弓形蟲入侵宿主分子機制研究進展

張小涵，丁瑩瑩，馬知川，杜銘怡，于克杰，桑曉宇，馮 穎，陳 冉，楊 娜

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110866)

剛地弓形蟲((ToroplasmagondiiNicolle & Manceaux)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲，幾乎可以感染包括人在內(nèi)的所有溫血脊椎動物，引起人獸共患弓形蟲病[1]。通常情況下，大多數(shù)免疫功能健全的感染者呈無臨床癥狀的隱性感染。然而，當(dāng)弓形蟲感染艾滋病患者、惡性腫瘤患者、器官移植患者等免疫系統(tǒng)受損的個體時，會導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病甚至死亡。同時，弓形蟲病也是新生兒在子宮內(nèi)感染的疾病，也是導(dǎo)致妊娠期婦女流產(chǎn)的一個重要原因。此外，弓形蟲還可在家畜及寵物間進行傳播，引起患畜流產(chǎn)、死胎，給畜牧業(yè)帶來較為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。由于弓形蟲宿主范圍廣、感染率高，并可與宿主良性共存，使其成為世界上最成功的人獸共患寄生性原蟲之一[2]。弓形蟲病已引起醫(yī)學(xué)界和畜牧行業(yè)廣泛的高度重視，成為一種不容小覷的全球性公共衛(wèi)生問題。蟲體的入侵是弓形蟲致病的一個重要環(huán)節(jié)，對其分子機制的解析有利于弓形蟲病的檢測方法以及相關(guān)疫苗和治療藥物的開發(fā)。

1 滑行運動與入侵

弓形蟲不具備偽足、鞭毛和纖毛等運動細(xì)胞器，其運動方式與阿米巴原蟲和大多數(shù)單細(xì)胞生物截然不同。弓形蟲依靠一種獨特的基質(zhì)依賴型運動，稱為滑行運動，其動力由位于質(zhì)膜下方的肌動-肌球蛋白系統(tǒng)所提供[3]?；羞\動將弓形蟲以每秒1 μm～2 μm的速度向前推進[4]，可使蟲體積極主動地穿過宿主體內(nèi)的多種生物屏障，快速穿透各種類型的有核細(xì)胞，以利于蟲體的遷移和入侵。

1.1 滑行運動機制

滑行運動的過程是以肌動-肌球蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架以及相關(guān)蛋白質(zhì)的分泌和轉(zhuǎn)位的協(xié)調(diào)配合來實現(xiàn)的[5]。肌動蛋白在真核細(xì)胞中含量豐富，以球狀單體形式存在，通常情況下聚合成微絲。在弓形蟲體內(nèi)，肌動蛋白微絲是極具活力的，新絲的形成可能會限制運動速率[6]。利用細(xì)胞松弛素(肌動蛋白聚合抑制劑)對弓形蟲的運動進行抑制的試驗表明，肌動蛋白絲在弓形蟲的運動中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。弓形蟲的運動性還依賴于一種叫TgMyoA的小肌球蛋白的動力，敲除編碼TgMyoA的基因可使蟲體失去運動性而無法入侵宿主細(xì)胞[8]，這種小肌球蛋白作為復(fù)合物的一部分錨定在內(nèi)膜復(fù)合物上[9]。在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中，蟲體頂端分泌的黏附素可作為跨膜蛋白聚集在蟲體表面，并與宿主細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合，以促進蟲體在宿主細(xì)胞表面的固定。肌球蛋白沿著肌動蛋白絲的驅(qū)動向前滑行，引起黏附素和受體復(fù)合物后向易位，使得寄生蟲沿基質(zhì)方向前進并入侵宿主細(xì)胞。

1.2 滑行體的組成、裝配和錨定

滑行運動是由滑行體驅(qū)動的，滑行體作為一個配置精密、高度協(xié)調(diào)的“運動機器”將蟲體頂端分泌的黏附素轉(zhuǎn)移到后方，以此推動弓形蟲進入宿主細(xì)胞[10]?；畜w位于弓形蟲的原生質(zhì)膜和內(nèi)膜復(fù)合物(inner membrane complex,IMC)之間，由肌球蛋白A(myosin A,MyoA)、一條肌球蛋白輕鏈(myosin light chain 1,MLC1)和兩條必需輕鏈1、2(essential light chains,ELC1 and ELC2)以及滑行相關(guān)蛋白(gliding-associated protein,GAP)組成[11]。MyoA作為弓形蟲運動中的發(fā)動機，其頭部區(qū)域可將ATP水解釋放的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為能夠沿著肌動蛋白定向運動的動能[12-13]，MLCI與MyoA的頸部區(qū)域結(jié)合可發(fā)揮杠桿臂的作用將這種動能轉(zhuǎn)化為運動。MLC1的保守氨基端延伸可將MyoA送到質(zhì)膜內(nèi)的作用部位，再通過與GAP45的結(jié)合錨定在內(nèi)膜復(fù)合物上。GAP45在弓形蟲胞漿中產(chǎn)生，其N末端通過?；饔缅^定在質(zhì)膜上，而C末端則錨定在內(nèi)膜復(fù)合物上[14]。在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞期間，GAP45聚集MyoA到內(nèi)膜，促使MLC1-MyoA連接到內(nèi)膜上，通過形成一個橋來保持運動過程中蟲體表膜的完整性[15]。GAP50作為內(nèi)膜復(fù)合物上一種完整的糖膜蛋白，在弓形蟲滑行運動中起著不可或缺的作用[15]。MyoA、MLC1和GAP45首先組裝形成一個可溶性復(fù)合物，然后通過GAP45與GAP50的銜接將MyoA-MLC1-GAP45復(fù)合物錨定到內(nèi)膜復(fù)合物上[16]，此過程是由GAP45的磷酸化來完成的。同時，有研究表明GAP50的N末端糖基化也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14]。

2 弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程

弓形蟲入侵是一個連續(xù)且復(fù)雜的過程，需要多種分泌細(xì)胞器及其相關(guān)蛋白和因子的協(xié)調(diào)配合，以一種動態(tài)機制入侵靶細(xì)胞[17]。弓形蟲首先尋找合適的的靶細(xì)胞并對其細(xì)胞膜進行勘察，直至識別到合適的位點時才開始入侵。當(dāng)弓形蟲與宿主細(xì)胞表面接觸時，蟲體會伸出類錐體，隨后微線體蛋白經(jīng)類錐體向外分泌大量微線體蛋白來介導(dǎo)蟲體的黏附[18]。同時，棒狀體頸部蛋白開始分泌并被運輸至蟲體表膜。隨后，微線體蛋白與棒狀體頸部蛋白一起聚集于蟲體頂端并與宿主細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，在蟲體頂端與宿主細(xì)胞膜之間形成可移動的連接區(qū)域[19]，使得蟲體頂端黏附于宿主細(xì)胞。蟲體在肌-動球蛋白馬達(dá)所產(chǎn)生的動力下進行滑行運動，并迅速擠過移動連接區(qū)域進入宿主細(xì)胞。隨著蟲體向前滑移，移動連接向蟲體后方移動，當(dāng)蟲體完全進入后，移動連接會在蟲體后方被菱形蛋白酶(rhomboid protein,ROM)作用水解而導(dǎo)致融合，其內(nèi)陷部分在宿主細(xì)胞內(nèi)形成納蟲空泡。一旦蟲體被納蟲空泡完全包裹，致密顆粒就會受到調(diào)控開始分泌蛋白質(zhì)并釋放至納蟲空泡的腔內(nèi)[20]，致密顆粒蛋白的分泌有利于蟲體從宿主細(xì)胞獲取營養(yǎng)。納蟲空泡膜起初的成分與宿主細(xì)胞膜成分幾乎相同，伴隨蟲體在納蟲空泡內(nèi)不斷分泌相關(guān)蛋白與一些因子對其進行修飾，一些原有的宿主細(xì)胞膜成分被迅速排出。這一過程可使納蟲空泡避免宿主細(xì)胞溶酶體的裂解作用及酸化作用，從而起到隔離保護的作用。含有寄生蟲的空泡缺乏正常內(nèi)吞空泡的內(nèi)容物，也不能在初級吞噬體中找到的典型決定因子，使得蟲體躲避了宿主融合機制的識別，進而完成了一次完美的“隱秘”入侵[17]。蟲體在其內(nèi)以二分裂的方式進行繁殖，當(dāng)繁殖到一定數(shù)量時，納蟲空泡膜破裂，蟲體逸出，開始尋找新的合適的宿主細(xì)胞以預(yù)備下一輪入侵。

3 弓形蟲入侵相關(guān)蛋白分子

弓形蟲的入侵不是由一種蛋白質(zhì)或者單一機制完成的，而是由許多蛋白質(zhì)分子依靠多種調(diào)控機制協(xié)調(diào)合作實現(xiàn)的，其中表面抗原、微線體蛋白、棒狀體蛋白、致密顆粒蛋白等在弓形蟲主動入侵宿主細(xì)胞的過程中均發(fā)揮重要作用。

3.1 表面抗原

弓形蟲表面抗原(surface antigens,SAGs)主要介導(dǎo)蟲體對宿主細(xì)胞的初步識別與黏附。在已發(fā)現(xiàn)的SAGs家族中，與蟲體入侵和毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)主要有SAG1、SAG2和SAG3[21]。其中，SAG1是弓形蟲速殖子表達(dá)量最高的一種表面抗原，其含量高達(dá)弓形蟲速殖子蛋白的3%～5%。SAG1以糖磷脂酰化形式錨定在宿主細(xì)胞膜表面，介導(dǎo)蟲體與宿主細(xì)胞之間的黏附過程，幫助蟲體進行入侵[22]。此外，SAG2和SAG3可以協(xié)助SAG1，使得蟲體迅速進入宿主細(xì)胞。已有研究表明，特異性抗SAG2多克隆抗體可有效地抑制弓形蟲速殖子的體外入侵效率[23]；而且，當(dāng)對SAG3基因進行敲除后，發(fā)現(xiàn)蟲體對宿主細(xì)胞的入侵效率也明顯降低。由此證明，SAG2和SAG3對弓形蟲的初始入侵過程具有重要意義。

3.2 微線體蛋白

微線體是弓形蟲頂復(fù)合器的一個重要組成部分，其合成與分泌的微線體蛋白(microneme proteins,MICs)在蟲體入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)蟲體與宿主細(xì)胞表面接觸時，蟲體頂端會分泌大量的微線體蛋白，對宿主細(xì)胞進行識別與黏附作用并形成移動連接結(jié)構(gòu)。

微線體蛋白在分泌、運輸與釋放的過程中，常以復(fù)合體的形式發(fā)揮作用[24-25]。MIC1、MIC4和MIC6可形成復(fù)合體，MIC1和MIC4可結(jié)合宿主細(xì)胞并與黏附復(fù)合體的某些特性有關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，MIC1是一種乳糖特異性凝集素，可能與靶細(xì)胞表面的含乳糖糖蛋白受體結(jié)合，由此促進蟲體與宿主細(xì)胞黏附[27]。MIC3和MIC8也能形成一種黏附復(fù)合體，在蟲體黏附和入侵過程中釋放到蟲體表面[26]。MIC3是復(fù)合物中的黏附成分，其具有一個凝集素結(jié)構(gòu)域，可以識別宿主細(xì)胞表面的糖蛋白。第3種黏附復(fù)合體由MIC2和MIC2相關(guān)蛋白或M2AP組成。MIC2具有2種黏附因子(Ⅰ型結(jié)構(gòu)域和類凝血酶樣結(jié)構(gòu)域)，負(fù)責(zé)宿主細(xì)胞膜的錨定與結(jié)合[28]。在蟲體與宿主細(xì)胞相接觸時，MIC2/M2AP復(fù)合物被釋放到蟲體表面并與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合。

微線體蛋白復(fù)合體主要具備以下幾種性質(zhì)：首先，每個復(fù)合體中都含有一個跨膜蛋白，負(fù)責(zé)對宿主細(xì)胞膜的錨定；其次，每個復(fù)合體中都至少有一個蛋白質(zhì)被去除前域，但這種前域處理的功能意義目前還尚未清楚；最后，每個復(fù)合體中都至少含有一個蛋白質(zhì)可以與宿主細(xì)胞膜表面的相應(yīng)受體進行結(jié)合[25]。基于以上性質(zhì)，微線體蛋白在弓形蟲穿透組織屏障、對宿主細(xì)胞進行黏附與入侵的過程中具有不可或缺的作用。

3.3 棒狀體蛋白

在微線體蛋白分泌過程中，棒狀體蛋白(rhoptry proteins,ROPs)也緊隨其后開始進行分泌。棒狀體蛋白主要分為2種，即棒狀體頸部蛋白(rhoptry neck proteins,RONs)和棒狀體蛋白。前者與移動連接的形成有關(guān)，而后者則參與納蟲空泡的形成與修飾[26]。

當(dāng)弓形蟲與宿主細(xì)胞膜接觸時，蟲體頂端分泌大量RONs(如RON2、RON4、RON5和RON8)，微線體相關(guān)蛋白在宿主細(xì)胞膜和弓形蟲質(zhì)膜間形成一個緊密連接的結(jié)構(gòu)，稱為移動連接(moving junction,MJ)。移動連接的形成有利于蟲體更加穩(wěn)固的與宿主細(xì)胞膜結(jié)合。在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中，ROPs(如ROP2)的分泌有利于納蟲空泡(parasitophorous vacuole,PV)的形成，并幫助蟲體從宿主細(xì)胞中獲取營養(yǎng)。已有證據(jù)表明，ROP2可介導(dǎo)膜上納蟲空泡的細(xì)胞器滯留，其N末端的一個區(qū)域可作為線粒體輸入序列的一個模擬片段，可將宿主細(xì)胞的線粒體聚集在納蟲空泡膜上[29]。ROP2與宿主細(xì)胞線粒體的緊密結(jié)合有利于蟲體攝取生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，對納蟲空泡內(nèi)蟲體的生存與增殖具有十分重要的作用。ROP18是弓形蟲重要的毒力因子之一，具有激酶活性，其在弓形蟲增殖方面具有控制作用[29]。同時，ROP18還可促進宿主免疫相關(guān)GTP酶發(fā)生磷酸化，阻止宿主體內(nèi)巨噬細(xì)胞對蟲體的吞噬和清除，從而保護蟲體免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[30]。ROP16也是弓形蟲重要的毒力因子之一，經(jīng)蟲體分泌釋放后進入宿主細(xì)胞，通過介導(dǎo)宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響宿主細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，從而對納蟲空泡起到保護作用[29]。

3.4 致密顆粒蛋白

致密顆粒是一種分泌性細(xì)胞器，當(dāng)蟲體完全進入宿主細(xì)胞后，致密顆粒分泌的相關(guān)蛋白質(zhì)被釋放至納蟲空泡內(nèi)，完成納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)修飾作用的最后一步[31]。已有的動力學(xué)分析顯示，在蟲體侵襲宿主細(xì)胞的前30 min內(nèi)，致密顆粒分泌物含量顯著升高[32]。致密顆粒主要分布在PV和PVM中，在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成分中也有分布[26]。致密顆粒蛋白(dense granule antigens,GRAs)在維持納蟲空泡的結(jié)構(gòu)與完整性具有重要功能，如GRA3、GRA5、GRA7、GRA8和GRA14等均參與了對PV的修飾作用。同時，GRAs還通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的功能來確保蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活與復(fù)制。已有研究發(fā)現(xiàn)，GRAs與一種叫做HOST(host organelle sequestering tubular)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，該結(jié)構(gòu)通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞向納蟲空泡傳遞內(nèi)體和溶酶體的過程，影響蟲體從宿主細(xì)胞獲取所需營養(yǎng)，從而降低蟲體的存活率[26]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)GRAs與IVN(intravacuolar network)的形成有關(guān)。IVN是一種連接PV內(nèi)蟲體與PVM的橋梁結(jié)構(gòu)，由此可見，GRAs極有可能參與了弓形蟲與宿主細(xì)胞之間的營養(yǎng)交換過程[26]。此外，致密顆粒蛋白在運輸過程中也會形成復(fù)合物，如GRA6、GRA7與GRA9[32]。然而，目前對于GRAs的轉(zhuǎn)運機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。

4 展望

弓形蟲入侵是一個獨特且復(fù)雜的過程，研究其入侵過程的分子機制對于弓形蟲病的診治、預(yù)防以及相關(guān)疫苗的研發(fā)具有重要意義。目前，國內(nèi)外已基本明確了SAGs、MICs和ROPs等蛋白分子在弓形蟲黏附與入侵過程中的作用機制；然而還有許多問題尚不明確，如納蟲空泡是如何向外排除成分的、增強鈣釋放的自然觸發(fā)因素是什么、弓形蟲在感染單核巨噬細(xì)胞后是如何改變其信號通路的、致密顆粒的發(fā)生機制又是如何被調(diào)控的等諸多問題都亟待解決。這些問題的解決將使人們對弓形蟲入侵宿主的復(fù)雜機制有更深層次的認(rèn)知，為將來弓形蟲病的有效預(yù)防與治療奠定堅實的理論基礎(chǔ)，從而保障和改善全球動物和人類的健康。