重離子誘變微生物育種的研究進(jìn)展

汶 瑛,于 雪, 吳玉潔, 張 威, 陳 拓, 劉光琇*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

重離子束即原子序數(shù)大于2且原子核外圍電子剝離或部分剝離形成具有能量的帶電離子束，一般都指正離子[1]。20世紀(jì)以來(lái)，重離子誘變因具有突變率高、突變譜廣[2]、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物育種、疾病診斷和治療[3-4]。重離子束和X射線、γ射線等輻射誘變手段均屬于物理誘變。與傳統(tǒng)誘變方式不同，重離子具有較高的傳能線密度(Linear energy transfer, LET)，離子穿透徑跡上有較大的能量沉積[5]，從而具有更高的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(relative biological effectiveness, RBE)。重離子輻照對(duì)細(xì)胞的直接刻蝕作用會(huì)造成堿基替換[6]、DNA鏈斷裂[7-9]，引發(fā)染色體畸變，如染色體缺失或重排[10]，包括雙著絲粒、無(wú)著絲粒、易位和缺失突變[11-12]，阻礙DNA復(fù)制，從而改變生物細(xì)胞的遺傳特性。近年來(lái)，科研人員發(fā)現(xiàn)LET值可能是影響重離子誘變效果的關(guān)鍵因素[11,13-16]。隨著LET值的增加，DNA單鏈斷裂(single-strand breaks, SSBs)[17]、雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)會(huì)增多，DNA損傷的復(fù)雜性增加[18]。低線性能量轉(zhuǎn)移輻射造成的DSBs可以被快速修復(fù)，但由高LET輻射誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)的DNA團(tuán)簇?fù)p傷(Clustered DNA damage)[19]比單個(gè)DNA損傷修復(fù)更困難或無(wú)法修復(fù)。因此，高LET的重離子束誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生修復(fù)困難的DNA損傷使其在生物育種上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。研究表明，相比于X射線、γ射線和電子、重離子在植物中誘發(fā)突變的效率高10倍以上[20]。隨著工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，微生物產(chǎn)品已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用到抗生素、酶、農(nóng)藥、染料等領(lǐng)域。目前，12C6+離子束主要用于微生物育種和植物育種，能量范圍約為80～1 000 MeV/u[21]。重離子束輻照技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于工業(yè)微生物的高產(chǎn)菌株選育，如芽胞桿菌[22]、黑曲霉[23]、阿維鏈霉菌[24]等，并取得了較好的效果。本文將簡(jiǎn)要總結(jié)近年來(lái)重離子輻照在微生物育種中的研究進(jìn)展，以期對(duì)應(yīng)用重離子改造微生物的遺傳代謝提供參考。

1 重離子輻照在高產(chǎn)微生物育種中的應(yīng)用

由于重離子對(duì)微生物遺傳效應(yīng)的顯著影響，目前通過(guò)輻照誘變獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌種已應(yīng)用于食品、藥品、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。真菌已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)及抗生素生產(chǎn)，重離子誘變真菌突變株已有諸多應(yīng)用。例如，在80 MeV/mu的12C6+離子輻照下獲得的高產(chǎn)黑曲霉菌株檸檬酸產(chǎn)量明顯高于原始菌株[23,25]。Li等[26]在80 MeV/u12C6+輻照條件下篩選出一株能將洛伐他汀(Lovastatin)產(chǎn)量提升4倍的土霉屬菌株Z15-7。Dong等[27]用重離子束對(duì)原始菌株煙曲霉MS13.1進(jìn)行誘變后，突變菌株的β-葡萄糖苷酶活性增加15.1%。

在細(xì)菌類群中，重離子誘變?cè)讷@得高產(chǎn)抗生素菌株上也已取得積極進(jìn)展。例如，阿維菌素被廣泛用于殺菌、殺蟲(chóng)、除螨，使用12C6+離子輻照阿維鏈霉菌，有利于提高阿維菌素的產(chǎn)量[24]。Song等[28]使用12C6+重離子輻照和亞硝酸鈉的聯(lián)合處理，篩選得到的突變株阿維菌素產(chǎn)量提高了23.8%。此外，重離子輻照技術(shù)已成功應(yīng)用于誘導(dǎo)金霉素[29]、角黃素[30]、丁酸[31]高產(chǎn)菌株。

重金屬污染嚴(yán)重影響環(huán)境和人體健康，擁有特定重金屬耐受性的菌株可以在不利條件下生長(zhǎng)并儲(chǔ)存重金屬以減少其對(duì)環(huán)境和人體的危害。已有研究表明，微生物可用來(lái)解決重金屬對(duì)土壤的污染問(wèn)題[32]。Kumar等[33]發(fā)現(xiàn)黃曲霉可吸收污水中的六價(jià)鉻。Li等[32]使用碳離子束輻照提高了ArthrobacterC2的抗Cd2+特性，與原始菌株相比，由12C6+束照射的Cd2+抗性突變菌株C2可以在Cd培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，范圍為20～100 mg/L。因此使用重離子誘變技術(shù)提高微生物重金屬耐受性，將其應(yīng)用于治理鎘污染的廢水和土壤是可行的。此外，12C6+重離子誘變也可提升嗜酸乳桿菌的乳酸積累[34]。

重離子輻照誘導(dǎo)藻類突變株的產(chǎn)生在生物燃料微生物育種、生物工業(yè)中也有應(yīng)用[35]，近年來(lái)，碳排放導(dǎo)致的人為氣候變化，使生物柴油受到了全世界的廣泛關(guān)注，重離子束可作為一種高效的誘變手段誘導(dǎo)高產(chǎn)生物燃料菌株，為清潔能源的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。Ma等[36]使用80 MeV/u 的12C6+離子束輻照微擬球藻，獲得了一個(gè)生長(zhǎng)速度較快的突變體HP-1。與野生型相比，HP-1的生物量積累和最大生長(zhǎng)率分別提高了19%和6%，油脂產(chǎn)量提高了28%。王麗娟等[37]利用12C6+離子束對(duì)極大螺旋藻(Spirulinamaxima)進(jìn)行輻照誘變，發(fā)現(xiàn)突變株的蛋白質(zhì)和多糖含量均高于對(duì)照組。部分近年來(lái)重離子輻照誘導(dǎo)獲得的高產(chǎn)工業(yè)菌株，見(jiàn)表1。

表1 重離子輻照在高產(chǎn)微生物工業(yè)菌育種中的應(yīng)用

2 重離子輻照后突變菌株的篩選策略

重離子輻照誘變可以誘導(dǎo)大量突變體產(chǎn)生，但由于其非定向性造成篩選階段工作量大。更具挑戰(zhàn)性的問(wèn)題是輻照后如何從海量突變體中快速將有應(yīng)用價(jià)值的菌株篩選出來(lái)。傳統(tǒng)篩選主要依靠人工分離純化和搖瓶培養(yǎng)，通量低且速度慢。多孔U型底的微滴板(deep-square deep well microplate, MTP)與搖瓶有較高的相似性，可以替代搖瓶培養(yǎng)，提高培養(yǎng)效率[46-47]?，F(xiàn)有的高通量篩選(High-Throughput Screening, HTS)方法，主要有四大類：①基于檢測(cè)吸光度的篩選策略：直接檢測(cè)目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)或固有顏色[48]；間接檢測(cè)，例如添加pH指示劑、金屬離子螯合劑或通過(guò)酶促反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)，使不易直接檢測(cè)的突變株可通過(guò)吸光度進(jìn)行篩分。②基于檢測(cè)熒光強(qiáng)度的篩選技術(shù)：直接檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的固有熒光信號(hào)；使用熒光染料、探針以及基于化學(xué)或酶聯(lián)反應(yīng)使目標(biāo)菌株產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行篩分。③基于生物傳感器的篩選策略:生物傳感器通常分為基于蛋白質(zhì)的生物傳感器和基于核酸的生物傳感器兩種類型。大多數(shù)基于蛋白質(zhì)的生物傳感器都基于轉(zhuǎn)錄因子(TF)和工程熒光蛋白(FPs)，而基于核酸的生物傳感器主要包括RNA核糖開(kāi)關(guān)和RNA-熒光基團(tuán)(RNA Spinach)以及基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的DNA生物傳感器[49-50]。④基于特殊光譜的篩選策略：例如拉曼光譜(RS)[51]、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)[52]和傅立葉變換近紅外光譜(FTNIR)等。

實(shí)際應(yīng)用中一般會(huì)多策略聯(lián)合或與流式細(xì)胞儀、微流體液滴系統(tǒng)結(jié)合[53]。微液滴可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)真菌孢子的分選，一次篩選試驗(yàn)的試劑消耗可減少百萬(wàn)倍，降低了培育生產(chǎn)菌株的成本[54]。納升級(jí)別液滴的微流體系統(tǒng)已成功應(yīng)用到分離絲狀真菌[55]、分泌維生素B2(核黃素)的乳球菌突變體[56]以及高產(chǎn)α-淀粉酶的酵母菌等。微流體液滴技術(shù)與熒光激活方法結(jié)合，也可顯著提高菌株篩選效率[57]。

菌株不同生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞類型可通過(guò)熒光強(qiáng)度和熒光類型識(shí)別。與目標(biāo)菌株的細(xì)胞化學(xué)或物理特性相關(guān)的熒光信號(hào)使微生物可以通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS)進(jìn)行選擇。理論上，每個(gè)突變體都可以通過(guò)熒光強(qiáng)度被檢測(cè)和分類。由于FACS具有非特異性背景較高的缺點(diǎn)，因此通過(guò)FACS篩選的菌株需要微孔板培養(yǎng)進(jìn)一步篩選。例如，Cao等[58]借助熒光激活細(xì)胞分選術(shù)篩選由常壓室溫等離子誘變(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)處理過(guò)的孢子，再將單個(gè)活孢子分選并噴霧到含有50 μL固體瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中，從5 760個(gè)突變體中獲得了阿維菌素高產(chǎn)突變株，搖瓶和發(fā)酵培養(yǎng)的效價(jià)分別提高18.9%和20.6%。生物傳感器和熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)結(jié)合，也可以極大提高目標(biāo)菌株的篩選效率。例如，Liu等[59]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析得到的啟動(dòng)子構(gòu)建了蘇氨酸傳感器，并利用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)從2 000萬(wàn)突變體庫(kù)中篩選出400多株，進(jìn)而分離到34個(gè)高產(chǎn)蘇氨酸突變株。此外，流式細(xì)胞儀(Flow cytometer, FC)與細(xì)胞熒光染色技術(shù)結(jié)合后也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)突變株的高通量篩選。Wang等[60]通過(guò)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度，篩選出了高產(chǎn)谷胱甘肽的釀酒酵母突變株。

3 重離子束誘導(dǎo)微生物突變的機(jī)制

重離子束誘導(dǎo)的遺傳物質(zhì)改變是獲得穩(wěn)定突變體的生物學(xué)基礎(chǔ)[61]，本文將從輻照造成生物大分子損傷、DNA損傷以及損傷后遺傳物質(zhì)的修復(fù)路徑三個(gè)方面闡明重離子束誘導(dǎo)生物體突變的機(jī)制。

3.1 重離子輻照造成微生物生理生化損傷

細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界接觸的第一道屏障，離子束可損傷或影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、通透性，影響細(xì)胞與環(huán)境之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。α、β和γ粒子可沿軌道電離細(xì)胞組分，從而導(dǎo)致各種解離/電離通道，沿軌道的高能粒子會(huì)產(chǎn)生大量二次電子，繼而對(duì)遺傳物質(zhì)和生物大分子造成更嚴(yán)重的損傷[62]。一般來(lái)說(shuō)，電離輻射主要通過(guò)水的輻射分解[63]誘導(dǎo)自由基[64-65]形成，產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，損傷細(xì)胞膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)[66]。Cao等[67]對(duì)模式生物釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，輻照會(huì)使細(xì)胞膜完整性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸外泄，威脅細(xì)胞生存。對(duì)原核微生物耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)的研究發(fā)現(xiàn)，輻照會(huì)增加蛋白質(zhì)的羰基化，阻礙蛋白質(zhì)的催化活性[68]。細(xì)胞內(nèi)大量參與生命活動(dòng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)受損，會(huì)嚴(yán)重影響正常生命活動(dòng)的進(jìn)行，例如堿基切除修復(fù)的DNA糖基酶，對(duì)輻照引起的DBS及時(shí)修復(fù)具有重要價(jià)值[69]，未修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)的DSBs會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遺傳特性改變甚至凋亡。

3.2 重離子誘導(dǎo)微生物DNA突變的機(jī)制

DNA是遺傳物質(zhì)的基本單位，易受到內(nèi)源性和外源性刺激損傷。內(nèi)源性DNA損傷主要是由DNA與細(xì)胞內(nèi)的水和ROS發(fā)生水解和氧化反應(yīng)產(chǎn)生的，外源性刺激因子通常為紫外線、電離輻射以及化學(xué)誘變劑等[70]。重離子作為物理輻照源的一種，主要通過(guò)電離作用對(duì)生物大分子和細(xì)胞遺傳物質(zhì)造成損傷，從而改變微生物的遺傳代謝特征。

原核微生物因?yàn)榛蚪M相對(duì)較小，重離子束可直接作用于DNA使其電離，或由水輻射分解產(chǎn)生的分解產(chǎn)物(羥基自由基、過(guò)氧化氫、單態(tài)二氧)間接破壞DNA[71]。進(jìn)入細(xì)胞的離子與生物大分子發(fā)生電離作用后會(huì)迅速沉積下來(lái)，電子直接附著在DNA主鏈上導(dǎo)致鏈斷裂[72-73]。沉積的粒子還會(huì)引發(fā)生物細(xì)胞表面的二次粒子和電子濺射, 造成細(xì)胞膜表面穿孔，使后續(xù)粒子更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，最終導(dǎo)致 DNA 損傷和生物體變異[74]。

目前重離子輻照誘導(dǎo)微生物突變的機(jī)制大多是基于模式微生物釀酒酵母來(lái)探究的，釀酒酵母基因組大小約 12 Mbp，和高等真核生物具有高度的同源性，遺傳背景清晰、基因功能研究深入[75-76]。在釀酒酵母中，線粒體是重要的細(xì)胞器，擁有獨(dú)立于核DNA的基因組，能夠編碼與呼吸作用相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[77]，確保呼吸作用為真核細(xì)胞提供能量[78]。新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，促進(jìn)了功能基因組學(xué)和分子育種的研究，目前全基因組序列比對(duì)[79]可揭示重離子如何改變遺傳物質(zhì)。Guo等[80]通過(guò)對(duì)比碳離子束(carbon ion beam, CIB)照射后釀酒酵母的全基因組序列差異發(fā)現(xiàn)在核基因組中，CIB的照射主要引起堿基的置換和一些小的DNA插入/缺失。Szumiel[81]研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中線粒體DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)是輻射損傷的主要靶點(diǎn)之一，而mt DNA的損傷會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理代謝甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[36,82]。高LET的重離子束造成釀酒酵母核DNA損傷的一個(gè)顯著特征是突變位點(diǎn)集中在核小體之間的連接區(qū)附近[83]，而伽瑪射線引起的突變分布均勻；突變譜分析表明，碳離子束和γ射線均能顯著誘導(dǎo)G∶C到T∶A的轉(zhuǎn)換[84]。

3.3 突變DNA的修復(fù)機(jī)制

目前，針對(duì)重離子誘導(dǎo)的微生物遺傳物質(zhì)損傷修復(fù)機(jī)制研究較少，在酵母中，同源重組(homologous recombination, HR)通路在DSBs修復(fù)中占主導(dǎo)地位[84]?？梢宰鰹楦叩日婧思?xì)胞中對(duì)損傷修復(fù)機(jī)制研究的參考。細(xì)胞主要通過(guò)HR[85]和非同源末端連接(classical nonhomologous end joining, C-NHEJ)[86-87]來(lái)修復(fù)DSBs(圖1)。復(fù)雜的DSBs可以有效地激活DNA末端切除，因此，大約85%的復(fù)雜DSBs在DNA修復(fù)過(guò)程中被切除[88]。盡管在不同類型的細(xì)胞中C-NHEJ和HR通路的使用頻率有差異，但研究表明C-NHEJ在整個(gè)細(xì)胞周期中均起作用，而HR在DNA復(fù)制后的S(S phase)/G2(G2 phase)期相對(duì)活躍[89]。C-NHEJ主要通過(guò)多種修復(fù)蛋白的協(xié)同作用連接DSBs的末端，盡管C-NHEJ具有較高的出錯(cuò)率，但其可快速抑制染色體易位，對(duì)保護(hù)基因組的完整性具有重要價(jià)值。Yajima等[88]在宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)，與X射線或激光輻照相比，高LET重離子輻照誘導(dǎo)的DSBs優(yōu)先由HR修復(fù)。HR通常需要以同源序列作為模板，精確地重建損傷丟失的序列。Lee等[90]使用重離子束照射同一供體的淋巴細(xì)胞，在G2期細(xì)胞中觀察到了染色體畸變?cè)黾?，這表明一些DSBs可能通過(guò)易出錯(cuò)的途徑修復(fù)，如替代性末端連接(alternative end joining, A-EJ)和單鏈退火(single-strand annealing, SSA)[91-93]。

圖1 兩種主要的DSBs修復(fù)途徑(修改自文獻(xiàn)[90]、[94])

在人G2期細(xì)胞中，約70%的DSBs由C-NHEJ修復(fù)，30%的DSBs由HR修復(fù)。C-NHEJ 從Ku蛋白與DNA斷裂端結(jié)合開(kāi)始，DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunits, DNA-PKcs)經(jīng)過(guò)磷酸化與Ku蛋白組成DNA-PK(DNA 依賴性蛋白激酶)，促進(jìn)DNA連接酶和X 射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4(XRCC4)、XRCC4類似因子(XRCC4-like factor, XLF)等聚集到斷端形成連接復(fù)合體[94]。隨后，經(jīng)過(guò)多種修復(fù)蛋白因子對(duì)DNA末端的加工修飾作用，完成DSBs修復(fù)。HR過(guò)程起始于MRN復(fù)合體(MRE11/Rad50/NBS1 complex)對(duì)DNA斷端的識(shí)別結(jié)合，同時(shí)還與招募的BRCA1/2和CtIP(CtBP-interacting protein)等，對(duì)斷端進(jìn)行加工。CtIP隨后募集復(fù)制蛋白A(replication protein A, RPA)至加工過(guò)的單鏈上，穩(wěn)定斷端DNA并激活A(yù)TM與Rad3相關(guān)蛋白激酶(ATM-and Rad3-related protein kinase, ATR)，促進(jìn)DNA鏈侵入。HR的關(guān)鍵步驟是Rad51競(jìng)爭(zhēng)替換 RPA，形成核蛋白細(xì)絲，促進(jìn)與姐妹染色單體的重組，完成DNA鏈配對(duì)、延伸之后HR修復(fù)過(guò)程結(jié)束[89,93]。

4 展 望

本文簡(jiǎn)要綜述了重離子輻射的生物效應(yīng)，輻照后突變株的篩選方法以及近年來(lái)通過(guò)重離子輻照技術(shù)選育的一些高產(chǎn)菌株。但目前重離子輻照誘變技術(shù)在篩選微生物突變株方面還存在一些問(wèn)題。①重離子技術(shù)對(duì)設(shè)備要求較高，使其發(fā)展受限。世界范圍內(nèi)僅有幾家重離子加速器裝置，主要分布在中國(guó)(中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所)、日本(NIRS、RIKEN)、德國(guó)(GSI)、美國(guó)(LBL)、法國(guó)(GANIL)、意大利(LNS)等。②不同離子束和輻照劑量對(duì)菌株的誘變效果存在差異。重離子有多種類型，例如16O6+、12C6+、20Ne10+、36Ar18+、40Ca12+、129Xe27+等。目前，12C6+離子束主要被用于微生物育種和植物育種，后續(xù)的研究也可探究不同輻照源對(duì)菌株誘變效果的差異并總結(jié)規(guī)律，以期提升誘變效率。③突變基因在穩(wěn)定遺傳性方面存在的問(wèn)題。在針對(duì)擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)嚴(yán)重的DNA損傷，包括由輻射引起的大量缺失(從kb到Mb)，不能遺傳給后代。這是由于一般子代只能穩(wěn)定遺傳1～4 bp缺失突變[83]，大片段的缺失可能涉及到對(duì)配子發(fā)育或生存能力至關(guān)重要的基因。因此重離子輻照育種是否具有遺傳穩(wěn)定性，還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

盡管重離子誘變?cè)谖⑸镉N方面已經(jīng)取得了一些成功，但目前對(duì)重離子誘變的陽(yáng)性突變株代謝物積累的生理機(jī)制認(rèn)識(shí)有限，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)可結(jié)合多種工具對(duì)重離子誘變的機(jī)制進(jìn)一步研究。在解析機(jī)理的基礎(chǔ)上，將重離子束的高效誘變育種與生物工程技術(shù)融合，定向培育高產(chǎn)微生物菌株，快速提高微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，使其更好地服務(wù)于生產(chǎn)生活。