捕食動(dòng)物線蟲性真菌相關(guān)研究進(jìn)展

侯 斌，母曉佳，牛杰康，尚世杰，樊雅茹，丁玉林，王 瑞*，杜 山*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家級(jí)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

畜禽線蟲病是由線形動(dòng)物門中的多種線蟲寄生于畜禽體內(nèi)引起的一類寄生蟲病，對(duì)畜禽危害十分嚴(yán)重，可明顯降低畜禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，并嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。一直以來(lái)，針對(duì)這類疾病，主要是采用廣譜抗寄生蟲藥物驅(qū)蟲來(lái)進(jìn)行防治，但這一手段已暴露出越來(lái)越多的問(wèn)題，諸如耐藥蟲株的產(chǎn)生使得化學(xué)藥物的防治效果逐年下降甚至喪失、動(dòng)物源性食品的藥物殘留及環(huán)境污染等。這些問(wèn)題已引起寄生蟲學(xué)領(lǐng)域相關(guān)學(xué)者的重視，并開始積極探索新的防治手段。生物防治便是其中非常具有應(yīng)用潛力的一種，在畜禽線蟲病的生物防治中，很重要的一個(gè)方面就是利用存在于自然界的線蟲天敵——捕食線蟲性真菌進(jìn)行生物控制。

捕食線蟲性真菌是一類廣泛存在于自然界生態(tài)系統(tǒng)中的真菌，從熱帶地區(qū)到寒冷的南極洲，從陸地到水生生態(tài)系統(tǒng)，均發(fā)現(xiàn)有捕食線蟲性真菌存在[1]。它能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成捕食器，捕獲自由生活的線蟲并從線蟲體攝取營(yíng)養(yǎng)，因而在調(diào)節(jié)環(huán)境線蟲動(dòng)態(tài)數(shù)量中起著重要的生態(tài)作用。大多數(shù)捕食線蟲性真菌既能進(jìn)行寄生生活也能營(yíng)腐生生活，從生物進(jìn)化的角度來(lái)講，能夠進(jìn)行兼性寄生的真菌比單純腐生真菌具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，且具有更廣闊的應(yīng)用前景。捕食線蟲性真菌的研究開端以Corda于1839年發(fā)現(xiàn)ArthrobotrysCorda為標(biāo)志。自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已在其捕食特性、生化機(jī)制及臨床應(yīng)用等方面做了大量研究工作，但究竟研究了哪些內(nèi)容和進(jìn)展到什么程度，未見相關(guān)綜述報(bào)道。因此，本文在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，詳細(xì)綜述了近10年來(lái)捕食線蟲性真菌的捕食活性、捕食器的形成、真菌基因組學(xué)及相關(guān)捕食機(jī)制、捕食相關(guān)活性物質(zhì)及應(yīng)用模式等的研究進(jìn)展，既是對(duì)之前研究工作的總結(jié)，也為今后有關(guān)捕食性真菌的深入研究提供參考。

1 捕食線蟲性真菌捕食活性的研究

1939年，Roubaud等發(fā)現(xiàn)隔指孢菌屬真菌(Dactylella)對(duì)類圓屬及鉤口屬線蟲的幼蟲具有殺傷作用，這是最早利用捕食線蟲性真菌防治動(dòng)物寄生性線蟲的報(bào)道。此后，不斷有新的菌種被發(fā)現(xiàn)，目前已報(bào)道有多達(dá)200余種真菌,主要分布在真菌屆(Eumycota)的擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)和接合菌門(Zygomycota)等的12個(gè)屬中，如三叉孢屬(Tridentaria)、隔指孢菌屬(Dactylella)、梗蟲霉屬(Stylopage)和節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)等。隨著研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)同一菌種對(duì)不同的線蟲均有捕食能力，且相同菌種的不同菌株對(duì)同一線蟲的捕食能力也呈現(xiàn)不同[2]?？紤]到臨床應(yīng)用的需要，選擇環(huán)境耐受力強(qiáng)、捕食效率高、捕食幼蟲譜廣及易于培養(yǎng)的菌株作為研究對(duì)象才更有意義[3]。因此，有關(guān)捕食性真菌的分離與捕食活性方面的研究為接下來(lái)的工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并一直在持續(xù)進(jìn)行。

Silva A R等[4]對(duì)4種捕食線蟲性真菌Duddingtoniaflagrans、Monacrosporiumthaumasium、Monacrosporiumsinense和Arthrobotrysrobusta捕食錫蘭鉤蟲感染性幼蟲(L3)的活性進(jìn)行了研究，將4種菌株與錫蘭鉤蟲的L3一起培養(yǎng)在20 g/L瓊脂培養(yǎng)基上，7 d后觀察到L3平均分別降低了95.6%、85.1%、87.4%、90.2%，證明4種捕食性真菌都能有效地在體外捕獲錫蘭鉤蟲L3，與JOAN M B等所報(bào)道的結(jié)果一致[5]。Ojeda R N F等[6]從墨西哥東南部的水牛糞便和土壤中分離出了4株A.oligospora，其對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3的捕食活性在85.9%～100%之間。另?yè)?jù)Zarrin M等[7]報(bào)道，F(xiàn).solani、V.chlamidosporium及T.harzianum對(duì)馬圓線蟲的L3也有較高的捕食活性。在這些真菌中,D.flagrans已被證明能順利通過(guò)動(dòng)物消化道且不喪失捕食活性，原因即是其菌絲在老化過(guò)程中能產(chǎn)生大量厚壁孢子，這種孢子對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，且能耐強(qiáng)酸而不易被家畜消化液及酶等物質(zhì)所滅活，在應(yīng)用實(shí)踐上具有更廣闊的前景，因此相關(guān)研究較多。研究顯示，該菌對(duì)奧斯特線蟲、盅口線蟲、細(xì)頸線蟲和圓線蟲等多種寄生性線蟲的都具有較高的捕食能力，且其捕食活性會(huì)隨著幼蟲數(shù)量的增加而提高，甚至能高達(dá)100%[8]。

此外，還有以Pochoniachlamydosporia等為代表的可作用于寄生性線蟲蟲卵的卵寄生性真菌，其氣生菌絲會(huì)通過(guò)體細(xì)胞質(zhì)濃縮、外壁增厚等過(guò)程形成厚壁孢子，并能順利通過(guò)動(dòng)物消化道，進(jìn)而作用于動(dòng)物寄生性線蟲的蟲卵和雌蟲，如對(duì)肝片吸蟲、犬弓首蛔蟲、馬副蛔蟲及豬蛔蟲等多種寄生蟲蟲卵均有明顯的防控效果?，F(xiàn)已有其商品化制劑應(yīng)用于植物線蟲防治，且防治效果較好。

2 捕食器形成機(jī)制的相關(guān)研究

捕食線蟲性真菌是一個(gè)龐大而多樣的真菌類群，在有線蟲存在的情況下，它可從腐生型轉(zhuǎn)變?yōu)椴妒承停⑼ㄟ^(guò)捕食器、一系列溶解酶和其他毒力因子等共同將自由生活的線蟲捕獲和致死。在作用方式上，不同的真菌有著不同的誘捕裝置，如黏性菌網(wǎng)、黏性菌結(jié)或黏性菌絲；在將線蟲捕獲后，真菌菌絲穿透線蟲，分泌裂解酶，在線蟲體內(nèi)形成菌絲網(wǎng)絡(luò)。除此之外，還有能形成收縮性菌環(huán)的真菌，它們一般是由3個(gè)從菌絲體側(cè)上產(chǎn)生的環(huán)狀菌絲連接而成，其環(huán)內(nèi)表面十分敏感，若有線蟲接觸，便會(huì)迅速膨脹至原體積的3倍，將線蟲牢牢捕獲。這些捕食器的形成與相關(guān)作用機(jī)制不僅作為對(duì)抗線蟲的武器，也是捕食線蟲性真菌由腐生生活向捕食生活方式轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志。捕食線蟲性真菌捕食器的產(chǎn)生數(shù)量與其相對(duì)活性密切相關(guān)，因此有關(guān)捕食器形成機(jī)制的研究已成為了當(dāng)前捕食線蟲性真菌的熱點(diǎn)[9]，王文蕊等[10]在捕食線蟲性真菌的捕食器的形成、進(jìn)化、基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究中取得了明顯進(jìn)展，為捕食器形成及捕食機(jī)制的闡明提供了新的思路和重要信息。

乙醛酸循環(huán)是植物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化分解后合成糖的過(guò)程。這一過(guò)程廣泛存在于植物和微生物中。蘋果酸合成酶是乙醛酸循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶，對(duì)微生物病原菌的致病性是必不可少的。在昆蟲病原真菌綠僵菌和白僵菌中發(fā)現(xiàn)乙醛酸循環(huán)與分生孢子的萌發(fā)有關(guān),Zhao X Y等[11]對(duì)A.oligospora的AoMls基因進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)處理的A.oligospora與未處理的真菌相比，生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)無(wú)明顯差異，但經(jīng)過(guò)處理的A.oligospora捕食器的形成較緩慢，且只產(chǎn)生1個(gè)或2個(gè)未成熟的菌環(huán)，同時(shí)分生孢子的數(shù)量也顯著減少，且不能利用脂肪酸和乙酸鈉進(jìn)行生長(zhǎng)。此外，經(jīng)過(guò)處理的A.oligospora殺線蟲活性顯著降低。這些均表明AoMls基因在A.oligospora的分生孢子的形成、捕獲和致死線蟲中起著重要作用。黏附因子是胞外纖維聚合物的主要組成部分，它大量存在于捕食線蟲真菌的黏性菌環(huán)外表面，且與捕食器的進(jìn)化過(guò)程相關(guān)，因此基于黏附因子相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)于理解誘捕裝置的進(jìn)化具有重要意義。近年來(lái)，昆蟲病原真菌綠僵菌細(xì)胞壁蛋白Mad1的同源基因AoMad1被認(rèn)為參與了少孢節(jié)叢孢菌的黏附作用。Li J等[12]克隆了45株捕食線蟲性真菌的Mad1同源基因，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，形成非收縮性黏附菌環(huán)的物種基本上是由兩個(gè)譜系演化而來(lái)的，顯著的正選擇壓力可能作用于最早時(shí)期的真菌，產(chǎn)生了黏性菌環(huán)和收縮性菌環(huán)兩類捕食線蟲性真菌，表明Mad1基因可能在捕食線蟲真菌的進(jìn)化過(guò)程中起重要作用。Liang L等[13]對(duì)A.oligospora的AoMad1基因進(jìn)行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AoMad1基因的缺失使得真菌對(duì)氮源更敏感，在線蟲存在的情況下會(huì)產(chǎn)生更多捕食器。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，與未經(jīng)處理的真菌相比，AoMad1基因敲除后的菌株有大量基因差異表達(dá)，其中許多基因與氮代謝、真菌-線蟲相互作用和菌絲體發(fā)育有關(guān)。氮元素是構(gòu)成生物的最主要元素之一，在動(dòng)植物生命話動(dòng)中起著重要作用。有研究指出，氮元素在捕食器的形成中具有重要作用，如脫落酸及硝酸鹽能提高D.stenobrocha誘蟲能力和捕食線蟲能力，而外源一氧化氮?jiǎng)t降低D.stenobrocha的誘蟲能力。這也很好的解釋了在利用商品化的捕食線蟲性真菌對(duì)根結(jié)線蟲防治中，防治效果可達(dá)到90%以上的原因，即根瘤菌的固氮對(duì)捕食線蟲性真菌的捕食器形成起到了正向的促進(jìn)作用。

在絲狀真菌中，自噬參與了生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程，特別是其中的細(xì)胞分化過(guò)程,如生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡及孢子形成等，自噬均起到了關(guān)鍵性作用。如對(duì)A.oligospora的自噬現(xiàn)象研究后證實(shí)，自噬現(xiàn)象產(chǎn)生于真菌被線蟲誘導(dǎo)產(chǎn)生捕食器形成的早期階段，但將A.oligospora中atg8基因敲除后，發(fā)現(xiàn)線蟲誘導(dǎo)的自噬現(xiàn)象消失，而且捕食器的形成也受到抑制，從而降低了真菌對(duì)線蟲的致病性。組學(xué)分析表明，在捕食器形成的早期，A.oligospora中參與氨基酸生物合成的基因表達(dá)上調(diào)，如GCN4的轉(zhuǎn)錄活性被誘導(dǎo)，說(shuō)明線蟲可通過(guò)觸發(fā)真菌細(xì)胞內(nèi)氨基酸饑餓來(lái)誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生自噬現(xiàn)象。同時(shí)，AoRab-7A基因也參與了A.oligospora誘導(dǎo)的自噬過(guò)程。此外，在捕食器形成過(guò)程中，還觀察到許多菌絲細(xì)胞融合或菌絲交接中具有細(xì)胞間信號(hào)傳遞機(jī)制。有絲分裂原激活蛋白激酶等在這種通訊中起著重要作用[14]。沃洛寧體(Woronin body)是在高等真菌種一種獨(dú)特的細(xì)胞器。當(dāng)菌絲損傷后，能迅速封閉穿孔隔膜，從而減少胞質(zhì)的丟失，促進(jìn)菌絲愈合。在許多真菌病原體中，沃洛寧體也被認(rèn)為是其致病的重要因素。Liang L M等[15]對(duì)A.oligospora的AoHex1基因研究后發(fā)現(xiàn)，該基因是A.oligospora沃洛寧體的一個(gè)重要組成部分；將其敲除后，沃洛寧體喪失，同時(shí)真菌的生長(zhǎng)速率、分生能力等均受到影響，捕食器也不再形成。此外，捕食線蟲性真菌與細(xì)菌共享微生境，相互作用，但對(duì)這些細(xì)菌對(duì)其捕食器形成的影響則被嚴(yán)重低估，如有研究報(bào)道細(xì)菌的代謝物質(zhì)可促進(jìn)捕食器的形成[16]。

3 基因組學(xué)及相關(guān)捕食機(jī)制的研究

自捕食線蟲性真菌被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，許多學(xué)者已做了捕食特性、生化機(jī)制及臨床應(yīng)用等方面的大量研究工作。雖然基因組學(xué)及其相關(guān)捕食機(jī)制的相關(guān)研究起步較晚，但發(fā)展較為迅速，在分子水平上揭示了其基因組特征、起源、進(jìn)化特點(diǎn)、致病能力及腐生能力等。

絲裂原活化蛋白激酶是一種相對(duì)保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞外信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和分化過(guò)程，它在控制真菌生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等方面起著重要的作用。目前，已由真菌中鑒定出了4種不同的MAP激酶基因，即Hog1、Slt2、Spm1和Fus3，其中的Slt2首先由模型真菌-釀酒酵母中被鑒定，發(fā)現(xiàn)它在維持細(xì)胞壁完整性的途徑中起作用。近年來(lái)，Slt2在昆蟲病原真菌中的作用也得到了研究。Zhen Z Y等[17]對(duì)A.oligospora和M.haptotylum中Slt2的同源基因AoSlt2和MhSlt2進(jìn)行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)AoSlt2和MhSlt2的破壞可導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)減少，對(duì)環(huán)境脅迫的敏感性增加，并且無(wú)法產(chǎn)生分生孢子和線蟲誘捕結(jié)構(gòu)；同時(shí)，產(chǎn)孢相關(guān)基因(AbaA、Sep2和MedA)和細(xì)胞壁合成相關(guān)基因(Chs、Glu和Gfpa)的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，表明MAP激酶Slt2同源基因在兩種捕食線蟲性真菌的菌絲生長(zhǎng)、分生、捕食器的形成和致病性中起著相似的作用。

有研究報(bào)道，當(dāng)將細(xì)胞色素P450基因破壞后，A.oligospora的表型發(fā)生顯著差異并產(chǎn)生了大量氣生菌絲[18]，且有3個(gè)新的PKS-TPS環(huán)氧環(huán)己酮衍生物在菌絲周圍大量積累，這些代謝產(chǎn)物具有明顯的殺線蟲活性。將聚酮合酶基因PKS敲除后，捕食器的數(shù)量與捕食活性上提高了10倍左右。轉(zhuǎn)錄譜分析表明，A.oligospora捕食器的形成與PKS信號(hào)通路有關(guān)，并受Zn(2)-C6型轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Yang X W等[19]報(bào)道將A.oligospora的AoRab-7基因敲除后，該菌不再產(chǎn)生捕食器，從而喪失了捕獲線蟲的能力。然而，將AoRab-2基因敲除后，僅僅對(duì)分生孢子的產(chǎn)量有輕微影響，而對(duì)其他特征性的表型無(wú)明顯影響。此外，有研究證實(shí)甘油在線蟲誘導(dǎo)A.oligospora的捕食器形成過(guò)程中大量積累，在敲除編碼糖原磷酸化酶的gph1基因后，甘油含量下降，且捕食效率也隨之降低，真菌的生長(zhǎng)速度和分生能力也受到影響。捕食線蟲性真菌能分泌絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等多種胞外水解酶來(lái)消化和滲透線蟲表皮和卵殼[20]，然而，對(duì)捕食線蟲性真菌的這些幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)和功能知之甚少。有研究報(bào)道，A.oligospora中16個(gè)編碼幾丁質(zhì)酶的基因開放閱讀框，都屬于糖苷水解酶家族18；當(dāng)碳元素缺乏時(shí)，大部分幾丁質(zhì)酶的表達(dá)受到抑制，而缺氮元素時(shí)，所有幾丁質(zhì)酶均上調(diào)。此外，在幾丁質(zhì)底物存在的情況下，一些幾丁質(zhì)酶的基因表達(dá)上調(diào)，如AO-59、AO-190和AO-801。這些研究表明，捕食線蟲性真菌的形態(tài)調(diào)控及代謝產(chǎn)物的生物合成是通過(guò)某些基因表達(dá)來(lái)改變的，這些發(fā)現(xiàn)將為未來(lái)真菌生防制劑的研制提供了新的途徑。Ji X L等[21]基于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和qPCR數(shù)據(jù)建立了A.oligospora捕食器的形成模型。在該模型中，多個(gè)真菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被其線蟲誘導(dǎo)激活，以進(jìn)一步調(diào)節(jié)與多種細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的下游基因，如能量代謝、細(xì)胞壁和黏附蛋白的生物合成、細(xì)胞分裂、甘油積累和過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生。也有報(bào)道通過(guò)對(duì)M.haptotylum與A.oligospora基因組的比較，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族的擴(kuò)展和物種特異性基因的大量存在，這在捕食線蟲真菌的進(jìn)化中起著重要作用，對(duì)這些真菌對(duì)寄生生活的適應(yīng)具有重要意義，而差異基因、同源基因、罕見的轉(zhuǎn)座子和重復(fù)誘導(dǎo)的點(diǎn)突變機(jī)制等在真菌腐生起源、雙重生存策略的轉(zhuǎn)變、致病性相關(guān)基因的鑒定、線蟲與真菌相互作用共進(jìn)化，感染機(jī)制等方面發(fā)揮了巨大的作用。

4 捕食相關(guān)活性物質(zhì)的研究

捕食線蟲性真菌通過(guò)機(jī)械性或黏附作用將線蟲捕獲后，再分泌相關(guān)酶類等物質(zhì)將線蟲致死并消化[22]，但現(xiàn)在對(duì)于這些特異性或非特異性物質(zhì)的種類還不是十分清楚。因此，有關(guān)這些物質(zhì)的研究將是未來(lái)利用捕食線蟲性真菌進(jìn)行生物防治中一個(gè)很重要的部分，對(duì)其進(jìn)行分離純化后直接用于生物防治將是未來(lái)一個(gè)很重要的研究方向。

Wei L X等[23]對(duì)A.oligospora中倍半萜烯環(huán)氧環(huán)己烯酸(SEC)寡孢菌素A進(jìn)行了X射線衍射分析，這是首次完全確定自然產(chǎn)生的代謝物的相對(duì)構(gòu)型，證實(shí)該物質(zhì)具有獨(dú)特的抗蟲活性。隨后又有人純化了A.oligospora中的3個(gè)新的寡孢菌素B、D(6、11)及其2個(gè)衍生物，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)線蟲死亡時(shí)，真菌能在6 h內(nèi)迅速降低寡孢菌素B和D(11)的濃度，這與線蟲存活時(shí)的情況相反。寡孢菌素D(11)為真菌菌落生長(zhǎng)和真菌與線蟲相互作用的特異性代謝信號(hào)[24]。寡孢菌素與真菌的腐生和致病能力密切相關(guān)。Zhao H L等[25]表達(dá)了A.oligospora胞外絲氨酸蛋白酶P186基因，用P186重組蛋白對(duì)秀麗隱桿線蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分別作用12、24、36 h后，對(duì)秀麗隱桿線蟲的殺滅率分別為62%、88%、100%，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的殺滅率為52%、65%、84%，表明其具有較強(qiáng)的線蟲毒性。另有報(bào)道從A.entomopaga中分離出了6種微量代謝物，這些物質(zhì)具有促進(jìn)黏性菌結(jié)形成的作用，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的線蟲吸引能力。這些新調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)表明捕食線蟲性真菌可能在不斷進(jìn)化過(guò)程中會(huì)提高對(duì)獵物的反應(yīng)。

在生物體內(nèi)，酶發(fā)揮著非常廣泛的功能。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控都離不開酶，特別是激酶和磷酸酶的參與，現(xiàn)在已知多數(shù)酸性磷酸酶對(duì)線蟲有作用，如A.sinensis液體培養(yǎng)基中的蛋白水解酶及D.flagrans的粗酶提取液對(duì)血管圓線蟲具有較高的活性作用。隨著對(duì)這些活性物質(zhì)的認(rèn)識(shí)和深入挖掘，根據(jù)這些活性物質(zhì)作用寄生性線蟲的特點(diǎn)，直接將其應(yīng)用于生防實(shí)踐中將有利于捕食性真菌的應(yīng)用推廣。

5 捕食性真菌應(yīng)用模式的研究

在自然環(huán)境中，只有極少量的捕食線蟲性真菌能與糞便中的幼蟲接觸并發(fā)揮作用。因此，在捕食線蟲性真菌的臨床應(yīng)用上，需人為的通過(guò)一定措施來(lái)提高環(huán)境中的真菌數(shù)量。要達(dá)成這一目標(biāo)，最初是將培養(yǎng)好的真菌及培養(yǎng)物粉碎后撒布于草場(chǎng)上，后來(lái)又采用直接將真菌大量混合在動(dòng)物糞便中的方法，但這兩種方法無(wú)論從人力還是物力的角度來(lái)看，都達(dá)不到理想的效果。1993年，Gronvold發(fā)現(xiàn)了幾種可以產(chǎn)生厚垣孢子的捕食線蟲性真菌，這些孢子可以順利通過(guò)動(dòng)物消化道，進(jìn)而在糞便中萌發(fā)并將由蟲卵發(fā)育而來(lái)的幼蟲捕獲，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。隨著研究的深入，還發(fā)現(xiàn)在捕食線蟲性真菌培養(yǎng)的過(guò)程中加入某些化合物可以提升或抑制真菌的產(chǎn)孢量[26]，線蟲中的某些物質(zhì)也能提高捕食器的數(shù)量，或用低能離子束誘導(dǎo)突變，這些措施可促使真菌產(chǎn)生更多的胞外蛋白酶并取得了很好的效果。如何將這些成果轉(zhuǎn)化到實(shí)踐應(yīng)用中，合適的制劑劑型和應(yīng)用模式非常關(guān)鍵，因此有關(guān)捕食性真菌制劑和臨床應(yīng)用模式的研究是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。

在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，捕食線蟲性真菌的制劑均為孢子懸浮液，在運(yùn)輸過(guò)程中很容易造成污染及生物活性的降低，從而導(dǎo)致菌株捕食能力的下降，影響了捕食性真菌在臨床應(yīng)用的效率。為了避免這些不足，Alexandre O T等[27]將D.flagrans與M.thaumasium混合制成以海藻酸鈉為壁材的微丸，可以提高真菌通過(guò)動(dòng)物消化道的能力，對(duì)馬圓線蟲的L3數(shù)量減少率超過(guò)80%。VieiraS等[28]將前述兩種捕食線蟲性真菌與卵寄生性真菌混合培養(yǎng)，兩類真菌的補(bǔ)充和結(jié)合具有更高的防治效率。2006年，國(guó)內(nèi)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的楊曉野教授和王瑞教授團(tuán)隊(duì)首次運(yùn)用真空冷凍干燥技術(shù)將捕食性真菌做成凍干生物制劑，可將捕食性真菌的保存時(shí)間延長(zhǎng)至數(shù)十年，而且凍干制品具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，溶水和復(fù)水性極好，方便攜帶；在防效上，對(duì)線蟲的捕食率可達(dá)95.8%，為基層臨床的使用提供了便利[29]。2017年，該團(tuán)隊(duì)又首次提出了將驅(qū)蟲藥物與捕食性真菌聯(lián)合應(yīng)用的方法[30]，前者作用于線蟲成蟲，而后者作用于藥物驅(qū)蟲后所排蟲卵或由蟲卵發(fā)育而來(lái)的線蟲幼蟲，兩者相互補(bǔ)充，既預(yù)防了線蟲的傳播和感染，又可以減少化學(xué)藥物的大量使用，從而推遲和避免了寄生蟲耐藥性的產(chǎn)生及減少了化學(xué)藥物的使用和對(duì)環(huán)境的污染，可以達(dá)到更理想的寄生蟲防控效果。后來(lái)Sagüés M F等[31]將D.flagrans加入大豆蛋白基聚合物設(shè)備(controlled release device，CRD)中制成了一種控釋劑。測(cè)定了CRD中真菌的釋放速率和CRD在空心綿羊瘤胃中的停留時(shí)間。給羊投喂后，每隔一個(gè)多月每周提取一次CRD，觀察其物理結(jié)構(gòu)，并收集糞便，并觀察真菌在培養(yǎng)皿中的捕食活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRD在瘤胃中緩慢降解超過(guò)4周，并將D.flagrans釋放到糞便中且大豆蛋白基聚合物的配方不影響真菌的捕食活性。此外，很多年前就知道氧化銅顆?；蚰承┲参锘衔?如單寧酸)等都對(duì)線蟲有著或多或少的驅(qū)蟲作用，如果可以將這些物質(zhì)與捕食線蟲性真菌聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以提高對(duì)線蟲的防治效果，還可解決某些地區(qū)畜禽的營(yíng)養(yǎng)缺乏癥及提高產(chǎn)品品質(zhì)。在捕食性真菌的臨床應(yīng)用中，多年來(lái)，學(xué)者們都認(rèn)為捕食線蟲性真菌對(duì)環(huán)境沒(méi)有危害，十分安全。但近幾年也有相關(guān)報(bào)道稱，捕食線蟲性真菌會(huì)對(duì)輪蟲(廢水生物處理中能夠改善污水質(zhì)量的生物體)的數(shù)量和密度造成一定影響[32]，捕食線蟲性真菌的大量出現(xiàn)可危及輪蟲種群，因此有必要對(duì)捕食線蟲性真菌在其他環(huán)境中對(duì)某些生物的影響做詳細(xì)研究。綜合來(lái)看，這些負(fù)面影響是有限的，即其產(chǎn)生的影響與人類通過(guò)生物防治所獲得的總體效益相比是微不足道的。

6 展望

在線蟲防治方面，即使是化學(xué)藥物緩釋劑、長(zhǎng)效制劑等最新的給藥技術(shù)，也無(wú)法避免越來(lái)越嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題，而生物防治是未來(lái)非常具有應(yīng)用潛力的一種寄生蟲防治措施。但目前捕食線蟲性真菌還停留在實(shí)驗(yàn)室階段而未能推廣應(yīng)用，還有一系列問(wèn)題亟待解決，如大規(guī)模的培養(yǎng)問(wèn)題、合適制劑的制備、從培養(yǎng)到制劑制備的工藝；其次，在生防治劑方面，還沒(méi)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，也需要科研人員來(lái)建立。再就是，隨著捕食線蟲性真菌基礎(chǔ)研究的不斷完善，尋找相關(guān)具有殺線蟲的真菌活性物質(zhì)或關(guān)鍵物質(zhì)，將會(huì)極大地促進(jìn)捕食性真菌的實(shí)踐應(yīng)用。此外，還應(yīng)加強(qiáng)真菌制劑的成本控制和產(chǎn)業(yè)化的推廣，為捕食線蟲性真菌商品化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。