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    蠟樣芽胞桿菌族毒素研究進(jìn)展

    2021-03-31 09:52:20鄭慶芳王東澍呂宇飛王恒樑劉先凱
    微生物學(xué)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:蘇云金腸毒素蠟樣

    鄭慶芳,王東澍,呂宇飛,王恒樑,劉先凱*

    (1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所 病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071)

    廣義的蠟樣芽胞桿菌族主要包括幾個(gè)具有密切關(guān)系的芽胞桿菌,分別為炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)、蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides)、假蕈狀芽胞桿菌(Bacilluspseudomycoides)、韋氏芽胞桿菌(Bacillusweihenstephanensis)和新種(Bacilluscytotoxicus)[1]。其中關(guān)于炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌的研究較為充分。蠟樣芽胞桿菌族細(xì)菌具有非常相似的生化特征和極高的基因組同源性[2],導(dǎo)致物種的區(qū)分在分類學(xué)上很具挑戰(zhàn)性;蠟樣芽胞桿菌族不同物種之間普遍存在質(zhì)粒水平或垂直轉(zhuǎn)移,這可能會(huì)改變它們的表型[3],在轉(zhuǎn)座子、整合子、共軛元件的作用下,在該族成員間傳播遺傳多樣性。決定蠟樣芽胞桿菌族物種表型和致病性的基因大多在質(zhì)粒上,由于蠟樣芽胞桿菌族物種攜帶了大小和數(shù)量不同的質(zhì)粒[4-5],使其在致病性和宿主特異性方面表現(xiàn)出明顯的差異。但是否含有相關(guān)致病質(zhì)粒不能作為區(qū)分蠟樣芽胞桿菌族菌種的依據(jù),需依靠全基因組單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)等基因分析。例如分離株ISS的生理特性和生化測試顯示屬于蠟樣芽胞桿菌,缺乏能編碼炭疽毒力因子的pXO1、pXO2的質(zhì)粒,但多位點(diǎn)序列分型和全基因組單核苷酸多態(tài)性分析表明其屬于炭疽芽胞桿菌[6]。蠟樣芽胞桿菌族細(xì)菌侵入宿主后,一旦不能快速準(zhǔn)確診斷治療,其分泌的毒素上升后將會(huì)對宿主造成很大的危害。本文對炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的毒素在毒素特性、作用原理及致病性等幾個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述(表1),簡單介紹蠟樣芽胞桿菌族成員之間的密切關(guān)系,并對疾病預(yù)防、治療和生物應(yīng)用的前景進(jìn)行了展望。

    表1 蠟樣芽胞桿菌族的主要毒力因子——毒素

    1 炭疽芽胞桿菌毒素

    炭疽芽胞桿菌是革蘭陽性菌,引起的炭疽是一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病[3],一般通過直接接觸、呼吸道吸入、消化道進(jìn)食和針頭注射等途徑感染宿主。炭疽芽胞曾被用于生物恐怖襲擊,是一種潛在的生物戰(zhàn)劑[4]。

    1.1 炭疽毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性

    炭疽毒素由炭疽芽胞桿菌產(chǎn)生,是導(dǎo)致人畜炭疽感染甚至致死的主要原因[9],是一種AB型復(fù)合毒素,保護(hù)性抗原(Protective antigen,PA)為B亞單位,水腫因子(Edema factor,EF)和致死因子(Lethal factor,LF)為兩種A亞單位。PA與EF形成水腫毒素(Edema toxin,ET),可引起宿主細(xì)胞水腫;PA與LF形成致死毒素(Lethal toxin,LT),導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[10]。

    PA是由pXO1質(zhì)粒上的pag基因座編碼,735個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白[11],分子量為83 kD;EF是由pXO1質(zhì)粒上的cya基因編碼,767個(gè)氨基酸組成的鈣調(diào)蛋白依賴的腺苷酸環(huán)化酶,是第一個(gè)在炭疽毒素中發(fā)現(xiàn)的具有酶活性的組分[12];LF由pXO1質(zhì)粒上的lef基因座編碼,共有776個(gè)氨基酸,是一種Zn2+依賴的金屬蛋白酶,包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域[13],其中結(jié)構(gòu)域4具有配位Zn2+的HEFGF基序,能實(shí)現(xiàn)催化活性。

    1.2 炭疽毒素作用原理及致病性

    炭疽芽胞桿菌的芽胞在休眠狀態(tài)下進(jìn)入人體,被局部的吞噬細(xì)胞吞噬并在惡劣條件下生存,在此過程中芽胞萌發(fā)形成繁殖體,并隨著細(xì)菌大量繁殖釋放炭疽毒素[14],部分細(xì)菌從吞噬細(xì)胞逃逸(圖1)。

    圖1 炭疽桿菌與宿主細(xì)胞的相互作用[15]

    炭疽毒素的作用過程:首先PA與靶細(xì)胞表面的受體CMG2 或 TEM8結(jié)合[16],然后被弗林蛋白酶(furin)等細(xì)胞膜內(nèi)切酶裂解,PA裂解后的多肽片段PA63迅速寡聚化形成寡聚體[11];一旦形成寡聚體,PA63便與EF或LF結(jié)合,引發(fā)依賴網(wǎng)格蛋白(clathrin)的內(nèi)吞過程(圖2)。在低pH環(huán)境下,PA63寡聚體可在脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜上形成具有陽離子選擇性的孔狀結(jié)構(gòu)通道[11]。當(dāng)PA與TEM8結(jié)合時(shí),PA在初級內(nèi)體形成孔;當(dāng)PA與CMG2結(jié)合,則需要轉(zhuǎn)運(yùn)至次級內(nèi)體。EF和LF可通過該孔狀通道從內(nèi)體直接轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)或者通過次級內(nèi)體的腔內(nèi)囊泡(ILV)到達(dá)細(xì)胞質(zhì)[17]發(fā)揮其生物學(xué)活性。EF使細(xì)胞內(nèi)cAMP升高,引起宿主組織水腫,影響宿主的心血管、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等[18]。LF裂解MEKs會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞缺氧或壞死,也可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物(ESCRT)中的Alix、Tsg101蛋白和分選神經(jīng)毒素(Sorting Nexin 3,SNX3)至腔內(nèi)囊泡,在Rab11和Rab35的作用下長期保持活性并且能釋放至細(xì)胞外。

    圖2 炭疽毒素的內(nèi)吞過程[20]

    人畜感染炭疽后,會(huì)有1~6 d的無癥狀潛伏期,隨后可能出現(xiàn)1~5 d的類似流感的癥狀,然后會(huì)發(fā)作菌血癥,持續(xù)1~2 d,最后因呼吸衰竭、膿毒癥和休克而死亡[19]。

    2 蠟樣芽胞桿菌毒素

    蠟樣芽胞桿菌能夠產(chǎn)生腸毒素,部分菌株可產(chǎn)生嘔吐毒素(Ccereulide)。人攝入被污染的食品后會(huì)食物中毒,主要臨床表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉。有的蠟樣芽胞桿菌致病菌株也會(huì)感染人的眼部,嚴(yán)重時(shí)引發(fā)突發(fā)性肝臟衰竭,導(dǎo)致死亡[21]。

    2.1 腹瀉型毒素

    2.1.1 腹瀉型毒素的來源及特性 蠟樣芽胞桿菌引起的腹瀉是由于人攝入污染食物后,在小腸中產(chǎn)生腸毒素而引發(fā)的感染。蠟樣芽胞桿菌腸毒素主要包括溶血素BL(Hbl)、腸毒素Nhe、細(xì)胞毒素K(Cyt K)、腸毒素T(Bce T)和腸毒素(Hly II)[4-5],其中只有腸毒素Nhe、溶血素BL 和細(xì)胞毒素K 被證明與胃腸道食物中毒有關(guān)[22]。腸毒素基因廣泛存在于蠟樣芽胞桿菌族中,具有高度分子多樣性[23]。溶血素BL具有溶血性,由L2蛋白、L1蛋白、B蛋白組成, 分別由hblC、hblD、hblA編碼[24],分子量分別為43.5、38.2、37.5 kD;非溶血性的腸毒素Nhe是一種典型的α穿孔類毒素,由nheA、nheB和nheC編碼的NheA、NheB和NheC三種蛋白質(zhì)組成[25],分子量分別為45、39和105 kD;細(xì)胞毒素K也具有溶血性,是一種由CytK編碼的分子量為34 kD的細(xì)胞毒性蛋白,最初在法國爆發(fā)了嚴(yán)重的食物中毒事件后從蠟樣芽胞桿菌NVH391/98中分離出來[26]。

    2.1.2 腹瀉毒素作用原理及致病性 腹瀉毒素的臨床表現(xiàn)主要為攝入污染食物8~16 h后出現(xiàn)腹痛、腹瀉的癥狀,持續(xù)12~24 h。但是腹瀉毒素導(dǎo)致人腹瀉的反應(yīng)機(jī)制尚不完全清晰,普遍認(rèn)為毒素是穿孔毒素使小腸上皮細(xì)胞形成孔洞,Na+和Ca2+流失,細(xì)胞因電位失去平衡而凋亡。具有溶血活性的Hbl毒株會(huì)改變血管的通透性并導(dǎo)致皮膚壞死[4]。Beecher等[27]認(rèn)為Hbl是蠟樣芽胞桿菌導(dǎo)致腹瀉的主要毒力因子,并且在L2蛋白、L1蛋白和B蛋白三種組分的共同參與下使腸毒素毒力達(dá)到最大[4]。腸毒素Nhe的三個(gè)蛋白NheA、NheB、NheC接近10∶10∶1的比例產(chǎn)生,三者共同作用[25]。Nhe蛋白復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合還可能導(dǎo)致胞漿內(nèi)Ca2+和活性氧(ROS)的積聚,激活Fas通路,使細(xì)胞周期在G0/G1期阻滯,引發(fā)細(xì)胞凋亡[28]。劉曉曄等[29]研究表明,Nhe的毒性靶細(xì)胞主要為上皮細(xì)胞,對細(xì)胞的侵襲力呈濃度依賴性,通過抑制其誘導(dǎo)的凋亡信號通路特異性中和抗體可以有效延遲和減弱細(xì)菌對細(xì)胞的侵染。細(xì)胞毒素K有CytK1和CytK2兩種不同的存在形式,CytK1的細(xì)胞毒作用更強(qiáng)[30]。根據(jù)氨基酸序列分類,CytK屬于β-桶孔形成毒素[31],其對人類腸道Caco-2上皮細(xì)胞具有毒性[4,32]。細(xì)胞毒素K通過含甘氨酸的片段穿透細(xì)胞膜,在脂質(zhì)雙分子層中形成陰離子選擇性通道或孔洞。這種毒素的作用方式是在上皮細(xì)胞中形成毛孔,細(xì)胞因胞內(nèi)液體流出而壞死。Castiaux等[33]認(rèn)為細(xì)胞毒素K參與使人腹瀉的過程,但不是腹瀉的致病因子。

    2.2 嘔吐型毒素

    2.2.1 嘔吐型毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性 嘔吐型毒素是一種非核糖體產(chǎn)生的離子型環(huán)狀十二肽,分子量為1.152 kD,分子式為(D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val)3[31](圖3),由位于一個(gè)270 kb的大質(zhì)粒上的嘔吐毒素合成酶(ces)基因簇合成[25,34]。該質(zhì)粒與炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pXO1具有較高的序列相似性[35],被命名為蠟樣芽胞桿菌E4810,也被稱為pCER270[36]。Apetroaie等[37]對13株產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行基因組分析,發(fā)現(xiàn)其16S rRNA基因序列與炭疽芽胞桿菌Ames、Sterne和NC 08234-02完全相同。因此產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌也被單獨(dú)分為一個(gè)亞群,被歸入新種副炭疽芽胞桿菌(Bacillusparanthracis)[38]。

    圖3 嘔吐毒素結(jié)構(gòu)式[1]

    2.2.2 嘔吐毒素作用原理及致病性 嘔吐毒素具有耐熱、耐酸的特性,活性也不受胃蛋白酶的影響[39]。目前還沒有明確嘔吐毒素引起人類嘔吐的機(jī)制,推測嘔吐毒素進(jìn)入人體后與5-HT3受體結(jié)合,刺激迷走神經(jīng)導(dǎo)致嘔吐。嘔吐毒素毒理與纈氨霉素很相似, 但毒性更強(qiáng)[40],能將K+轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)[4],通過抑制脂肪酸的氧化來破壞線粒體的活性,淀粉能促進(jìn)嘔吐毒素的產(chǎn)生[41],因此嘔吐食物中毒事件多與進(jìn)食米面等淀粉含量高的食物有關(guān)[4]。嘔吐毒素在宿主中的潛伏期很短,誤食被污染的食品后0.5 h就會(huì)有頭暈嘔吐,伴有腹瀉、發(fā)燒和四肢無力等現(xiàn)象。瑞士一名17歲男孩進(jìn)食放置了4 d的意大利面和香蒜醬后患上了急性腸胃炎,2 d后出現(xiàn)肝衰竭隨后死亡[21]。嘔吐性食物中毒案例表明,嘔吐毒素還會(huì)導(dǎo)致肝功能衰竭,嚴(yán)重可致死

    3 蘇云金芽胞桿菌毒素

    蘇云金芽胞桿菌的宿主是昆蟲,常被用于病蟲害的生物防治,其芽胞形成過程中產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白是區(qū)別于蠟樣芽胞桿菌家族其他菌株最典型的特征。蘇云金芽胞桿菌作為一種天然的殺蟲細(xì)菌,制成的殺蟲劑安全有效[42],在全世界廣泛應(yīng)用。

    3.1 分泌型毒素

    3.1.1 分泌型毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性 蘇云金芽胞桿菌在對數(shù)生長期產(chǎn)生營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal proteins, VIPs)和分泌型殺蟲蛋白(secreted insecticidal protein,Sip)等可溶性毒素[8]。VIP類蛋白可分為Vip1、Vip2、Vip3和Vip4四類。Vip1和Vip2構(gòu)成二元毒素,能抑制肌動(dòng)蛋白聚合,主要作用于鞘翅目和半翅目昆蟲[11];Vip3的研究最為深入,特異于鱗翅目昆蟲;Vip4是新發(fā)現(xiàn)的一類蛋白,其作用方式和靶標(biāo)范圍尚不清楚[43]。目前已知的Sip蛋白Sip1A對鞘翅目幼蟲有毒性[44]。這些可溶性毒素在天然條件下沒有活性,都是通過氨基酸序列的構(gòu)象變化,將非活性毒素轉(zhuǎn)化為活性毒素。Sip和VIP蛋白的分泌還增強(qiáng)了Cry蛋白的殺蟲活性[45]。在蠟樣芽胞桿菌族中,殺蟲毒素并不是蘇云金芽胞桿菌特有的,有的蠟樣芽胞桿菌分離株也能產(chǎn)生Vip2,并且作用機(jī)理與蘇云金芽胞桿菌一致[46]。

    3.1.2 分泌型毒素的作用原理及致病性 Vip1和Vip2形成典型的AB型二元毒素,Vip2為細(xì)胞毒性A亞基,Vip1為負(fù)責(zé)細(xì)胞毒性Vip2移位到宿主細(xì)胞中的受體亞基[47-49]。B(Vip1)的蛋白水解酶活性被激活后,與細(xì)胞表面受體相互作用,形成同源七聚體,隨后通過內(nèi)吞體將A(Vip2)有毒成分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中[47]。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),A組分就破壞絲狀肌動(dòng)蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞紊亂。目前對于Vip3蛋白的作用方式知之甚少,但是有證據(jù)表明Vip3蛋白是通過在細(xì)胞膜上形成孔隙發(fā)揮毒素作用的。被激活的Vip3A毒素與易感昆蟲的中腸上皮細(xì)胞結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞溶解,幼蟲因腸道被破壞而死亡[8,48]。Sip蛋白的作用方式尚不清晰,可能是毒素使細(xì)胞膜形成孔隙引起細(xì)胞凋亡[44],昆蟲出現(xiàn)敗血癥而死。

    3.2 晶體毒素

    3.2.1 晶體毒素的來源及結(jié)構(gòu)特性 蘇云金芽胞桿菌在芽胞形成期會(huì)產(chǎn)生伴胞晶體。伴胞晶體是一種不溶性殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs),也稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin),可分為Cry(crystal)毒素和Cyt(cytolytic)毒素兩大家族[50-52]。Cry毒素包含3-結(jié)構(gòu)域毒素類、類Mtx1素類、Cry6類、二元毒素類、Cry22類和伴胞素類[52]。Cyt毒素分為Cyt1和Cyt2兩類,在體外具有溶血活性,也被稱為溶細(xì)胞素。Cry毒素分子量在70~140 kD之間,Cyt毒素分子量較小,僅27 kD左右,與Cry毒素沒有很高的同源性[53]。在蘇云金芽胞桿菌殺蟲毒素中,Cry毒素是最大的群體[54],并且與Cyt毒素相比,Cry毒素對幼蟲的毒性更大[55]。蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌唯一的區(qū)別在于蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒中存在抗昆蟲毒素的編碼基因。Cry毒素和Cyt毒素分別由位于大質(zhì)粒上的殺蟲基因cry和cyt編碼[48],攜帶殺蟲基因的質(zhì)粒可以在炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌之間轉(zhuǎn)移[56-57]。

    3.2.2 晶體毒素的作用原理及致病性 與炭疽芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌不同,蘇云金芽胞桿菌雖然對幾種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系有毒性[58],但真正的宿主是節(jié)肢動(dòng)物,其對人類或者其他生物沒有毒性[59]。據(jù)報(bào)道,伴胞素類還能對不同來源的人類癌細(xì)胞具有特異的殺滅活性[58]。Cry毒素在雙翅目昆蟲體內(nèi)有特異性活性,被幼蟲攝入后在其中腸中被蛋白酶溶解,激活為Cry毒素[60]。Cry毒素穿過周轉(zhuǎn)基質(zhì)與中腸上皮細(xì)胞的鈣黏蛋白等受體結(jié)合[61],從而激活細(xì)胞死亡途徑,再與堿性磷酸酶(ALP)或者氨基肽酶(APN)順序結(jié)合,形成低聚物,然后插入膜中,形成孔洞,改變細(xì)胞滲透壓使其死亡[62]。細(xì)菌在破壞昆蟲中腸上皮后進(jìn)入血腔,使其出現(xiàn)敗血癥而死亡[63](圖4)。Cyt毒素體外和體內(nèi)作用機(jī)理不同,在體外具有溶細(xì)胞作用。Cyt晶體被腸道蛋白酶水解激活,Cyt毒素與受體不飽和磷脂結(jié)合形成低聚物,然而低聚物是否在細(xì)胞膜上形成孔洞還不明確。Cyt毒素在體內(nèi)主要對雙翅目昆蟲具有毒力,部分Cyt蛋白的表達(dá)需要蛋白P20的輔助,與Cry毒素具有協(xié)同作用。Cyt毒素的殺蟲譜較窄,本身殺蟲活性不高,但能增強(qiáng)Cry蛋白的殺蟲活性,并且能降低雙翅目害蟲對Cry蛋白的抗性,提高Cry毒素的殺蟲效率[53]。

    圖4 Cry毒素殺蟲的作用機(jī)理[64]

    4 展 望

    外毒素是蠟樣芽胞桿菌族主要的毒力因子,在各方面存在著區(qū)別與聯(lián)系。在結(jié)構(gòu)特性上,炭疽毒素、蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素和蘇云金芽胞桿菌的Cry毒素均由質(zhì)粒編碼,其中嘔吐毒素為肽類毒素,其他為蛋白質(zhì)毒素。在作用機(jī)制上,蠟樣芽胞桿菌腸毒素、蘇云金芽胞桿菌毒素同屬于穿孔類毒素,使細(xì)胞膜形成孔道導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在致病性上,炭疽毒素的受體廣泛分布于各組織器官中,對多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞均具有殺傷作用,危害性大;蠟樣芽胞桿菌毒素主要作用于胃腸道,引發(fā)食物中毒;而蘇云金芽胞桿菌毒素主要?dú)ハx,特異性強(qiáng),對環(huán)境友好,是目前廣泛應(yīng)用的微生物殺蟲劑。

    蠟樣芽胞桿菌族種類繁多,關(guān)系復(fù)雜?;蚪M的高同源性和質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移,可能給蠟樣芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌抗生素治療帶來很大問題。炭疽桿菌水腫毒素在感染中的作用和蠟樣桿菌嘔吐毒素致病機(jī)理目前尚不十分明確,迫切需要探索和開發(fā)阻止炭疽毒素和蠟樣毒素從頭生物合成的方法。蘇云金芽胞桿菌應(yīng)探究如何在不發(fā)生芽胞形成的情況下提高Cry蛋白表達(dá)效率,方便Cry蛋白收集,提高殺蟲劑產(chǎn)量。

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