利用DREADDs技術(shù)提高大腦皮質(zhì)神經(jīng)元電活動(dòng)對(duì)輕度脊髓挫裂傷小鼠軸突髓鞘再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響

羅美玲，譚波濤，潘璐，伍亞民，劉媛，虞樂(lè)華

1成都市第三人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，成都 610031；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400010；3陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院特殊環(huán)境戰(zhàn)傷防治研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042

髓鞘(myelin)包裹在軸突外，對(duì)維持軸突的正常功能具有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后軸突脫髓鞘現(xiàn)象持續(xù)存在，這可能是導(dǎo)致患者功能恢復(fù)困難的重要原因之一[2]。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物的SCI研究中，雖然觀察到一定程度的自發(fā)性髓鞘再生，但不足以誘導(dǎo)機(jī)體功能恢復(fù)[3-4]，采用一定策略促進(jìn)髓鞘再生是SCI治療的潛在靶點(diǎn)[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元電活動(dòng)調(diào)控著髓鞘的發(fā)育過(guò)程[6-9]。2017年，Li等[10]在大鼠輕度脊髓挫裂傷后，通過(guò)置入電極持續(xù)誘導(dǎo)其大腦初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)(M1)神經(jīng)元放電，發(fā)現(xiàn)大鼠病灶處髓鞘再生活動(dòng)增強(qiáng)。但置入電極創(chuàng)傷較大，且影響的范圍不確定，亟需新技術(shù)來(lái)解決這些問(wèn)題。特定藥物激活特定受體(designer receptor exclusively activated by designer drugs，DREADDs)技術(shù)是一種被廣泛使用的化學(xué)遺傳學(xué)方法，其將載有特異性受體的病毒注射到機(jī)體內(nèi)感染靶細(xì)胞，當(dāng)受體與特定的化學(xué)藥物相結(jié)合時(shí)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞信號(hào)、電活動(dòng)等生理行為的調(diào)控。由于該技術(shù)創(chuàng)傷小，控制范圍相對(duì)精準(zhǔn)，近年來(lái)逐漸被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng) 域[11-14]。2018年，Mitew等[15]使用DREADDs技術(shù)增強(qiáng)小鼠大腦感覺(jué)神經(jīng)元的電活動(dòng)，結(jié)果檢測(cè)到胼胝體受刺激處的軸突髓鞘化程度提高。本研究旨在探討增強(qiáng)神經(jīng)元電活動(dòng)對(duì)脊髓損傷小鼠軸突髓鞘再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 6～8周齡成年雄性C57/BL小鼠，體重25～30 g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。腺相關(guān)病毒pA AV-hSy n-HA-hM3D(Gq)-IRESmCitrine(上海gene-chem)；N-氧化氯氮平(CNO，英國(guó)Bristol公司，Tocris Bioscience)。一抗：雞單克隆抗GFP抗體(1:2000；英國(guó)Abcam公司)；兔單克隆抗NeuN抗體(1:400；美國(guó)Millipore公司)；小鼠單克隆抗cFos 抗體(1:200；美國(guó)santa crutz公司)；大鼠單克隆抗MBP抗體(1:200；美國(guó)Millipore公司)；小鼠單克隆抗Neurofilament抗體(SMI312)(1:200；美國(guó)Biolegend公司)；小鼠單克隆抗Neurofilament 200抗體(NF200)(1:200；美國(guó)Sigma公司)。DAPI(0.5 μg/ml； 美國(guó)sigma公司)。驢血清以及Alex Fluor-488、Alex Fluor-594 和Alex Fluor-647標(biāo)記的二抗均來(lái)自美國(guó)Jackson laborator y。激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1+R，日本尼康公司)。熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。透射電鏡(Hitachi-7500，日本Hitachi公司)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.2方法

1.2.1腺相關(guān)病毒的立體定位注射 所有小鼠均進(jìn)行腺相關(guān)病毒pAAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRESmCitrine的立體定位注射。立體定位注射方法：以小鼠大腦Bregma為原點(diǎn)，在距離中線0.8 mm及1.2 mm的右側(cè)大腦皮質(zhì)，AP方向坐標(biāo)(單位mm)分別為-0.5/+0.8、-1/+0.8、-0.5/+1.2、-1/+1.2，共4個(gè)位點(diǎn)，使用微量注射器向各個(gè)位點(diǎn)注射0.6 μl腺相關(guān)病毒，注射深度0.7 mm。

1.2.2動(dòng)物模型的制備及分組 33只雄性C57/BL小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、SCI組與激活組(n=11)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于病毒注射后2周用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，置于俯臥位，以胸椎彎曲最大處為中心，用小鼠剃毛器去除該區(qū)毛發(fā)。常規(guī)消毒，剪開(kāi)皮膚，顯露頸后脂肪墊，于后緣逐層切開(kāi)，分離肌肉，暴露棘突。根據(jù)T9棘突斜向尾側(cè)、T11斜向頭側(cè)、T10中立稍斜向后的特點(diǎn)，確定T10、T11的位置。咬去T10、T11棘突及相應(yīng)椎板，充分暴露脊髓背面及兩側(cè)。除假手術(shù)組小鼠不接受脊髓損傷外，剩余實(shí)驗(yàn)小鼠均采用Impactor Model-2改良Allen's打擊設(shè)備造成輕度脊髓挫裂損傷，致傷力度為2.5 mm×5 g。打擊完畢后，無(wú)菌縫合傷口，待其蘇醒后觀察記錄有無(wú)異?；顒?dòng)，后放回籠中飼養(yǎng)。術(shù)后給予青霉素肌內(nèi)注射預(yù)防感染，20 000 U/次，共3 d。術(shù)后常規(guī)人工排尿(2次/d或3次/d)，直至恢復(fù)自主膀胱。將SCI后1 d時(shí)后肢運(yùn)動(dòng)功能(basso mouse scale，BMS)評(píng)分高于3分(提示脊髓損傷過(guò)輕)，傷后1周BMS評(píng)分低于3分(提示脊髓損傷過(guò)重)的小鼠剔除，并及時(shí)補(bǔ)充相同數(shù)量的實(shí)驗(yàn)小鼠建模。

1.2.3腹腔藥物注射 將CNO溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，制作儲(chǔ)存液(10 mg CNO/2 ml DMSO)，分裝后儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱，使用時(shí)用生理鹽水稀釋。SCI 2周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受腹腔注射。激活組小鼠接受CNO的工作濃度為1 mg/(kg·d)，SCI組與假手術(shù)組注射等量生理鹽水，1次/d，持續(xù)4周。

1.2.4組織取材及冷凍切片 腹腔注射4周后，各組隨機(jī)抽取8只小鼠進(jìn)行灌注取材。用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，先用0.01 mmol/L PBS經(jīng)心灌注，然后經(jīng)4%多聚甲醛(PFA)灌注后取出小鼠T10的脊髓組織。在4%PFA中固定24 h，并經(jīng)18%、24%、30%的蔗糖溶液梯度脫水，將組織通過(guò)OCT進(jìn)行包埋。腦組織及脊髓組織均行冠狀面冷凍切片，厚度為20 μm，于低溫冰箱凍存，備用。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 小鼠組織切片經(jīng)0.3% Triton X-100通透30 min，10%驢血清封閉30 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜后，Jackson二抗室溫孵育1 h，F(xiàn)luore G Mounting封片。使用激光共聚焦顯微鏡采集免疫組化圖像，通過(guò)ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.2.6透射電子顯微鏡觀察 各組剩余3只小鼠用0.01 mmol/L PBS經(jīng)心灌注后再行2.5%戊二醛溶液經(jīng)心灌注。取出小鼠T10脊髓組織后，固定于4%戊二醛溶液中，用冰盒運(yùn)送到重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院，由技術(shù)人員進(jìn)行脫水、包埋、固定和超薄切片。切片為損傷中心的背側(cè)皮質(zhì)脊髓束，厚度為100 nm。圖像的放大倍數(shù)為12 000倍。髓鞘厚度及G-ratio值(軸突直徑占整個(gè)神經(jīng)纖維直徑的比值)通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算。

1.2.7小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)BMS評(píng)分 手術(shù)前1 d將正常小鼠置于曠場(chǎng)內(nèi)熟悉環(huán)境，術(shù)后第1天開(kāi)始進(jìn)行BMS評(píng)分，觀察時(shí)間為4min，攝像機(jī)錄下視頻后用電腦進(jìn)行分析。評(píng)估時(shí)間點(diǎn)為腹腔注射1、2、4周。

1.2.8不規(guī)則水平樓梯試驗(yàn) 水平橫梯跑道(長(zhǎng)×寬：80 cm×50 cm)由兩塊有機(jī)玻璃組成，橫梯間隔為1.3 cm。動(dòng)物飼養(yǎng)籠放置于跑道末端誘導(dǎo)動(dòng)物通過(guò)橫梯跑道回籠，通過(guò)攝像機(jī)記錄小鼠跑過(guò)31個(gè)橫梯的情況。每次實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)抽掉5根橫梯制成無(wú)規(guī)律間隔跑道(最大間隔為兩個(gè)橫梯)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，志愿者逐幀分析左后肢踩空和滑落橫梯的情況，計(jì)算錯(cuò)誤步數(shù)占總步數(shù)的比率，評(píng)價(jià)小鼠左后肢在水平樓梯上的抓握控制能力。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為腹腔注射1、2、4周。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 6 以及Image J-win64軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料若滿足正態(tài)分布，則采用±s表示。兩組比較，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用t檢驗(yàn)；若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗(yàn)。三組及以上且存在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)并行Tukey事后多重比較。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DRE ADDs技術(shù)對(duì)神經(jīng)元電活動(dòng)的影響 小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)(M1)大量神經(jīng)元表達(dá)腺相關(guān)病毒的標(biāo)簽蛋白mCitrine(GFP熒光染色)，通過(guò)與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN雙染，證實(shí)病毒成功感染皮質(zhì)神經(jīng)元(圖1)。免疫熒光染色結(jié)果可見(jiàn)，三組GFP標(biāo)記的腺相關(guān)病毒感染神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；假手術(shù)組與SCI組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的cFos表達(dá)均較少，而在激活組中，cFos蛋白的表達(dá)量明顯增加，其熒光強(qiáng)度[(4.230±0.633)×104AU]明顯高于假手術(shù)組及SCI組[分別為(2.125±0.405)×104AU和(2.770±0.395)×104AU]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2)。

2.2增強(qiáng)神經(jīng)元電活動(dòng)對(duì)軸突髓鞘再生的促進(jìn)作用 髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)及軸突(axon，通過(guò)SMI312/NF200標(biāo)記)免疫熒光共染結(jié)果顯示，激活組熒光強(qiáng)度高于S CI 組[(1.952±0.240)×107AU vs. (0.191±0.124)×107AU]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3)。

透射電鏡結(jié)果可見(jiàn)，腹腔注射4周后，與SCI組比較，激活組左側(cè)背側(cè)皮質(zhì)脊髓束髓鞘較厚，其G-ratio值(0.787±0.111)與SCI組(0.871±0.080)及假手術(shù)組(0.584±0.101)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.05，圖4)。

圖1 小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元腺相關(guān)病毒感染情況Fig.1 Adeno-associated virus infection of cortical neuron in rats

圖2 小鼠GFP及cFos免疫熒光染色結(jié)果 (×200)Fig.2 GFP and cFos immunofluorescence staining (×200)

2.3增強(qiáng)神經(jīng)元電活動(dòng)對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用 腹腔注射1、2、4周，三組BMS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不規(guī)則水平樓梯試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射1周，激活組及SCI組的錯(cuò)誤率均高于假手術(shù)組(P=0.001)；腹腔注射2周，激活組與SCI組的錯(cuò)誤率降低，且激活組的錯(cuò)誤率明顯低于SCI組(P<0.001)，但高于假手術(shù)組(P<0.001)；腹腔注射4周，激活組與SCI組的錯(cuò)誤率仍高于假手術(shù)組(P<0.001)，但激活組與SCI組的錯(cuò)誤率持續(xù)降低，且激活組的錯(cuò)誤率明顯低于SCI組(P<0.001，表1)。

圖3 MBP與SMI312/NF200免疫雙標(biāo)情況Fig.3 MBP and SMI312/NF200 immunofluorescence costaining

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化和脊髓損傷中，病理性脫髓鞘現(xiàn)象廣泛存在。軸突髓鞘化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅受到各種轉(zhuǎn)錄因子(如Olig2等)的調(diào)控，還受細(xì)胞外環(huán)境(損傷微環(huán)境、軸突本身)的影響[15]。研究顯示，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Olig2或其他分子可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的增殖和軸突髓鞘化[4,16]，但這些研究采用的干預(yù)措施多為脊髓局部病毒注射，臨床轉(zhuǎn)化時(shí)相對(duì)困難。由于脊髓損傷后的局部微環(huán)境非常復(fù)雜，通過(guò)改善微環(huán)境促進(jìn)再生軸突髓鞘化修復(fù)仍充滿不確定性[17]。因此，從軸突電活動(dòng)的調(diào)節(jié)入手，促進(jìn)髓鞘再生修復(fù)成為重要的備選措施之一，也是本研究的出發(fā)點(diǎn)。為了最大限度保留軸突，本研究采用小鼠輕度脊髓挫裂損傷模型，以造成軸突的脫髓鞘改變，方便后續(xù)觀察，與Li等[9]的研究方法一致。

圖4 背側(cè)皮質(zhì)脊髓束透射電鏡觀察結(jié)果Fig.4 TEM of dorsal corticospinal tract

表1 小鼠行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果(±s, n=11)Tab.1 Behavioral test results of mice (±s, n=11)

表1 小鼠行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果(±s, n=11)Tab.1 Behavioral test results of mice (±s, n=11)

SCI. 脊髓損傷；與假手術(shù)組比較，(1)P<0.001；與SCI組比較，(2)P<0.001。

有研究發(fā)現(xiàn)，切斷8 d齡(P8)大鼠的一側(cè)視神經(jīng)，可在短期內(nèi)(4 d)引起該側(cè)增殖OPCs數(shù)量下降90%[18]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的動(dòng)作電位樣放電會(huì)影響共培養(yǎng)體系中OPCs的分化及髓鞘發(fā)育[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用光/化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)調(diào)控皮質(zhì)神經(jīng)元電活動(dòng)后，可觀察到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦白質(zhì)OPCs的增殖反應(yīng)及軸突髓鞘化增強(qiáng)[14,20]。本研究采用了新興的化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)DREADDs來(lái)提高小鼠大腦M1神經(jīng)元電活動(dòng)，結(jié)果顯示，皮質(zhì)神經(jīng)元電活動(dòng)的提高可以誘導(dǎo)MPB的表達(dá)增加，且透射電鏡觀察到激活組的G-ratio值明顯小于SCI組，說(shuō)明軸突髓鞘得到了更好的修復(fù)，該結(jié)果與前期報(bào)道一致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)單獨(dú)飼養(yǎng)以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行人為隔離，結(jié)果會(huì)損害其額葉皮質(zhì)的髓鞘化進(jìn) 程[21]，從反面說(shuō)明了神經(jīng)元電活動(dòng)依賴(lài)的髓鞘修復(fù)在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患中的重要意義。

電活動(dòng)誘導(dǎo)髓鞘修復(fù)的機(jī)制目前尚不清楚。電鏡下觀察到的非突觸“軸突-膠質(zhì)”鏈接被認(rèn)為可能是電活動(dòng)調(diào)控髓鞘形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[22]。軸突通過(guò)囊泡釋放或非囊泡釋放的方式將神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸)釋放至胞外。少突膠質(zhì)細(xì)胞膜受體(如AMPAR)與谷氨酸結(jié)合并激活髓鞘相關(guān)蛋白的表達(dá)[2,23]，從而使得髓鞘更傾向于在電活動(dòng)水平較高的軸突上延伸[24]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腦干OPCs細(xì)胞膜上的鈉通道(Nav1.2)也參與了軸突-膠質(zhì)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程；當(dāng)谷氨酸受體激活后，Ca2+、Na+內(nèi)流可刺激OPCs出現(xiàn)動(dòng)作電位樣放電，并誘導(dǎo)髓鞘發(fā)育[25]。總體來(lái)講，既往研究多集中在“軸突-膠質(zhì)”的細(xì)胞間信號(hào)傳遞層面，對(duì)電活動(dòng)調(diào)控髓鞘形成的下游機(jī)制缺乏深入探索，這也是下一步研究需要關(guān)注的方向。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，三組小鼠的BMS評(píng)分未出現(xiàn)明顯差異，主要原因可能是本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠造成的損傷較輕，軸突以脫髓鞘改變?yōu)橹?，而小鼠BMS量表主要反映小鼠四肢的粗大運(yùn)動(dòng)。另外，通過(guò)不規(guī)則水平樓梯試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)測(cè)小鼠左后肢技巧性運(yùn)動(dòng)功能，發(fā)現(xiàn)在腹腔注射2周后，激活組錯(cuò)誤率明顯低于SCI組(P<0.001)，且在腹腔注射4周后，激活組和SCI組的錯(cuò)誤率持續(xù)下降，但激活組的錯(cuò)誤率明顯低于SCI組(P<0.001)，提示增強(qiáng)神經(jīng)元電活動(dòng)能有效促進(jìn)小鼠SCI后技巧性運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，本研究利用DREADDs技術(shù)提高了大腦皮質(zhì)神經(jīng)元電活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)其能有效促進(jìn)脊髓輕度挫裂傷后的髓鞘再生修復(fù)及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的治療提供了新的思路。