B7-H4表達對胃癌患者預后的影響及機制

車楠，齊文博，楊昭婷，玄延花*

1延邊大學醫(yī)學院再生醫(yī)學研究所，吉林延吉 133002；2延邊大學醫(yī)學院病理教研室，吉林延吉 133002

胃癌是全球范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，也是我國癌癥相關死亡的第二大疾病。據(jù)報道，2018年全球胃癌新發(fā)病例超過10萬，死亡約7.8萬例[1]。 盡管胃癌的治療手段在不斷更新[2-3]，但由于原發(fā)性或獲得性耐藥，晚期胃癌患者5年生存率低于20%[4]。因此，探索新的分子生物標志物以預測胃癌進展并輔助靶向治療成為主要的研究方向。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)是具有自我更新和分化潛能的細胞亞群，參與腫瘤的起始、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥，是腫瘤治療的新靶點。作為B7家族成員之一，B7-H4是T細胞免疫應答的負性調(diào)控因子，但在多種癌癥(如肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌)中高表達，且與癌癥進展及患者預后密切相關[5-7]。目前，關于B7-H4表達與胃癌臨床病理特征及干性特征關系的研究報道較少。本研究旨在結合生物信息學分析方法，利用胃癌標本和胃癌細胞，探討B(tài)7-H4在胃癌中的臨床意義及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1臨床組織標本 附有隨訪信息的183份胃癌組織樣本來源于上海芯超生物科技有限公司。胃癌病例中男112例，女71例，術前未接受任何治療，隨訪期2～136個月。3份人胚胎組織樣本來源于延邊大學醫(yī)學院。本研究通過延邊大學醫(yī)學院倫理委員會審批(BS-13-35)。

1.2細胞及主要試劑、儀器 人胃癌細胞AGS、SNU484、MKN74、MKN28購自美國ATCC(American Type Culture Collection)細胞庫。B7-H4、CD105、SOX9、LSD1、CD133和β-actin抗體購自英國Abcam公司；p16、p-PI3K-p85、p-Akt(Ser473和Thr308)及NF-κB p65抗體購自美國Millipore公司；免疫組化試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。Western bloはing電泳系統(tǒng)和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本尼康株式會社；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3免疫組化染色檢測B7-H4、細胞周期調(diào)控蛋白、干性相關蛋白及PI3K/Akt/NF-κB信號通路蛋白的表達 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇脫水，置于TE(1 mmol/L EDTA和10 mmol/L Tris，pH 9.2)緩沖液中煮沸15 min進行抗原修復；TBST洗滌，3% H2O2封閉，清除內(nèi)源性過氧化物酶干擾；分別加入B7-H4 (1:100)、p16 (1:100)、CD105 (1:50)、LSD1 (1:100)、SOX9 (1:100)、CD133 (1:150)、p-PI3K-p85 (1:100)、p-Akt-Ser473 (1:100)、p-Akt-Thr308 (1:100)和NF-κB p65 (1:100)蛋白抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入生物素標記的山羊抗小鼠/兔Ig G聚合物二抗(1:1000)，室溫孵育1 h。DAB或AEC顯色劑孵育10 min，自來水沖洗，蘇木精復染，自來水返藍10 min，脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察B7-H4、p16、CD105、LSD1、SOX9、CD133、p-PI3K-p85、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308和NF-κB p65蛋白的表達情況。所有切片的免疫組化染色均由2名實驗員在相同條件下完成，結果判定方法如表1所示，A×B≥3計為陽性。

表1 免疫組化染色結果判定方法Tab.1 Judgment method of immunohistochemical staining results

1.4Western blotting檢測胃癌細胞中B7-H4及干性相關蛋白的表達 收集并裂解胃癌細胞，用BCA法檢測總蛋白濃度，然后行10% SDS-PAGE凝膠電泳，上樣30 μg蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉。加入B7-H4 (1:500)、LSD1 (1:1000)、CD133 (1:1000)和SOX9 (1:500)一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1:8000)雜交2 h，Gel Doc凝膠成像儀成像后，以β-actin為內(nèi)參，利用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.5免疫熒光染色檢測胃癌細胞中B7-H4及干性相關蛋白的表達 將MKN28細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，當生長密度達70%時，每孔加入4%多聚甲醛固定10 min，加入0.2% Triton X-100對細胞進行破膜，封閉后，加入B7-H4 (1:100)、SOX9 (1:100)和LSD1 (1:100)一抗4 ℃下孵育過夜，PBS洗滌3次，加入FITC標記的羊抗兔和PE標記的羊抗鼠二抗(1:150)，避光孵育2 h，加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑進行封片，熒光顯微鏡下觀察B7-H4、SOX9和LSD1蛋白的表達情況。

1.6生物信息分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)分析胃癌組織中B7-H4 mRNA的表達，GEPIA在線分析工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析胃癌組織中B7-H4與p16的關系，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)分析B7-H4表達與胃癌患者無進展生存期的關系，Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)分析胃癌組織中B7-H4與PI3K、Akt mRNA的表達情況。

1.7統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件(注冊號1975-01566-C)進行統(tǒng)計分析。陽性率比較采用McNemer χ2檢驗，相關性采用Spearman相關性分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，并使用Log-rank檢驗進行比較。采用Cox比例風險模型分析患者預后的影響因素。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。實驗重復3次。

2 結 果

2.1胃癌組織中B7-H4的表達情況 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，與正常組織相比，胃癌組織中B7-H4 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.001， 圖1A)。免疫組化染色結果顯示，B7-H4在人胚胎胃組織中幾乎不表達(圖1B)，在胃癌組織中的表達明顯多于癌旁非腫瘤性胃黏膜組織(圖1C)。

圖1 胃癌組織中B7-H4的表達Fig.1 The expression of B7-H4 in gastric cancer tissues

2.2B7-H4表達與胃癌臨床病理特征的關系 如表2所示，B7-H4的表達與腫瘤分化程度、pT分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和臨床分期明顯相關(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、大體分型和組織學類型無關(P>0.05)。

2.3B7-H4對胃癌患者預后的影響 Kaplan-Meier生存分析結果顯示，B7-H4陽性表達患者的總體生存率、無進展生存率明顯低于B7-H4陰性表達患者(P<0.001，P=0.021，圖2A、B)。單因素Cox回歸分析結果顯示，腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、B7-H4表達是胃癌患者預后不良的重要因素(P<0.05，圖2C)。多因素Cox回歸分析結果顯示，淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、B7-H4表達是影響胃癌患者總體生存率的獨立預后因素(P<0.05，圖2D)。

2.4胃癌組織中B7-H4表達與細胞周期調(diào)控蛋白及微血管密度(microvessel density，MVD)的關系 免疫組化染色結果顯示，胃癌組織中B7-H4與細胞周期調(diào)控蛋白p16的表達呈正相關(r=0.250，P<0.001，圖3A、B)。GEPIA分析結果顯示，胃癌組織中B7-H4與p16的表達呈正相關(r=0.20，P<0.01，圖3C)。免疫組化雙重染色結果顯示，CD105在胃癌細胞周圍新生毛細血管中呈高表達(圖3D，紅色)。B7-H4陽性組織標本的MVD明顯高于B7-H4陰性組織標本[(121.00±29.00)個/視野 vs. (56.00±6.56)個/視野，P=0.019，圖3E]。

2.5B7-H4表達與胃癌干性相關蛋白的關系 如圖4A 所示，B7-H4和CD133主要表達于胃癌細胞的細胞質(zhì)，而SOX9和LSD1主要定位于胃癌細胞的細胞核。B7-H4與LSD1、SOX9、CD133在胃癌組織中共表達，且呈正相關(r=0.331，P<0.001；r=0.176，P=0.018；r=0.434，P<0.001；圖4B)。免疫熒光和Western blotting檢測結果顯示，胃癌細胞中B7-H4與CD133、LSD1、SOX9共表達(圖4C、D)。

表2 B7-H4表達與胃癌臨床病理特征的關系[例(%)]Tab.2 The relationship of B7-H4 expression to clinicopathologic characteristics of gastric cancer [n(%)]

2.6B7-H4與PI3K/Akt/NF-κB信號通路蛋白表達的關系 免疫組化多重染色結果顯示，B7-H4在胃癌組織中與p-PI3K-p85、p-Akt-Thr308、p-Akt-Ser473和NF-κB p65蛋白共表達，且呈正相關(r=0.269，P<0.001；r=0.282，P<0.01；r=0.214，P=0.005；r=0.157，P=0.034；圖5A、B)。Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，胃癌組織中B7-H4與PI3K、Akt mRNA的表達呈正相關(r=0.403，P<0.001；r=0.351，P<0.001；圖5C、D)。

3 討 論

B7-H4又稱B7x或B7S1，在活化的抗原提呈細胞上表達，能夠抑制T細胞介導的免疫應答。有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在多種癌癥患者血清或腫瘤組織中高表達，其表達高低與腫瘤進展密切相關，如B7-H4在腎癌患者血清中的表達水平明顯高于健康者[5]。膽管癌組織中B7-H4的表達水平高于正常組織，可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的生物標志物[8]。然而，B7-H4在胃癌組織中的表達及其與胃癌患者臨床病理特征的關系研究較少。

B7-H4高表達與多種預后因素相關，如腫瘤分級、分期、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等[6,8]。有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在胃癌組織中呈高表達，且與腫瘤大小、臨床分期等病理特征密切相關[10-12]。本研究通過生存分析和Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中B7-H4高表達與患者預后不良明顯相關，可作為胃癌預后的獨立預測因素。由此，B7-H4可能是預測胃癌患者預后及腫瘤進展的有價值的生物標志物。

B7-H4在食管鱗狀細胞癌組織中呈高表達，且可通過激活IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路促進腫瘤細胞增殖[13]。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，B7-H4可通過核移位促進腎癌細胞增殖和細胞周期進展。血管生成能夠促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，與多種實體腫瘤的進展密切相關[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4與細胞周期調(diào)控蛋白p16的表達及MVD密切相關，提示B7-H4可能通過調(diào)控細胞周期和血管生成促進胃癌進展。

CSCs可通過操縱遺傳因子和非遺傳因子轉(zhuǎn)移及抵抗治療而維持腫瘤細胞生存、促進腫瘤進展[16]。 由于CSCs持續(xù)存在，針對癌癥的化療常隨著腫瘤復發(fā)而失敗。靶向調(diào)控腫瘤細胞干性能夠有效抑制胃癌的進展[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為食管鱗狀細胞癌和前列腺癌細胞干性的調(diào)節(jié)因子，B7-H4在腫瘤組織與細胞系中與SOX2、CD44及LSD1等CSCs標志物的表達密切相關[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中B7-H4與CD133、LSD1和SOX9的表達呈正相關，且B7-H4在胃癌細胞中與CSCs標志物共表達，表明B7-H4參與了胃癌細胞干性特征的調(diào)控，胃癌中B7-H4高表達可促進癌細胞獲得干性特征，從而促進癌癥進展。

圖2 B7-H4對胃癌患者預后的影響Fig.2 Effect of B7-H4 expression on the prognosis of patients with gastric cancer

圖3 胃癌組織B7-H4表達與細胞周期調(diào)控蛋白及MVD的關系Fig.3 The relationships of B7-H4 expression to the cell cycle regulatory proteins and MVD

圖4 胃癌中B7-H4表達與腫瘤干性相關蛋白的關系Fig.4 Relationship of the B7-H4 expressions to the stemness-related proteins in gastric cancer

圖5 B7-H4與PI3K/Akt/NF-κB信號通路蛋白表達的關系Fig.5 Relationship between B7-H4 and the expressions of PI3K/Akt/NF-κB signal pathway protein

多項遺傳和癌癥生物學研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/NF-κB信號通路的異常激活可促進腫瘤進展，并對化療產(chǎn)生耐藥性[20]。靶向抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路能夠降低CD44+前列腺癌干細胞的生存和轉(zhuǎn)移能力[22]。因此，PI3K/Akt/NF-κB信號通路是調(diào)控腫瘤干性的重要機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中B7-H4與p-PI3K-p85、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308和NF-κB p65的表達存在明顯的正相關關系，此外，Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結果表明，胃癌組織中B7-H4與PI3K、Akt mRNA的表達呈正相關，提示B7-H4可能參與調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB信號通路。

綜上所述，本研究結果顯示，B7-H4在胃癌組織中呈高表達，可促進胃癌進展且與患者預后不良相關，這一作用可能與其通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)胃癌的干性特征有關。