一種用于去除病理切片中水珠的方法

武振汝，陳夢(mèng)琳，李 麗，石毓君，步 宏,2

近年隨著我國(guó)醫(yī)學(xué)科研水平的提高，病理技術(shù)在科學(xué)研究中越來(lái)越受到重視，由于科研病理樣本來(lái)源及染色復(fù)雜，往往不能像病理科一樣完全使用全自動(dòng)染色機(jī)染色，多采用手工染色。病理切片制作過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)脫水液更換不及時(shí)，或封片劑開(kāi)封后保存不當(dāng)，造成脫水不足，或封片劑過(guò)干，使封片劑不能完全覆蓋組織而造成蓋玻片與組織之間出現(xiàn)細(xì)小間隙影響折射率，產(chǎn)生類似“水珠”一樣的間隙，嚴(yán)重影響閱片和采圖，成為不合格的病理切片。日常工作中此類情況往往成批出現(xiàn)，如重新制片將造成時(shí)間和試劑的嚴(yán)重浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多次實(shí)踐摸索，取得較好效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集有封片問(wèn)題的病理切片2 302張，二甲苯、無(wú)水乙醇均購(gòu)自成都科隆公司，封片劑、載玻片均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，蓋玻片購(gòu)自江蘇世泰公司。

1.2 方法(1)問(wèn)題切片脫膠：將問(wèn)題切片浸泡在二甲苯中2天，待蓋玻片松動(dòng)后手動(dòng)取下蓋玻片，繼續(xù)在二甲苯中浸泡3 h，待切片上的膠完全脫掉后從二甲苯中取出，置于通風(fēng)櫥中待二甲苯完全揮發(fā)。(2)切片水化：將無(wú)水乙醇用雙蒸水準(zhǔn)確配制成85%乙醇1缸，95%乙醇2缸，再準(zhǔn)備無(wú)水乙醇2缸。將脫膠完全的切片依次浸入無(wú)水乙醇2缸，95%乙醇2缸，85%乙醇1缸中；免疫組化染色切片每缸2 min；HE或PAS染色切片每缸5 s行乙醇梯度水化。(3)切片再次脫水透明：切片經(jīng)85%乙醇1缸，95%乙醇2缸，無(wú)水乙醇2缸梯度脫水；免疫組化染色切片每缸2 min；HE或PAS染色切片每缸5 s；二甲苯中透明2 min。(4)切片再次封片，透明后的切片直接用封片劑封固，待封片劑凝固后顯微鏡下采圖或數(shù)字病理切片掃描儀掃片。

2 結(jié)果

所有切片經(jīng)過(guò)脫膠、水化、又脫水后制作的切片HE染色胞核清晰，胞質(zhì)鮮亮；經(jīng)PAS和免疫組化染色，切片仍保留原來(lái)顏色，無(wú)脫色現(xiàn)象，“水珠”消退，切片制作合格(圖1、2)。

圖1 A.小鼠肝臟PAS染色(處理前)，細(xì)胞核周邊出現(xiàn)水珠(箭頭)，黑色不透明；B.同一張切片經(jīng)過(guò)處理再次封片(處理后)，小鼠肝臟PAS染色，細(xì)胞核上黑色水珠消失 圖2 A.小鼠肝臟免疫組化Glutamine Synthetas染色(處理前)，陽(yáng)性位置出現(xiàn)多個(gè)黑色水珠(箭頭)；B.同一張切片小鼠肝臟免疫組化Glutamine Synthetas染色(處理后)，胞核清晰

3 討論

制作一張合格的切片是病理實(shí)驗(yàn)研究的前提，但在實(shí)際病理切片制作過(guò)程中難免會(huì)出現(xiàn)脫水液更換不及時(shí)，或者由于天氣原因，特別是夏季空氣濕度大，造成乙醇脫水濃度不達(dá)標(biāo)，使病理切片脫水不足；或者封片劑開(kāi)封過(guò)久液體揮發(fā)，導(dǎo)致封片劑不能完全覆蓋組織，組織切片與蓋玻片之間出現(xiàn)細(xì)小縫隙，出現(xiàn)類似“水珠”的空隙，嚴(yán)重影響閱片效果和采圖質(zhì)量。雖然在病理切片制作中封片步驟有很多方法避免“水珠”和氣泡的產(chǎn)生[1-2]，但均未能完全避免，特別是科研病理樣本來(lái)源復(fù)雜，有人和動(dòng)物來(lái)源的區(qū)別，動(dòng)物來(lái)源樣本往往又經(jīng)過(guò)各種實(shí)驗(yàn)處理，從而造成病理切片制作過(guò)程中脫水和封片步驟的質(zhì)控困難，往往會(huì)出現(xiàn)成批次的病理切片封片問(wèn)題。如果將問(wèn)題切片重新制作，會(huì)造成時(shí)間、樣本、試劑和耗材的嚴(yán)重浪費(fèi)。另外，有的動(dòng)物模型難以建立，樣本十分珍貴。為了補(bǔ)救封片中出現(xiàn)的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室借鑒文獻(xiàn)報(bào)道[3]，經(jīng)長(zhǎng)期摸索和多次實(shí)驗(yàn)將問(wèn)題切片脫膠后水化，再次脫水及時(shí)封固，有效地解決了水珠的問(wèn)題。

本研究室長(zhǎng)期從事科研病理實(shí)驗(yàn)，在日常工作中難免出現(xiàn)病理切片封片問(wèn)題。出現(xiàn)切片封片問(wèn)題，通常的做法有兩種：(1)若切片比較大，封片瑕疵不嚴(yán)重時(shí)，則可避開(kāi)封片瑕疵區(qū)域采圖和閱片。(2)若切片非常小或者封片瑕疵嚴(yán)重時(shí)，則丟棄切片，重新制作。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)用數(shù)字病理切片掃描儀行全切片數(shù)字掃片時(shí)，無(wú)論封片瑕疵有多小均會(huì)影響掃片結(jié)果的清晰度，所以數(shù)字病理切片掃描儀要求病理切片必須完整清晰，不能有任何瑕疵。因此制作一張高質(zhì)量切片，需要多次操作，但有些樣本較小，例如類器官石蠟塊，全部切完不足30張，當(dāng)出現(xiàn)封片問(wèn)題時(shí)只能從問(wèn)題切片進(jìn)行補(bǔ)救，不能棄之重新培養(yǎng)類器官。本研究室經(jīng)過(guò)多次嘗試和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)脫膠處理再封片的方法在補(bǔ)救問(wèn)題切片時(shí)非常有效，值得臨床推廣應(yīng)用。