補(bǔ)腎活血法對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠免疫功能和組織病理學(xué)的影響*

楊 月，田 園，陳玥穎，李永明，鐘沈煜，薛 鸞

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕科，上海 200437)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)合并早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重影響SLE患者生存率的重要原因，日益受到關(guān)注。但是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用的糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的治療存在諸多的副作用。中醫(yī)藥注重“整體論治”及“辨證論治”，根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡和動(dòng)脈粥樣硬化共同的中醫(yī)病機(jī)“腎虛為本，血瘀為標(biāo)”，采用補(bǔ)腎活血法治療可一舉兩得，在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并動(dòng)脈粥樣硬化方面，中醫(yī)藥有著廣闊的前景。課題組前期研究表明，補(bǔ)腎活血法通過降低血沉(ESR)、免疫球蛋白 G(IgG)、D-二聚體(D-Di)、纖維蛋白原(FIB)及24 h尿蛋白定量，對(duì)SLE患者早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化起到一定的預(yù)防作用。本研究擬進(jìn)一步觀察補(bǔ)腎活血法對(duì)SLE合并動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠免疫功能和組織病理學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

大雌性ApoE-/-小鼠45只和C57BL/6小鼠15只，8周齡，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，所有實(shí)驗(yàn)過程中小鼠均在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,動(dòng)物房溫度、濕度恒定,溫度21～22℃，濕度50%～60%。采用12 h(早7時(shí)-晚7時(shí))明暗循環(huán),小鼠清潔飲水,自由取食。本研究采用的動(dòng)物試驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)17722)。

1.2 中藥組成及制備

中藥濃縮顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。1 g制首烏濃縮顆粒相當(dāng)于10 g制首烏生藥，1 g蒲黃濃縮顆粒相當(dāng)于20 g蒲黃生藥。將上述濃縮顆粒按照下文所述比例混合后溶于沸水中，攪拌均勻，冷卻至室溫后使用。

1.3 造模及藥物干預(yù)

8周齡大雌性ApoE-/-小鼠45只，給予一次性腹腔注射pristane 0.5 ml(購自百靈威科技有限公司)，繼續(xù)喂養(yǎng)16周后隨機(jī)分為3組各15只。中藥治療組：補(bǔ)腎活血中藥(制首烏、蒲黃)，西藥對(duì)照組：嗎替麥考酚酯分散片(購自杭州中美華東制藥有限公司，0.25 g/片)，模型組：生理鹽水。

根據(jù)人與小鼠用藥量體表面積等效公式，中藥治療組藥物按照人體常用劑量(制首烏生藥30 g，蒲黃生藥15 g/d)比例換算成小鼠用量為制首烏生藥0.13 g：蒲黃生藥0.07 g/d，西藥治療組藥物按照人體常用劑量(0.5 g/d)換算成小鼠用量為2.2 mg/d，模型組和正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水，4組小鼠每天2次灌胃，連續(xù)12 周。

1.4 主要儀器及設(shè)備

酶標(biāo)儀(美國 BioTek)、全自動(dòng)生化儀(上?？迫A)、普通光學(xué)顯微鏡(日本 Nikon)、組織包埋機(jī)(美國 Thermo)、石蠟切片機(jī)(德國 Leica)。

1.5 蛋白尿評(píng)估

使用小鼠代謝籠收集小鼠24 h尿量，為M ml；將收集到的小鼠尿液以4000rpm離心5 min，取1 ml上清液待測；根據(jù)CBB尿蛋白定量測試盒(購自南京建成生物工程研究所)測定蛋白尿濃度：自小鼠24 h尿蛋白A(mg/24 h)=尿蛋白濃度(mg/L)×M/103。

1.6 血清抗體和生化指標(biāo)的檢測

小鼠空腹12 h后麻醉，摘取眼球取血于EDTA抗凝管中,3000 r/min離心15 min，吸取上層血漿裝于1 ml EP管中,-80 ℃冰箱保存。免疫球蛋白IgG及補(bǔ)體C3檢測通過免疫透射比濁法。腎功能、血脂檢測通過氧化酶法，白蛋白檢測通過比色法，所有操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 主動(dòng)脈斑塊病理

小鼠自肛門上方自下向上剪開皮膚至咽喉部,依次解剖皮下組織、胸腹膜至暴露胸腹腔臟器。連接輸液裝置于生理鹽水,頭皮針穿刺左心室使生理鹽水自左心室灌流全身血管,直至主動(dòng)脈呈透明狀。小心游離心臟、主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處剪斷，主動(dòng)脈固定于4%多聚甲醛中,4 ℃保存。主動(dòng)脈組織固定5～7 d后行石蠟包埋切片，HE染色。

顯微鏡下分別選取主動(dòng)脈根部切片HE染色的動(dòng)脈壁，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)數(shù)碼相機(jī)采集，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量計(jì)算主動(dòng)脈根部每一切面橫截面AS改變的面積和管壁面積及其比值，取其平均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各處理組對(duì)肝腎功能與血脂的影響

表1示，與正常對(duì)照組比較，模型組尿素氮、肌酐、膽固醇和甘油三酯水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，西藥治療組和中藥治療組尿素氮和肌酐水平較均明顯下降(P<0.05或P<0.01)。與模型組和西藥治療組比較，中藥治療組膽固醇和甘油三酯水平均明顯下降(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組肝腎功能和血脂比較

2.2 各處理組對(duì)免疫狀態(tài)和蛋白尿的影響

表2示，與正常對(duì)照組比較，模型組免疫球蛋白IgG水平明顯升高，補(bǔ)體C3水平明顯下降，脾臟質(zhì)量和蛋白尿增加(P<0.01)。與模型組和西藥治療組比較，中藥治療組IgG水平均明顯下降(P<0.01)，3組之間C3水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，西藥治療組和中藥治療組脾臟質(zhì)量和蛋白尿水平均明顯下降(P<0.01)。

表2 各組免疫指標(biāo)、蛋白尿和動(dòng)脈斑塊比較

2.3 各處理組主動(dòng)脈斑塊評(píng)估

各組小鼠主動(dòng)脈斑塊組織病理變化：正常對(duì)照組主動(dòng)脈罕見動(dòng)脈斑塊；模型組主動(dòng)脈壁黏膜層粥樣斑塊形成，斑塊內(nèi)見大量膽固醇結(jié)晶，部分見鈣鹽沉積，大量泡沫細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞，管腔高度狹窄；西藥治療組病變較模型組稍減輕，主動(dòng)脈壁黏膜層粥樣斑塊形成，斑塊內(nèi)見大量膽固醇結(jié)晶，少量泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，管腔中到重度狹窄；中藥治療組病變較模型組和西藥治療組明顯減輕，可見主動(dòng)脈壁黏膜層局部薄層粥樣斑塊形成，斑塊內(nèi)見膽固醇結(jié)晶，增生的纖維組織，少量泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，官腔輕度狹窄(圖1)。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈斑塊HE染色

與正常對(duì)照組比較，模型組動(dòng)脈斑塊面積明顯增大(P<0.01)。中藥治療組斑塊面積較西藥治療組和模型組均明顯下降(P<0.01)，西藥治療組較模型組也有下降(P<0.05)(表2)。

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種累及多系統(tǒng)多器官的自身免疫性結(jié)締組織病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，其本質(zhì)是由自身免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，本病好發(fā)于中青年女性。近年來，隨著對(duì)SLE發(fā)病機(jī)制的深入研究與診療水平的不斷提高，SLE患者的預(yù)后獲得了顯著改善，生存期得以延長，但隨著病程的延長，患者的重要臟器損害表現(xiàn)越來越明顯。早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化就是其中的一種常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致心血管疾病的高發(fā)病率和死亡率[1-3]。

中醫(yī)學(xué)無狼瘡病名記載，但根據(jù)其活動(dòng)期特征樣皮疹、關(guān)節(jié)炎、發(fā)熱、高血壓、蛋白尿、水腫等主要癥狀表現(xiàn)，屬于“水腫” “紅蝴蝶瘡” “腎著” “陰陽毒” “虛勞”等范疇。《靈樞·百病始生》曰：“風(fēng)雨寒熱，不得虛，邪不能獨(dú)傷人。卒然逢疾風(fēng)暴雨而不病者，蓋無虛，故邪不能獨(dú)傷人。”正氣不足，衛(wèi)外不固，毒邪乘機(jī)侵入，毒邪內(nèi)蘊(yùn)于臟腑經(jīng)絡(luò)使血脈凝滯，瘀阻脈絡(luò)。瘀血作為病理產(chǎn)物，使水液運(yùn)行輸布障礙，濕濁內(nèi)停，濕瘀蘊(yùn)結(jié)于腎絡(luò)，腎絡(luò)受損失于封藏。故狼瘡的發(fā)生以臟腑虛損為內(nèi)在基礎(chǔ)，毒邪侵襲為重要條件，而瘀血?jiǎng)t貫穿于疾病全過程。 動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制為痰瘀凝結(jié)于脈道，其本在于腎虛。《景岳全書·虛損》云：“腎水虧，則水不歸源而脾痰起?！蹦I不化水，水濕停聚日久成痰，臟腑虧虛日久生瘀， 痰瘀二者互相影響，痰能致瘀，瘀能生痰，痰瘀搏結(jié)于脈道使血流不暢，導(dǎo)致本病發(fā)生。因此，“腎虛為本，血瘀為標(biāo)”是狼瘡和動(dòng)脈粥樣硬化共同的中醫(yī)病機(jī)。

本研究采用制首烏、蒲黃作為藥對(duì)治療。首烏為補(bǔ)腎之要藥，《本草經(jīng)解》：“何首烏味苦澀無毒，得地火水之味，入手少陰心經(jīng)、足少陰腎經(jīng)……心血充則腎精足，其堅(jiān)筋骨益精髓者，氣溫益膽，味苦澀而交心腎也。[4]”蒲黃善消瘀血，《本草正義》：“蒲黃，專入血分， 以清香之氣，兼行氣分，故能導(dǎo)瘀結(jié)而治氣血凝滯之痛。[5]”二藥合用補(bǔ)中寓瀉、動(dòng)靜相宜，共奏補(bǔ)腎活血之法?，F(xiàn)代藥理研究顯示，首烏中含有的卵磷脂、蒽醌衍生物及大黃酚等多種物質(zhì)，可以有效抑制膽固醇濃度，減少膽固醇被腸道黏膜吸收，增強(qiáng)高密度脂蛋白作用，防止血清中脂質(zhì)產(chǎn)物滯留，可以有效抗動(dòng)脈粥樣硬化形成[6-7]。蒲黃能夠抗血小板聚集，其中總黃酮的作用最強(qiáng)[8]，其抗血小板聚集作用可能與抑制磷酸二酯酶活性有關(guān)[9]。蒲黃水提液還能不依賴?yán)w溶酶系統(tǒng)存在，直接分解纖維蛋白，促纖維蛋白溶解。更有研究顯示[10]，蒲黃中不飽和脂肪酸及槲皮素均可降低血脂并防治粥樣硬化。

ApoE-/-小鼠是目前用來研究動(dòng)脈粥樣硬化非常經(jīng)典的動(dòng)物模型[11]。載脂蛋白的作用是轉(zhuǎn)運(yùn)一些脂蛋白，因此當(dāng)載脂蛋白缺乏的時(shí)候體內(nèi)容易出現(xiàn)膽固醇等物質(zhì)堆積，從而形成動(dòng)脈粥樣硬化。Pristane是從礦物油中提取的一種有機(jī)烷類物質(zhì)，是目前常用的藥物誘導(dǎo)型狼瘡模型的誘導(dǎo)劑。Satoh M等1995年發(fā)現(xiàn)，給非自發(fā)性免疫鼠BALB/c鼠一次性腹腔注射Pristane 0.5 ml可成功誘導(dǎo)小鼠狼瘡[12]，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)非自身免疫性小鼠對(duì)Pristane的易感性普遍存在，其中包括C57BL/6小鼠[13]。該造模方法小鼠外周血循環(huán)產(chǎn)生大量的ANA抗體、anti-dsDNA抗體、抗snRNP/Sm抗體、anti-Su抗體等，同時(shí)可導(dǎo)致腎小球腎炎、蛋白尿、關(guān)節(jié)炎等病變，與人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有相似的血清特異性抗體和腎臟免疫復(fù)合物沉積，有較好的相關(guān)性[14]。

近年來，通過用動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠誘導(dǎo)狼瘡模型的研究逐漸增多。Zhang CY等[15]對(duì) ApoE-/-小鼠進(jìn)行腹腔注射Pristane，ApoE-/-pristane組小鼠出現(xiàn)ANA、ENA水平的升高和脾腫大，其中包括抗Sm、抗nRNP、抗核糖體抗體，符合SLE 的特征。本研究采用相同的方法造模，該造模方法對(duì)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件的要求相對(duì)較低，腹腔注射一次性完成，動(dòng)物死亡率低，同時(shí)該模型在臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)、組織病理學(xué)等多方面接近人類SLE合并動(dòng)脈粥樣硬化的疾病表現(xiàn)，是目前較理想的方法。

研究結(jié)果表明，中藥治療組免疫球蛋白IgG水平較西藥治療組和模型組均明顯下降，中藥治療組和西藥治療組脾腫大程度較模型組均明顯改善，但2組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西藥治療組和中藥治療組尿素氮、血肌酐以及蛋白尿水平較模型組均明顯下降，但2組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥治療組血脂水平較西藥治療組和模型組均明顯下降。與西藥治療組和模型組比較，中藥治療組主動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜厚度有較大減低，泡沫細(xì)胞減少，主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯減少，管腔狹窄減輕。本研究提示，中藥治療組在降血脂和改善動(dòng)脈斑塊方面的作用與現(xiàn)代藥理學(xué)研究首烏和蒲黃的降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用相吻合。而西藥治療組使用藥物嗎替麥考酚酯為次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶抑制劑，其主要的作用機(jī)制在于抑制嘌呤從頭合成，從而抑制淋巴細(xì)胞活化，是目前治療狼瘡腎炎的首選藥物之一[16]。因而其對(duì)于腎臟病變的緩解作用更明顯，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的改善較微弱。首烏和蒲黃同時(shí)具有的抗凝與促纖維蛋白溶解作用，可能與其降低腎功能和改善腎臟損傷密切相關(guān)。免疫球蛋白IgG和補(bǔ)體C3是反映系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情活動(dòng)的指標(biāo)，研究結(jié)果顯示中藥治療組僅僅在IgG方面較前改善，西藥治療組IgG和C3水平治療前后比較均無改善，可能與本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所使用的藥物及其劑量療程尚不足相關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎活血中藥可明顯改善SLE合并動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠的高免疫球蛋白血癥，減輕脾腫大，改善腎臟病變，調(diào)節(jié)血脂代謝水平，減輕主動(dòng)脈粥樣硬化病理程度。 補(bǔ)腎活血法的降血脂作用、改善免疫球蛋白水平和動(dòng)脈斑塊方面作用比西藥治療更明顯。本課題組將進(jìn)一步深入了解動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程與免疫反應(yīng)的關(guān)系，探討補(bǔ)腎活血法的作用機(jī)制，以期為臨床控制SLE早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防SLE心血管事件提供新思路、新方法。