外源氯化膽堿對(duì)秋葵幼苗鹽和干旱脅迫的緩解效應(yīng)

戚名揚(yáng)，趙慧云，王春艷，胡來寶，葉玉秀，王尊欣，陳新紅，周 青，王飛兵

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

秋葵(AbelmoschusesculentusL.)，別名黃秋葵、羊角豆，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物。秋葵含有豐富維生素、蛋白質(zhì)、類黃酮、氨基酸等多種營養(yǎng)成分，是一種營養(yǎng)豐富的新型保健型蔬菜，有很大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。高鹽、干旱環(huán)境是限制植物生長和產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一，當(dāng)植物受到高鹽、干旱等非生物脅迫時(shí)，植物的形態(tài)及生理生化方面會(huì)發(fā)生一系列的響應(yīng)變化。干旱會(huì)導(dǎo)致葉片和嫩莖萎蔫，氣孔開度減小甚至關(guān)閉；鹽害抑制植物組織、器官的生長和分化。逆境也會(huì)影響植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜透性增大，降低光合速率，導(dǎo)致大量電解質(zhì)和非電解質(zhì)外滲，膜脂組分發(fā)生改變，膜蛋白的組分和活性受到影響，進(jìn)而影響植物的生理代謝。植物在長期的進(jìn)化及適應(yīng)過程中，逐步形成了一系列抵御外界不良環(huán)境變化的機(jī)制[1-2]。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，會(huì)快速感知和主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境的變化，通過胞間和胞內(nèi)逆境信息的傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)，做出積極的應(yīng)答反應(yīng)。

氯化膽堿(Choline Chloride，CC)，作為一類新型的植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)業(yè)發(fā)展中有著廣泛的應(yīng)用，具有低毒、進(jìn)入土壤無污染等特點(diǎn)。以往研究表明，葉面噴施氯化膽堿可以提高煙草、水稻以及玉米幼苗的抗寒性[3-5]，保護(hù)低溫弱光對(duì)黃瓜葉片細(xì)胞膜和光合機(jī)構(gòu)的傷害[6]，緩解干旱脅迫對(duì)小麥、玉米幼苗的傷害[7-9]，增強(qiáng)黃瓜、菠菜幼苗的耐鹽性[10-11]。氯化膽堿浸種處理可以提高煙草種子活力、恢復(fù)劣變玉米和棉花種子的生活力[12-13]。適宜的氯化膽堿浸種可以緩解鹽脅迫對(duì)水稻種子萌發(fā)的抑制，明顯提高發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)[14]。對(duì)于外源施加氯化膽堿是否緩解鹽、干旱脅迫以及對(duì)秋葵發(fā)芽率、幼苗生長和生理代謝的影響還未見報(bào)道。本研究以臺(tái)灣五福為供試秋葵品種，通過盆栽試驗(yàn)研究了鹽、干旱脅迫下外源氯化膽堿對(duì)秋葵幼苗生長和生理生化代謝的影響，為氯化膽堿在農(nóng)業(yè)上的進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試秋葵品種為臺(tái)灣五福。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在淮陰工學(xué)院江蘇省“作物學(xué)”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科溫室進(jìn)行。分別設(shè)置發(fā)芽率試驗(yàn)和苗期試驗(yàn)，其中發(fā)芽率試驗(yàn)參照王永慧等[15]研究方法，分析秋葵種子在NaCl、甘露醇脅迫下的發(fā)芽率試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置蒸餾水(CK)、100 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1NaCl + 200 g·L-1氯化膽堿、100 mmol·L-1甘露醇、100 mmol·L-1甘露醇 + 200g·L-1氯化膽堿，共5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。每份秋葵材料分別挑選50粒飽滿大小一致的種子，用5%次氯酸溶液消毒5 min后，再用蒸餾水沖洗3次，將晾干后的種子每50粒均勻播于以雙層濾紙作為發(fā)芽床的發(fā)芽盒(長、寬為10.8 cm，高為5.8 cm)。將發(fā)芽盒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，向發(fā)芽盒中每天分別加入2～3 mL上述試驗(yàn)配置的溶液和等量蒸餾水，以胚根長0.2 mm作為種子發(fā)芽標(biāo)志，第5天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)。

秋葵鹽、干旱脅迫處理苗期盆栽試驗(yàn)方法參照Zhai等[16]的方法。采用直徑為20 cm的花盆種植秋葵。選取大小均勻、籽粒飽滿的秋葵種子，播種在花盆中，共3次重復(fù)。

基于Zhai等[16]的方法進(jìn)行鹽處理試驗(yàn)，用1/2霍格蘭營養(yǎng)液充分灌溉每個(gè)植株，待秋葵幼苗第3片真葉完全展開，然后進(jìn)行鹽脅迫和氯化膽堿處理。設(shè)置對(duì)照(CK)，用含有200 mmol·L-1NaCl的1/2霍格蘭營養(yǎng)液每2 d灌溉1次，每次200 mL；氯化膽堿處理(CC)，用含有200 mmol·L-1NaCl和200 g·L-1氯化膽堿的1/2霍格蘭營養(yǎng)液每2 d灌溉1次，每次200 mL。處理28 d，觀察植株生長情況；當(dāng)秋葵長至三葉一心時(shí)，將植株從花盆中取出，小心去凈泥土，稱取植株的鮮重；將植株放入烘箱，80℃，24 h烘干，稱取植株干重。

基于Zhai等[16]方法進(jìn)行干旱處理試驗(yàn)，用1/2霍格蘭營養(yǎng)液充分灌溉每個(gè)植株，待秋葵幼苗第3片真葉完全展開，然后進(jìn)行干旱脅迫和氯化膽堿處理。設(shè)置對(duì)照(CK)，秋葵植株干旱處理，用含有20%濃度的PEG溶液噴施秋葵植株葉片，每2 d噴施1次，至每片葉片上滴水為宜；氯化膽堿試驗(yàn)(CC)秋葵植株干旱處理同時(shí)用200 g·L-1氯化膽堿的1/2霍格蘭營養(yǎng)液噴施秋葵植株葉片，每2 d噴施1次，至每片葉片上滴水為宜；干旱處理42 d后，將植株從花盆中取出，小心去除泥土，稱取植株的鮮重；將植株放入烘箱，80℃，24 h烘干，稱取植株干重。

1.3 鹽、干旱脅迫下生理生化指標(biāo)的測(cè)定

以鹽處理14 d或干旱處理 28 d的秋葵盆栽苗葉片為材料，參考Zhai等[16]、Wang等[17]和季合生[18]方法測(cè)定秋葵植株葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性、過氧化物酶(POD)活性、脯氨酸含量、相對(duì)水含量、可溶性糖含量、葉綠素含量、丙二醛(MDA)含量和過氧化氫(H2O2)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。P< 0.05或P< 0.01被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著或極顯著的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源氯化膽堿顯著提高秋葵植株的耐鹽性和抗旱性

鹽脅迫抑制秋葵種子發(fā)芽，發(fā)芽率35.75%，添加外源氯化膽堿后，秋葵種子發(fā)芽率是78.28%；干旱脅迫抑制秋葵種子發(fā)芽，發(fā)芽率是42.54%，添加外源氯化膽堿后，秋葵種子發(fā)芽率是84.85%(圖1)。這些結(jié)果表明，添加外源氯化膽堿能夠顯著緩解鹽、干旱脅迫對(duì)秋葵種子萌發(fā)的抑制作用。

在正常條件下，對(duì)照秋葵植株(CK)和氯化膽堿處理的秋葵植株(CC)均表現(xiàn)較好的生長狀態(tài)；氯化膽堿處理的秋葵植株(CC)的鮮重和干重分別比對(duì)照(CK)提高了11%和7%(圖2A)。

鹽處理28 d后，如圖2B所示，對(duì)照的秋葵植株(CK)死亡，氯化膽堿處理的秋葵植株(CC)表現(xiàn)出較好的生長狀態(tài)，鮮重和干重分別比對(duì)照秋葵植株(CK)提高了176%和106%。

干旱處理42 d后，如圖2C所示，對(duì)照的秋葵植株(CK)死亡，氯化膽堿處理的秋葵植株(CC)的生長狀態(tài)較好，其鮮重和干重分別比對(duì)照秋葵植株(CK)提高了171%和141%。

* 和 ** 分別表示P < 0.05和P < 0.01水平的差異顯著。下同。

圖2 在鹽、干旱脅迫下外源氯化膽堿對(duì)秋葵植株生長的影響

2.2 外源氯化膽堿提高秋葵植株ROS清除系統(tǒng)能力

鹽、干旱脅迫下，氯化膽堿處理的秋葵植株(CC)的SOD、CAT、APX和POD活性顯著高于對(duì)照(CK)(圖3)。結(jié)果表明外源氯化膽堿可以激活鹽、干旱脅迫下活性氧(ROS)清除系統(tǒng)，從而增強(qiáng)秋葵植株的耐鹽性和抗旱性。

圖3 在鹽、干旱脅迫下外源氯化膽堿對(duì)秋葵植株SOD、CAT、APX和POD活性的影響

2.3 外源氯化膽堿改變秋葵植株抗性相關(guān)物質(zhì)含量

鹽、干旱脅迫下，氯化膽堿處理的秋葵植株(CC)的脯氨酸、相對(duì)水、可溶性糖和葉綠素含量顯著高于對(duì)照(CK)，MDA和H2O2含量顯著低于對(duì)照(CK)(圖4)。

圖4 在鹽、干旱脅迫下外源氯化膽堿對(duì)秋葵脯氨酸、相對(duì)水、可溶性糖、葉綠素、MDA和H2O2含量的影響

3 討論

氯化膽堿是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠提高植物體在高鹽、干旱等逆境環(huán)境的抗逆性[3-12]。但是對(duì)于外源施加氯化膽堿對(duì)秋葵植株在鹽、干旱脅迫下的幼苗生長和生理代謝的影響的研究還未見報(bào)道。發(fā)芽率和苗期盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，外源氯化膽堿能夠減輕鹽分、干旱脅迫對(duì)秋葵植株造成的傷害，從而增強(qiáng)秋葵植株的耐鹽性和抗旱性。

在鹽、干旱脅迫處理下，脯氨酸積累可以提高植物的耐鹽性和抗旱性[19]。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此認(rèn)為脯氨酸含量的積累能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，從而提高植物耐鹽性和抗旱性[16-17,20]。并且，脯氨酸可以保護(hù)細(xì)胞的膜完整性[16-17,20-21]，作為一種分子伴侶穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源氯化膽堿顯著提高秋葵植株的脯氨酸積累，從而通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，以及保護(hù)秋葵植株的膜完整性提高其耐鹽性和抗旱性。

在鹽分脅迫下，ROS的形成和清除之間的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，ROS大量累積，對(duì)植物DNA、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物造成損傷引起氧化脅迫。植物體內(nèi)的有關(guān)ROS清除系統(tǒng)酶的活性會(huì)增強(qiáng)，從而清除過量的ROS，使得細(xì)胞的氧化損傷減少或避免[20,23-24]。SOD、CAT、APX、POD是植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除超氧自由基的主要酶類，起緩解和避免膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化作用，能維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，從而提高植物抗逆性[16-17,20-21,24-25]。本研究中，鹽、干旱脅迫處理下，經(jīng)過外源氯化膽堿處理的秋葵植株的ROS清除系統(tǒng)的SOD、CAT、APX、POD活性顯著提高。與此一致的表型是，鹽、旱脅迫下，外源氯化膽堿處理的秋葵植株的H2O2顯著降低。表明外源氯化膽堿通過激活ROS清除系統(tǒng)，降低H2O2含量，進(jìn)而提高秋葵植株的耐鹽性和抗旱性。

研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，脯氨酸可以作為一種有效的ROS清除劑來清除單線態(tài)氧和羥基氧[16-17]。同時(shí)，在鹽、旱脅迫下，脯氨酸可以保護(hù)PSII的光合功能[16-17,20]。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用和逆境脅迫反應(yīng)等生理過程的重要細(xì)胞器[25]，其含量反映了植物進(jìn)行光合作用的能力。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽、旱脅迫下，外源氯化膽堿處理的秋葵植株具有較高的葉綠素含量，具有較高的光合活性。葉綠素含量的差異可能是秋葵植株鮮重和干重提高的主要原因。

植物膜脂過氧化作用的產(chǎn)物是MDA，而MDA是植物衰老生理和抗性生理研究中的一個(gè)常用指標(biāo)[20-21,24-27]。高濃度的MDA會(huì)加劇細(xì)胞膜損傷，從而降低植物的耐鹽性[17,25-27]。本研究中，外源氯化膽堿處理的秋葵植株積累較低的MDA含量，表明秋葵植株的細(xì)胞膜損傷程度較低，耐鹽性和抗旱性顯著提高。

4 結(jié)論

本研究表明外源氯化膽堿顯著增強(qiáng)秋葵植株的耐鹽性和抗旱性。外源氯化膽堿增加秋葵植株的脯氨酸、相對(duì)水、可溶性糖和葉綠素含量，降低MDA和H2O2含量。積累的脯氨酸通過維持細(xì)胞滲透平衡，保護(hù)膜完整性，激活ROS清除系統(tǒng)，緩解鹽、干旱脅迫帶來的傷害，從而顯著提高了秋葵植株的耐鹽性和抗旱性。