜素、楊梅黃酮-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷、芹菜素、槲皮素、蘆丁、(2R，3S)-丁烷-1，2，3，4-四醇、1，2，3-三羥基苯。由于藤茶總黃酮為其主要活性部位，本研究進一步選取9種黃酮類化合物做后續(xù)分析。藤茶黃酮類成分及其ADME信息見表1。

2.2 藤茶黃酮類成分潛作用靶點分析及注釋

藤茶中9個黃酮類化合物調(diào)控靶點數(shù)目見圖1，各化合物重合靶點以紫線連接，顯著富集在同一GO、KEGG生物功能條目的靶點被認為有生物功能上的重合度(P<0.05)，以藍線連接，其中楊梅素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷沒有對應的潛在作用靶點。因此，最終得到8個黃酮類活性成分，對應430個潛在作用靶點(圖2)。由圖2可知，藤茶黃酮類化合物的潛在作用靶點協(xié)同發(fā)揮藥理作用，體現(xiàn)出藤茶多成分、多靶點的藥理特征。

表1 藤茶黃酮類成分及其ADME信息

圖1 藤茶黃酮類成分潛在作用靶點數(shù)目

注：外圈為藤茶中酮黃類成分；內(nèi)圈為各化合物的潛在作用靶點。圖2 藤茶黃酮類成分潛在作用靶點的相互作用

2.3 生物過程與通路富集分析

基于R軟件分析黃酮類成分的所有潛在作用靶點，GO富集的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞成分(CC)結(jié)果見圖3(只展示前10個最主要的條目)。藤茶黃酮類成分的潛在作用靶點主要在突觸后膜、核染色體、氯離子通道、γ-氨基丁酸(GABA)受體等部位發(fā)揮作用。其分子功能主要有蛋白激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、轉(zhuǎn)錄因子、核受體、GABA受體配體門控的陰離子通道等活性；靶點所參與的生物過程主要有調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、對氧化應激反應、轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控、對有毒物質(zhì)的反應等。綜合以上GO分析可知，藤茶黃酮類成分的潛在作用靶點所具有的調(diào)節(jié)蛋白激酶、抗炎、抗氧化特征等均與腫瘤、精神類疾病、代謝病等的病理相關(guān)，如乳腺癌[12]、抑郁癥[13]、2型糖尿病[14]等。

為了探索藤茶黃酮類成分所調(diào)控的信號通路，將所有靶點蛋白映射到 KEGG數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)信號通路，結(jié)果見表3(P<0.05)。主要的信號通路有癌癥通路、內(nèi)分泌抵抗、FoxO信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等。這些信號通路已被證實與腫瘤、精神類疾病、代謝類疾病、神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。

2.4 靶點相關(guān)疾病的分析

采用基因注釋工具Metascape對所有黃酮類成分的潛在作用靶點做DisGeNET分析，計算靶點聚集在每個疾病條目中的數(shù)目和顯著性，并以-lgP值做熱圖分析，結(jié)果見圖4。排名前20種的疾病主要有腫瘤(乳腺腫瘤、肝腫瘤)、精神疾病(抑郁)、肝病(慢性酒精中毒、藥物不良反應、藥物誘導肝損傷、肝纖維化)、心血管病(高血壓、心肌肥大、心肌病、動脈粥樣硬化)、腦病(缺血再灌注損傷、腦缺血、阿爾茨海默病)、代謝病(糖尿病、胰島素抵抗、肥胖)、痛覺過敏、腎損傷等。覆蓋總黃酮多數(shù)靶點的主要成分依次是芹菜素、山柰酚、槲皮素、楊梅素和橙皮素。以上結(jié)果與藤茶的傳統(tǒng)功效吻合。藤茶平肝降壓、活血通絡的功效可能對肝損傷、心腦血管疾病具有潛在作用。目前藤茶中的多數(shù)活性成分已有報道，芹菜素可以降低糖尿病大鼠的血糖水平，增強機體抗氧化能力[15]；山柰酚可以通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信號通路，促進人乳腺癌SUM190細胞凋亡，顯示出抗腫瘤活性[16]；雙氫楊梅素在抗癌、抗氧化、保肝等方面有顯著療效，并且對神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)绨柎暮Ｄ?、帕金森癥、抑郁癥等具有神經(jīng)保護作用[17]。

注：GeneRatio表示富集到目的通路的基因數(shù)占基因列表包含基因集總基因比例；下同。圖3 藤茶黃酮類成分潛在作用靶點GO富集結(jié)果

表3 藤茶黃酮類成分潛在作用靶點KEGG富集結(jié)果

圖4 藤茶黃酮類成分疾病富集結(jié)果

2.5 多層次數(shù)據(jù)整合分析藤茶黃酮類成分的潛在作用靶點及可能干預疾病

2.5.1成分-靶點網(wǎng)絡 收集活性成分相關(guān)的DisGeNET中前20個疾病的靶點蛋白，對其化合物-靶點進行可視化處理(圖5)。成分-靶點網(wǎng)絡由219個節(jié)點(8個化合物與211個靶點蛋白)以及489條邊組成，其中平均度(節(jié)點與其他節(jié)點之間的連接數(shù))每個化合物為54.3，每個靶點為2.3。其中4個化合物可作用于≥50個靶點(自定義為靶點度K，A8 K=150，A1 K=133，A4 K=76，A7 K=63)，表明這些黃酮類成分是藤茶發(fā)揮治療作用的主要物質(zhì)基礎。雙氫楊梅素為藤茶的主要活性成分[7]。目前對藤茶中活性成分的報道主要集中在雙氫楊梅素上，但本研究分析結(jié)果未顯示雙氫楊梅素占主導地位，分析原因可能是雙氫楊梅素的活性還未被充分研究與開發(fā)，或者因為其藥效溫和，沒有得到廣泛關(guān)注；而槲皮素、芹菜素、山柰酚、楊梅素在植物中分布廣泛，因此相關(guān)的研究和報道較多，富集到的靶點較多。

2.5.2靶點-疾病網(wǎng)絡 為探索藤茶黃酮類成分的主要靶點蛋白，將藤茶的靶點蛋白映射到 DisGeNET數(shù)據(jù)庫前20個相關(guān)疾病，并構(gòu)建了靶點-疾病網(wǎng)絡(圖6)。靶點-疾病網(wǎng)絡由231個節(jié)點(211個靶點與20個疾病)和568個邊組成。其中 50%以上的靶蛋白(124/211)可作用于多個疾病，表明這些靶點蛋白可以參與多種疾病的調(diào)節(jié)。其中按照度值排名前6的靶點為TNF、前列腺素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(PTGS2)、白細胞介素-1β(IL-1β)、雌激素受體1(ESR1)、蛋白激酶B1(AKT1)、腫瘤蛋白P53(TP53)，度值分別為18、15、14、9、8、8。這些靶點可能為藤茶黃酮類成分的主要靶點蛋白。

2.6 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

由圖6可知，這些靶點蛋白主要與腫瘤、代謝病、神經(jīng)精神類疾病、肝損傷有關(guān)。所以推測藤茶可能對這些疾病有改善作用。以乳腺腫瘤和抑郁癥為例，構(gòu)建藤茶黃酮類成分與乳腺腫瘤，藤茶黃酮類成分與抑郁癥的“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，更好地闡釋藤茶黃酮類成分對疾病的治療作用。如圖7、8所示，乳腺腫瘤相關(guān)的靶點蛋白主要集中在細胞凋亡、雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路等，與抑郁癥相關(guān)的靶點主要集中在多巴胺信號通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

注：菱形代表化合物；圓圈代表靶點蛋白。圖5 藤茶黃酮類成分-靶點網(wǎng)絡

注：方形代表疾??；圓圈代表靶點蛋白。圖6 藤茶黃酮類成分靶點蛋白-疾病網(wǎng)絡

注：紫色代表成分；綠色代表靶點；紅色代表疾病。圖7 藤茶成分-靶點-乳腺腫瘤網(wǎng)絡

注：黃色代表成分；藍色代表靶點；紅色代表疾病。圖8 藤茶成分-靶點-抑郁癥網(wǎng)絡

3 討論

本研究建立了藤茶化學成分數(shù)據(jù)庫，使用ADME標準篩選后，最終獲取已有活性報道的藤茶黃酮類化合物8個，對應的潛在作用靶點430個。表明藤茶黃酮類成分通過多成分、多靶點的特性協(xié)同發(fā)揮藥理作用。

通過對藤茶黃酮類成分的潛在作用靶點進行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，其主要涉及癌癥通路、內(nèi)分泌抵抗、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路等，推測藤茶黃酮類成分干預腫瘤、神經(jīng)精神類疾病、肝損傷、代謝類疾病。通過構(gòu)建“成分-靶點”“靶點-疾病”以及藤茶黃酮類成分與乳腺腫瘤、抑郁癥2個“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，進一步闡釋藤茶黃酮類成分對腫瘤、神經(jīng)精神類疾病、肝損傷、代謝類疾病的干預作用。

乳腺癌是一種雌激素依賴性腫瘤，目前認為，雌激素在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此內(nèi)分泌治療已經(jīng)成為治療乳腺癌的重要手段之一[18]。由圖7可知，有61個靶點在藤茶抗乳腺腫瘤中發(fā)揮作用，如度值較大的2個靶點蛋白ESR1、ESR2。雌激素與雌激素受體(ESR1、ESR2)結(jié)合可以誘導腫瘤細胞生長、增殖，促進惡性腫瘤的形成[19]。網(wǎng)絡中度值最高的活性成分槲皮素可通過調(diào)節(jié)雌激素代謝基因的表達，減少高致癌性雌激素代謝物的產(chǎn)生，發(fā)揮對乳腺癌的治療作用[20]。細胞凋亡過程的異常與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。p53是一種腫瘤抑制基因，通過激活線粒體介導凋亡途徑，激活Caspase和Bcl-2蛋白家族，介導細胞凋亡[21]。TNF和p53參與對細胞凋亡的調(diào)節(jié)。TNF-α與其配體腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)結(jié)合后，并召集信號轉(zhuǎn)導分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白(TRADD)募集，活化TNF受體相關(guān)因子，導致核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)激活，從而抑制TNF-α誘導的細胞凋亡[22]。研究表明，山柰酚可以通過調(diào)節(jié)TNF介導的信號通路抑制人卵巢癌細胞凋亡[23]。上述結(jié)果與文獻報道吻合，因此藤茶黃酮類成分可能通過ESR1、ESR2、p53、TNF等靶點蛋白調(diào)控雌激素信號通路、p53和TNF信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

抑郁被認為是與特定大腦區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元損傷相關(guān)的神經(jīng)精神疾病。PTGS2又稱環(huán)加氧酶(COX-2)是前列腺素E2(PGE2)合成的限速酶。研究表明COX-2在大鼠抑郁模型的海馬齒狀回(DG)中高度表達，可引發(fā)神經(jīng)炎癥、氧化應激和神經(jīng)細胞凋亡，造成神經(jīng)細胞損傷，引起抑郁癥的發(fā)生。抑制COX-2可有效保護神經(jīng)細胞，抵抗抑郁癥的發(fā)生[24]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達可影響神經(jīng)元的可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)的合成，是抑郁癥治療中至關(guān)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子[25]。PI3K和Akt是調(diào)節(jié)細胞周期的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，在PI3K/Akt信號通路中至關(guān)重要。在小鼠抑郁模型中觀察到，抑郁癥的發(fā)生可能與PI3K/Akt介導的BDNF表達水平下降有關(guān)[26]。Akt還參與氧化應激，氧化應激與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、動脈硬化等多種疾病的發(fā)病有關(guān)，研究表明，Akt參與過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞的凋亡過程[27]。TNF-α的增多可激活NF-κB，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NF-κB的激活產(chǎn)生大量活性氧、興奮性毒素和促炎性細胞因子，可能導致神經(jīng)元的凋亡[28]。于旭東等[29]研究表明，在強迫游泳實驗中，雙氫楊梅素可以發(fā)揮抗抑郁樣作用，并且改善應激引起的小鼠學習記憶損傷。槲皮素可以提高H2O2誘導帕金森病PC-12細胞的存活率，并且使細胞中乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶顯著降低，說明槲皮素可以抑制由氧化應激誘導的PC-12細胞的凋亡[30]?；诜治鼋Y(jié)果和實驗研究，提示藤茶黃酮類成分主要通過PTGS2、Akt、TNF等靶點蛋白作用于PI3K/Akt信號通路、TNF等炎癥與氧化應激通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，可能對抑郁癥、帕金森、阿爾茨海默病等有治療作用。但是目前對藤茶發(fā)揮神經(jīng)保護作用的相關(guān)文獻報道比較少，可以進一步開展實驗研究。

肝損傷是多種肝臟疾病的癥狀。在慢性濫用酒精的情況下，細胞色素酶P450 2E1(CYP2E1)上調(diào)，將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛。CYP2E1產(chǎn)生的活性氧通過激活NF-κB，增加促炎細胞因子的水平、氧化應激水平，導致酒精性肝損傷[31]。芹菜素通過下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α表達對缺血-再灌注損傷大鼠發(fā)揮保肝作用[32]。雙氫楊梅素可以通過抗炎和抗氧化應激作用，抑制肝細胞凋亡來保護乙酰氨基酚(APAP)損傷的小鼠肝臟[33]。以上結(jié)果說明，藤茶黃酮類成分可能通過CYP2E1、IL-1β、TNF等靶點對酒精性肝損傷、缺血-再灌注肝損傷具有治療作用。

糖尿病是一種以血糖升高為主要癥狀的代謝類疾病。2型糖尿病主要與胰島素抵抗有關(guān)。PI3K/Akt通路屬于胰島素信號轉(zhuǎn)導中重要通路之一。正常生理狀況下，胰島素與受體結(jié)合后可通過活化PI3K/Akt信號通路啟動胰島素通路，維持血糖平衡、脂類代謝，當胰島素分泌不足后，PI3K/Akt信號通路受到抑制，會導致血糖、血脂代謝紊亂，進一步促進胰島素抵抗，導致糖尿病的發(fā)生[34]。吳瑛等[35]研究表明，藤茶提取物雙氫楊梅素可通過上調(diào)p-Akt、成纖維生長因子21(FGF21)、磷酸化的AMP依賴的蛋白激酶(p-AMPK)的表達從而改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗。芹菜素能夠改善大鼠血糖、血脂，降低胰島素抵抗，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)[34]。以上文獻報道證實了藤茶黃酮類成分可能通過PI3K、Akt作用于PI3K/Akt信號通路發(fā)揮降血糖作用。

藤茶最初在民間被作為茶飲廣泛應用，久而久之也顯示出藥用價值。民間多用藤茶治療咽喉腫痛、喉舌生瘡等疾病。這些疾病大都與炎癥的發(fā)生有關(guān)，同時民間也用藤茶解酒毒、治療糖尿病等[1-2]。這也與藤茶抗氧化、保肝、降血糖、調(diào)血脂等藥理作用相吻合。本研究通過對潛在作用靶點的富集分析，推測藤茶對腫瘤、神經(jīng)精神類疾病、肝損傷、代謝類疾病具有治療作用(表4)。

表4 藤茶傳統(tǒng)應用、現(xiàn)代應用及本文預測應用

綜上所述，藤茶黃酮類成分通過TNF、PTGS2、IL-1β、ESR1、AKT1、TP53等關(guān)鍵靶點蛋白，參與調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、氧化應激、炎癥、雌激素信號通路等，推測對腫瘤、神經(jīng)精神類疾病、肝損傷、代謝類疾病具有治療作用。此外，藤茶對神經(jīng)精神類疾病的潛在作用報道較少，可以進一步研究和開發(fā)。