豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白體外表達(dá)研究現(xiàn)狀

王愛靜，和彥良，宋 妮，由海波，孟慶森，陳超陽，李真光,2*

(1.華威特(江蘇)生物制藥有限公司，江蘇泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是目前已知的最小DNA病毒之一，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬病毒[1]，該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布。目前，已發(fā)現(xiàn)3種類型的豬圓環(huán)病毒，包括豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)。1974年，發(fā)現(xiàn)PCV1能夠感染豬腎細(xì)胞系(PK-15)，但由于患病豬自身可以對該病毒產(chǎn)生抗體，所以認(rèn)為該病毒是非致病性的病毒[2]。至1991年，在加拿大首次從斷奶仔豬中分離到PCV2，其感染后可引起仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、先天性震顫(Congenital tremors,CT)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、繁殖障礙等多種疾病，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)[3]。2000年，郎洪武等[4]首次在我國發(fā)現(xiàn)并報(bào)道PCV2的存在，隨即多個(gè)地區(qū)出現(xiàn)了PCV2的相關(guān)報(bào)道，感染率和發(fā)病率逐漸升高，流行情況也呈上升趨勢，嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，然而迄今尚未有相關(guān)報(bào)道闡明PCVAD確切的致病機(jī)制。PCV3是2016年在美國新發(fā)現(xiàn)的一種病毒，臨床癥狀表現(xiàn)為豬皮炎腎病綜合征(PDNS)和多器官炎癥等，近年已在美國、意大利、中國和波蘭[5]分離到該病毒。

1 PCV2的概述

PCV2是影響?zhàn)B豬業(yè)最重要的病原體之一，特別是在亞洲國家，不同日齡及性別均會感染該病毒，以哺乳期和斷奶仔豬最易感，特別是5周齡～12周齡仔豬；患病豬會出現(xiàn)體重減輕、淋巴結(jié)腫大、腹瀉、黃疸、呼吸窘迫等臨床癥狀[6]。PCV2感染能夠破壞易感動物的免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，從而誘發(fā)多種病毒或細(xì)菌的混合感染或繼發(fā)感染，給疾病的診斷和治療帶來極大的困難[7]。PCV2的感染與傳播途徑很多，如可以通過被感染動物的排泄物以及呼吸、唾液等進(jìn)行傳播，懷孕母豬感染PCV2后可通過胎盤垂直傳播感染仔豬；研究發(fā)現(xiàn)，公豬人工成功感染PCV2后，在其精液中可檢測到PCV2的DNA；鳥類、嚙齒動物也可以攜帶并傳播病毒，因此該病毒的廣泛傳播途徑加大了防控的難度，疫苗防控成為了不二之選。通過對世界各地不同PCV2的序列分析顯示，核苷酸序列同源性可達(dá)93%，核苷酸多樣性為3.5%[8]，目前其基因可分為5大基因型，分別是PCV 2a、PCV 2b、PCV 2c、PCV 2d、PCV 2e。中國目前存在的基因型有PCV 2a、PCV 2b、PCV 2d、PCV 2e以及其他未確認(rèn)的基因型,并存在2個(gè)及2個(gè)以上基因型交叉感染的情況[9]。

PCV2是20面體對稱的單鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒粒子直徑約為17 nm[10]，由1 767個(gè)～1 768個(gè)核苷酸組成，編碼11個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)，其主要2個(gè)開放性閱讀框?yàn)镺RF1(945個(gè)氨基酸，位置在51-995位)、ORF2(702個(gè)～705個(gè)氨基酸，位置在1 030/1033/1034至1734/1735位，是編碼參與病毒復(fù)制(自我復(fù)制)的酶蛋白、免疫原性衣殼蛋白和病毒致病相關(guān)蛋白[11]。由PCV2 ORF2編碼的衣殼蛋白(Cap蛋白)是病毒唯一結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒主要的免疫原性蛋白，基因長度為702 bp,分子質(zhì)量約為27.8 ku[12]，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體。在PCV1毒株和PCV2毒株的進(jìn)化分析上，由于ORF2基因較短且在兩個(gè)毒株之間存在明顯的差異，因此該基因常被用作區(qū)別兩個(gè)毒株的主要分子標(biāo)識。此外，Cap蛋白存在多態(tài)性，在PCV2病毒吸附過程中起重要作用，同時(shí)在裝配動力學(xué)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上對PCV2也有一定的影響[13]。不僅如此，Cap蛋白上擁有PCV2的主要保護(hù)性抗原表位，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此是基因工程疫苗研發(fā)的理想抗原。本文對Cap蛋白的體外表達(dá)以及相關(guān)疫苗研制進(jìn)行了闡述，以期為新型疫苗的研發(fā)提供參考。

2 Cap蛋白表達(dá)系統(tǒng)

2.1 大腸埃希氏菌原核表達(dá)系統(tǒng)

大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)是用于表達(dá)重組蛋白的一種技術(shù)，由于其具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。大腸埃希氏菌原核表達(dá)系統(tǒng)可以直接表達(dá)外源蛋白，分為可溶性和不可溶性(包涵體)蛋白2種表達(dá)形式，為了后續(xù)處理使用方便，大多數(shù)都傾向于蛋白的可溶性表達(dá)[14]。然而，ORF2基因核定位信號(nuclear localization signal，NLS)上稀有密碼子的5′端能夠?qū)е滦律嚯逆溸^早終止，從而阻礙Cap蛋白的產(chǎn)生。對此，Marcekova等在ORF2兩端附加一個(gè)聚組氨酸標(biāo)簽，并將基因進(jìn)行截短優(yōu)化以及人為加入啟動子，來提高Cap蛋白在大腸埃希氏菌中的可溶性表達(dá)。然而，表達(dá)的蛋白不能夠自組裝成為病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)[15]。Wu P C等[16]將一個(gè)全長的ORF2基因在5′端附近優(yōu)化4個(gè)密碼子，優(yōu)化后的ORF2基因編碼的Cap蛋白能夠自組裝成VLPs，在大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)。

研究表明，一些可溶性較高的蛋白質(zhì)與包涵體蛋白融合后，可促進(jìn)包涵體蛋白以可溶性形式表達(dá)或提高可溶性蛋白的穩(wěn)定性，如利用多聚組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)等具有標(biāo)簽的融合蛋白，通過聚合酶鏈反應(yīng)與目的基因進(jìn)行融合，通過誘導(dǎo)表達(dá)提高目的蛋白的可溶性。此外，插入的標(biāo)簽蛋白因其具有標(biāo)記性，為目的蛋白進(jìn)一步純化、濃縮和檢測提供了保障，同時(shí)也提高了目的蛋白的穩(wěn)定性[17]。然而，有的標(biāo)簽存在于目的蛋白上會影響試驗(yàn)結(jié)果，所以Wu P C等[16]使用上述優(yōu)化后的PCV2 ORF2核苷酸序列和含有His標(biāo)簽的pET24a(+)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合后，使用聚合酶鏈反應(yīng)從pET24a(+)載體中剔除了T7和His標(biāo)簽序列，在大腸埃希氏菌中成功表達(dá)了不含融合標(biāo)簽的Cap蛋白，經(jīng)檢驗(yàn)蛋白多以可溶性的形勢存在于上清中且具有良好的免疫原性，為制備PCV2亞單位疫苗尤其是病毒顆粒樣(VLP)疫苗奠定了基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)已上市的商品化PCV2亞單位疫苗大多是采用大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)的Cap蛋白為靶蛋白，經(jīng)與相應(yīng)佐劑混合乳化后制成，如易邦生物科技有限公司和普萊柯生物工程股份有限公司研制的PCV2基因工程亞單位疫苗。該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白成本低，能夠穩(wěn)定表達(dá)，易純化獲得，但表達(dá)形式的不確定性以及目的蛋白上存在標(biāo)簽增加了進(jìn)一步試驗(yàn)難度。

2.2 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)

酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于表達(dá)量高、能夠完整的表達(dá)分泌外源蛋白并可對外源蛋白進(jìn)行加工修飾、表達(dá)的蛋白質(zhì)不含有內(nèi)毒素、易于純化、可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、能夠廣泛用于工業(yè)及醫(yī)藥生產(chǎn)，是僅次于大腸埃希氏菌的表達(dá)系統(tǒng)[18]。目前，最常用的兩種酵母菌表達(dá)菌株有畢赤酵母和釀酒酵母。最早用于工業(yè)及醫(yī)藥生產(chǎn)的釀酒酵母，因其不能在生產(chǎn)中高密度發(fā)酵，所以主要作為益生菌來使用；而畢赤酵母克服了該缺點(diǎn)，不僅能夠進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，而且產(chǎn)量高。最主要的優(yōu)勢是可以分泌大分子的外源蛋白，而且能夠穩(wěn)定表達(dá)不被截?cái)啵虼耸艿綇V泛的關(guān)注。

謝景毅[19]將優(yōu)化密碼子后的PCV2 ORF2基因插入pPICZα A表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33宿主，篩選獲得高效表達(dá)的菌株，經(jīng)發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵液上清中PCV2 Cap蛋白的產(chǎn)量達(dá)到總蛋白定量比例的23.5%。在仔豬模型上進(jìn)行了以PCV2 Cap蛋白為抗原的體內(nèi)免疫試驗(yàn)，結(jié)果表明，PCV2 Cap蛋白能夠在畢赤酵母中分泌表達(dá)且具有良好的免疫原性，其核定位信號的缺失不影響PCV2 Cap蛋白的免疫性能。高田[20]利用釀酒酵母的不同表達(dá)元件構(gòu)建了多種重組表達(dá)載體，獲得了能夠分泌表達(dá)重組PCV2 Cap蛋白的釀酒酵母菌株；通過該菌株表達(dá)制備的PCV2 VLP經(jīng)驗(yàn)證具有良好的免疫原性。釀酒酵母表達(dá)VLP能夠激發(fā)機(jī)體黏膜免疫，相對安全性較高，具有口服免疫的優(yōu)勢，為潛在新型PCV2亞單位口服疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

2.3 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)

乳酸菌在自然界中分布廣泛，可黏附在人和動物體內(nèi)黏膜表面，如口腔黏膜、消化道黏膜等，在食物、土壤和水體中也有存在。以乳酸菌作為基因工程受體菌表達(dá)外源蛋白有顯著的優(yōu)勢。首先，乳酸菌作為益生菌，不會對人體產(chǎn)生致病性；其次，遺傳背景清晰且抗原性較弱，乳酸菌中Usp45蛋白是目前已知唯一可檢測出的自身分泌蛋白，避免了微生物自身蛋白對外源蛋白表達(dá)的干擾；再者，通過構(gòu)建的重組植物乳桿菌，能夠作用于機(jī)體黏膜，產(chǎn)生黏膜免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性反應(yīng)[21]，而且通過口服的形式給藥，在操作上比注射給藥簡便。最近的20年間，以乳酸菌作為載體攜帶預(yù)防或治療藥物得到了廣泛的重視。

Wang L等[22]利用乳酸菌表達(dá)的PCV2 Cap蛋白制備口服型PCV2活載體疫苗，通過模擬腸道環(huán)境以及口服途徑免疫小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，超過90%的乳酸桿菌能夠在模擬的腸道環(huán)境中存活，小鼠口服后能夠產(chǎn)生PCV2特異性抗體且小鼠腸道中能夠存活至少11 d。孫博[23]將構(gòu)建的pAMJ399-Cap重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)獲得可溶性表達(dá)的Cap蛋白，并通過建立小鼠模型，口服免疫進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，免疫組小鼠sIgA和IgG水平均高于對照組，且IL-4和IFN-γ兩種細(xì)胞因子呈明顯升高趨勢，表明構(gòu)建的重組乳酸乳球菌可穩(wěn)定表達(dá)PCV2 Cap蛋白，不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，也可以產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，并具有良好的安全性。乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與酵母菌表達(dá)系統(tǒng)類似，均能夠口服刺激黏膜免疫，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，免疫途徑難度相對較低，且安全有效，但口服后，由于腸胃環(huán)境特殊可能會影響免疫時(shí)間。

2.4 病毒載體表達(dá)系統(tǒng)

目前已有許多國內(nèi)外學(xué)者通過應(yīng)用病毒活載體體外表達(dá)系統(tǒng)對PCV2 Cap蛋白進(jìn)行研究，該表達(dá)系統(tǒng)具有宿主范圍廣、表達(dá)外源基因效率高等特點(diǎn)。其中以腺病毒、桿狀病毒、偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒以及豬瘟病毒等的研究相對較多，且取得了許多突破性進(jìn)展。

2.4.1 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中無法復(fù)制，所以不會感染人和動物，具有良好的生物安全性且種屬特異性較高。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，可對在表達(dá)哺乳動物、禽類等外源蛋白時(shí)出現(xiàn)的糖基化、甲基化做進(jìn)一步翻譯后修飾，更充分的暴露出病毒的抗原決定簇等結(jié)構(gòu)，使得被免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體[24],達(dá)到預(yù)防及保護(hù)作用。目前，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在PCV2疫苗研制和生產(chǎn)中得到了應(yīng)用，如勃林格殷格翰動物保健公司的PCV2疫苗和英特威先靈葆雅動物保健公司的PCV2疫苗，均以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Cap蛋白作為疫苗抗原，制備的疫苗有效降低仔豬體內(nèi)的病毒含量，減少淋巴組織的損傷，降低死亡率，實(shí)現(xiàn)了對動物的保護(hù)作用[25-26]。

朱鵬等[27]將優(yōu)化后的PCV2 ORF2基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至sf9細(xì)胞，得到含有PCV2 ORF2基因的重組桿狀病毒，通過培養(yǎng)感染桿狀病毒的sf9細(xì)胞獲得其表達(dá)分泌的重組蛋白；對該重組蛋白進(jìn)行驗(yàn)證并作為抗原對小鼠進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示，重組蛋白能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，具有較好的免疫原性，該試驗(yàn)為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Cap的亞單位疫苗的研制提供依據(jù)。此外，除昆蟲細(xì)胞外，一些試驗(yàn)利用家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(silkworm-BEVS)表達(dá)了重組Cap蛋白，并建立了從蛹中純化重組Cap蛋白的簡單3步法，即洗滌劑萃取、硫酸銨沉淀和陰離子交換柱層析。排阻色譜法分析和電鏡觀察表明，純化的重組Cap蛋白形成了與原始病毒相似的VLP。此外，利用家蠶產(chǎn)生的VLP免疫小鼠后產(chǎn)生抗PCV2的特異性抗體[28]。該研究結(jié)果表明，家蠶系統(tǒng)是生產(chǎn)PCV2 VLPs的一種方式，并將有希望開發(fā)一種可靠和經(jīng)濟(jì)有效的PCV2疫苗。

2.4.2 腺病毒表達(dá)載體 腺病毒表達(dá)載體現(xiàn)已廣泛用于學(xué)術(shù)研究、制藥、基因工程疫苗研發(fā)等，其優(yōu)勢在于宿主范圍廣、能夠?qū)⒏鞣N外源基因轉(zhuǎn)移到不同靶細(xì)胞或組織中且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，以及表達(dá)的外源蛋白易于制備和純化[29-30]。李德龍[31]通過優(yōu)化ORF2基因，將2種基因調(diào)控元件克隆到腺病毒載體，構(gòu)建重組腺病毒載體，該試驗(yàn)提高了重組Cap蛋白的表達(dá)量，減少抗原免疫劑量，而且重組腺病毒載體疫苗的免疫效果也有所提高，為豬群PCV2感染防控奠定了基礎(chǔ)。許晗等[32]在pAdShttle-CMV載體中插入PCV2 ORF2和耶爾森氏菌侵襲素C端(InvC)兩個(gè)基因序列，構(gòu)建的重組穿梭載體并與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)并檢驗(yàn)感染重組腺病毒的HEK239細(xì)胞，結(jié)果表明，重組腺病毒能夠表達(dá)PCV2 Cap蛋白和InvC，其TCID50可達(dá)10-9.32，該試驗(yàn)為PCV2重組腺病毒活載體疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)條件。

2.4.3 偽狂犬病病毒表達(dá)系統(tǒng) 以偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)為載體的活疫苗優(yōu)點(diǎn)較多：具有多個(gè)可供外源基因插入的位點(diǎn)；由于免疫期較長，可持續(xù)表達(dá)外源基因；該病毒載體具有較強(qiáng)的復(fù)制能力，能夠大量表達(dá)外源蛋白且安全性較高，因此受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Chi J N等[33]使用同源重組技術(shù)將PCV2 ORF2基因插入PRV中并將PRV gE上游基因進(jìn)行替換，使用免疫熒光和Western blot分析表明在病毒復(fù)制過程中表達(dá)分泌了Cap蛋白，且經(jīng)電子顯微鏡觀察表明Cap蛋白自組裝成VLPs。用純化后的VLP作為抗原免疫小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生明顯的特異性反應(yīng)。結(jié)果表明，基于重組PRV表達(dá)分泌的VLP可以作為亞單位疫苗的候選。目前，豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)VP2蛋白、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白都以PRV為載體成功表達(dá)，為各病毒的單苗及聯(lián)苗的制備奠定基礎(chǔ)。在臨床上，PCV2、PRV、PPV經(jīng)常伴有混合感染，因此，鄭曉輝等[34]將PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因通過與口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A蛋白連接，應(yīng)用連接后的整段基因替換PRV gE基因構(gòu)建重組PRV載體，該重組病毒能夠在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)分泌PPV VP2蛋白及PCV2 Cap蛋白，該試驗(yàn)對生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

3 小結(jié)

PCVAD作為一種豬源多發(fā)性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，其傳播途徑多種多樣，不僅不同基因型之間交叉感染，而且還會與其他病原菌之間出現(xiàn)并發(fā)或繼發(fā)感染。所以該病的預(yù)防和防控受到了世界各國的廣泛重視，并且由于PCV2基因型的不斷變異，為檢測和預(yù)防加大了難度。Cap蛋白是PCV2唯一的衣殼蛋白，所以，基于Cap蛋白研制的檢測技術(shù)以及基因工程亞單位疫苗成為了國內(nèi)外科研人員的首選，通過不同表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行表達(dá)，如大腸埃希氏菌原核表達(dá)系統(tǒng)，酵母菌真核表達(dá)系統(tǒng)，以及病毒活載體的桿狀病毒、偽狂犬病病毒表達(dá)系統(tǒng)等都已經(jīng)獲得了一定的成果，甚至在市面上已經(jīng)存在相關(guān)的檢測試劑盒或亞單位疫苗，但是現(xiàn)存的進(jìn)口診斷試劑及疫苗由于價(jià)格昂貴，導(dǎo)致在國內(nèi)并不能普及，所以研發(fā)價(jià)格低且生產(chǎn)工藝簡單的PCV2 Cap蛋白檢測試劑盒及亞單位疫苗依然迫在眉睫。