基于高通量測(cè)序的象山港海域黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)食性分析

孫 鵬,凌建忠,張 輝,唐保軍,姜亞洲

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090

黑鯛(Acanthopagrusschlegelii, Bleeker, 1854)隸屬于鱸形目(Perciformes),鯛科(Sparidae)、棘鯛屬(Acanthopagrus),為暖溫性底層魚類,棲息于近岸巖礁海區(qū)、內(nèi)灣以及咸淡水水域,廣泛分布于包括我國沿海在內(nèi)的西北太平洋溫暖水域[1],為我國東南沿海重要的捕撈品種和增養(yǎng)殖對(duì)象[2- 4]。象山港位于我國浙江中部沿海,是一個(gè)半封閉性港灣,其自然生態(tài)環(huán)境優(yōu)良,是多種漁業(yè)資源的集中分布區(qū),也是多種經(jīng)濟(jì)魚類的繁殖、育幼場(chǎng)所[5- 6]。黑鯛是象山港的優(yōu)勢(shì)魚種和重要捕撈對(duì)象,在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過程中起著重要作用[7]。近年來,象山港所面臨的人為脅迫日趨嚴(yán)重,在此背景下保障黑鯛等重要物種的種群穩(wěn)定對(duì)于該海域具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。

魚類基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)研究是制定魚類資源增殖養(yǎng)護(hù)策略的科學(xué)依據(jù)[8]。攝食習(xí)性作為基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)的重要研究內(nèi)容,是了解不同魚類間營養(yǎng)關(guān)系的基礎(chǔ),同時(shí)也是探討攝食策略、評(píng)估魚類生存狀況和生態(tài)系統(tǒng)功能、構(gòu)建棲息地選擇模型等相關(guān)熱點(diǎn)問題的重要依據(jù)[9- 12]。食性分析方法的準(zhǔn)確性和精確性是影響分析結(jié)果應(yīng)用價(jià)值的重要因素[13]。近年來,隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,該技術(shù)逐漸被應(yīng)用到野生動(dòng)物的食性分析中,有效提升了食性分析的效率,拓寬了食性分析的應(yīng)用范圍,并在數(shù)據(jù)量、靈敏度和分辨率方面較傳統(tǒng)的食性分析方法顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)[14]。

針對(duì)黑鯛食性研究的薄弱現(xiàn)狀,以象山港采捕黑鯛個(gè)體為研究對(duì)象,以18S rDNA為靶標(biāo),利用Illumina Miseq高通量測(cè)序方法探究黑鯛餌料生物組成特征,分析不同齡組黑鯛食性的異同,以期在豐富象山港黑鯛攝食生態(tài)學(xué)認(rèn)知的同時(shí),為制定該海域黑鯛資源增殖養(yǎng)護(hù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用樣品為2019年3至4月份通過桁桿拖網(wǎng)和流刺網(wǎng)收集于浙江寧波象山港海域的黑鯛漁獲樣本,本次研究共選取其中21尾用于食性分析。為保持樣品新鮮及胃含物不被進(jìn)一步分解,捕捉后立即使用丁香酚麻醉處死并于現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行常規(guī)生物學(xué)測(cè)量(體長、體重、性別、胃重、空胃重等),隨即解剖取得胃含物于干冰中保存?zhèn)溆谩Ｅc此同時(shí),采集矢耳石用于年齡鑒定。參考海洋調(diào)查[15]規(guī)范將黑鯛漁獲樣品攝食強(qiáng)度分為5級(jí)(0級(jí)—4級(jí)),分別對(duì)應(yīng)空胃、食物不超過胃腔50%、食物超過胃腔50%、食物充滿不膨脹和食物充滿胃腔并且膨脹等五種狀態(tài)。對(duì)胃飽滿度高的黑鯛個(gè)體,將含量較多的食物物種進(jìn)行單獨(dú)稱重,再從其中定量選取一部分與其他含量少的物種一起混合保存于無菌離心管中；對(duì)胃飽滿度較低的個(gè)體,將所有胃含物一起收集；稱量并記錄離心管中樣品重量；對(duì)空胃?jìng)€(gè)體取其胃內(nèi)粘液進(jìn)行測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)黑鯛樣品的生物學(xué)信息如表1所示。

表1 黑鯛樣品基礎(chǔ)生物學(xué)信息

1.2 DNA提取

胃含物在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)磷酸鹽緩沖液(pH 7.2—7.6)沖洗后進(jìn)行勻漿處理。充分勻漿后的胃含物經(jīng)定量后采用海洋生物DNA提取試劑盒(北京天根)并參照說明書進(jìn)行總DNA提取。所得總DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并采用紫外分光光度計(jì)定量,隨后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Illumina Miseq高通量測(cè)序

使用擴(kuò)增片段約為420 bp的通用引物547F：5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC- 3′和V4R：5′-ACTTTCGTTCTTGATYRA- 3′[16]對(duì)18S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在一個(gè)20 μL體系中進(jìn)行,反應(yīng)體系如下：5×緩沖液4 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL, 正反引物(5 μmol/L)各1 μL,Q5高保真Taq酶(NEB,北京) 0.5 μL,DNA模板10 ng。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性7min,95℃變性45 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,最后72℃延伸10 min,反應(yīng)循環(huán)數(shù)為29。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)和純化后,在 Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)(Illumina,美國)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過初步篩選并去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)。應(yīng)用QIIME軟件對(duì)序列按照97%的序列相似度進(jìn)行歸并和操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分,再選擇OTU中的代表性序列與Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de/)進(jìn)行物種注釋分析以及黑鯛自身序列剔除,并結(jié)合象山港海洋各生態(tài)類型水生生物分布信息對(duì)所注釋物種進(jìn)行人工校對(duì)[5]。并運(yùn)用QIIME軟件對(duì)所得OTU進(jìn)行聚類以分析不同樣品胃含物的物種組成。通過OTU分析可得出餌料生物的多樣性和不同物種的相對(duì)豐度。

為分析不同齡組黑鯛餌料生物組成的差異,基于上述高通量測(cè)序結(jié)果,建立“個(gè)體×餌料生物相對(duì)豐度”矩陣,基于聚類分析對(duì)不同齡組黑鯛個(gè)體的餌料生物組成進(jìn)行二維排序,并利用相似性分析檢驗(yàn)(Analysis of similarities,ANOSIM)檢驗(yàn)不同齡組黑鯛餌料生物組成差異的顯著性[17-18]。為權(quán)衡稀有物種和優(yōu)勢(shì)物種的權(quán)重,在進(jìn)行多元分析前,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了4 次方根轉(zhuǎn)化[19]。

2 結(jié)果

2.1 OTU劃分與分類地位鑒定

經(jīng)Illumina高通量測(cè)序共從21個(gè)樣品中獲得長度約為420 bp的目的片段913254條,樣品的序列數(shù)目最低為30826條,最高為52374條,平均序列數(shù)為(43488±5843)條。21個(gè)樣品經(jīng)過聚類共獲得554個(gè)OTU,不同樣品中含有OTU數(shù)目差異較大,其OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果參見表2。

表2 可操作分類單劃分和分類地位鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

圖1所示為黑鯛胃含物樣本所含餌料生物相對(duì)豐度前20位的分類單元的總體分類等級(jí)樹圖。以不同顏色區(qū)分各分類單元,并通過節(jié)點(diǎn)大小反映它們的相對(duì)豐度分布,可直觀反應(yīng)黑鯛餌料生物的優(yōu)勢(shì)類群。本研究利用高通量測(cè)序方法共在黑鯛胃含物中鑒定出9個(gè)門類的62種餌料生物,這些餌料生物分屬于41個(gè)屬。其中,軟體動(dòng)物門(Mollusca)、節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)和綠藻門(Chlorophyta)的相對(duì)豐度較高,其次是脊索動(dòng)物門(Chordata)、扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)、硅藻門(Bacillariophyta)和環(huán)節(jié)動(dòng)物門(Annelida),線蟲動(dòng)物門(Nematoda)的相對(duì)豐度較低,此外還有部分OTU未能歸屬到已知分類單元。

圖1 黑鯛餌料生物的總體分類等級(jí)樹Fig.1 General classification tree of prey items for the black sea bream

2.2 黑鯛餌料生物組成

表3列舉了相對(duì)豐度排序前20位的黑鯛餌料生物種類。從餌料生物出現(xiàn)頻率和相對(duì)豐度分析,石莼(Ulvalactuca)、熊本牡蠣(Crassostreasikamea)、胸刺水蚤(Centropageshamatus)、日本蟳(Charybdisjaponica)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)和褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)是象山港黑鯛最重要的餌料生物種類,其在黑鯛胃含物中不僅出現(xiàn)的頻率較高,而且相對(duì)豐度較大,6個(gè)種類合計(jì)占據(jù)的黑鯛餌料生物相對(duì)豐度比重高達(dá)60.90%。此外,還有部分餌料生物雖相對(duì)豐度較高但出現(xiàn)頻率較低,如小刀蟶(Cultellusattenuatus)、平角渦蟲(Planoceramultitentaculata)、粗尾溝藻(Torodiniumrobustum)、尖尾全溝藻(Teleaulaxacuta)和海洋線蟲(Chromadorinasp.)等僅出現(xiàn)于單個(gè)樣品中。

從餌料生物組成類型上看,象山港海域黑鯛食性較為復(fù)雜,攝食對(duì)象包含大型藻類(石莼等)、貝類(熊本牡蠣和毛蚶等)、浮游動(dòng)物(胸刺水蚤等)、浮游植物(尖尾全溝藻等)、底棲動(dòng)物(沙蠶Dendronereissp.等)、魚類(褐菖鲉等)和蟹類(日本蟳等)等多個(gè)海洋生物類群,黑鯛展現(xiàn)了較為典型的雜食性特征。

表3 黑鯛主要餌料物種的出現(xiàn)頻率和相對(duì)豐度百分比

2.3 不同齡組黑鯛食性特征

在1至4齡組黑鯛樣品中檢出并鑒定餌料生物種類數(shù)分別21、23、23和17種。其中,石莼、熊本牡蠣、胸刺水蚤、日本蟳、毛蚶和褐菖鲉等重要餌料生物種類在4個(gè)齡組黑鯛樣本中均有分布,上述種類在各齡組黑鯛餌料生物相對(duì)豐度中的占比為44.3%—77.8%。各齡組黑鯛優(yōu)勢(shì)餌料生物種類組成略有差異,如1齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為胸刺水蚤(31.52%,相對(duì)豐度百分比,下同)、石莼(22.13%)和日本蟳(13.72%)；2齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為日本蟳(21.16%)、銼蛤(19.65%)和石莼(16.04%)；3齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為褐菖鮋(18.42%)、毛蚶(18.30%)和石莼(10.80%)；4齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為熊本牡蠣(58.21%)、石莼(8.35%)和褐菖鮋(3.44%)。

聚類分析結(jié)果如圖2所示,象山港黑鯛個(gè)體的餌料生物組成并未呈現(xiàn)明顯的齡組差異格局(橫坐標(biāo)表示個(gè)體的年齡)。相似性分析檢驗(yàn)(ANOSIM)結(jié)果也顯示：不同年齡組黑鯛的餌料生物組成差異尚未達(dá)到顯著性水平(R=0.014,P=0.446)。

圖2 不同齡組黑鯛個(gè)體餌料生物組成的聚類分析圖Fig.2 Cluster of prey composition in black sea bream of different ages

3 討論

魚類營養(yǎng)供應(yīng)是決定其生長發(fā)育的關(guān)鍵因素,也是影響漁業(yè)資源可持續(xù)產(chǎn)出的重要因子。食性分析方法的準(zhǔn)確性和精確性直接關(guān)系到食性相關(guān)理論的探索,同時(shí)也關(guān)乎研究結(jié)果在魚類保護(hù)實(shí)踐過程中的應(yīng)用。黑鯛是我國近海重要的增殖養(yǎng)護(hù)對(duì)象,其增殖養(yǎng)護(hù)措施的精細(xì)化設(shè)置需要食性特征等基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)理論的支撐。目前,國內(nèi)關(guān)于黑鯛在自然海域攝食習(xí)性的研究僅見于柏懷萍[20]等利用胃含物分析法的相關(guān)研究報(bào)道,胃含物分析法雖具簡便易操作的特點(diǎn),可對(duì)個(gè)體較大且消化程度較低的胃含物直接根據(jù)形態(tài)特征加以判別,但對(duì)消化較為充分的胃含物則僅能通過耳石、眼珠、殘肢等一些難以消化的殘留物進(jìn)行鑒定,精確性存在較大欠缺[21- 24]。近年來,食性分析方法也在不斷改進(jìn)和更新[25-29],高通量測(cè)序法因其高效性受到研究人員的青睞。本研究利用高通量測(cè)序法在魚類食性分析過程所具備的高靈敏度的技術(shù)特點(diǎn),對(duì)象山港黑鯛的餌料生物組成進(jìn)行探索研究,研究結(jié)果可為準(zhǔn)確、系統(tǒng)掌握黑鯛攝食習(xí)性提供有益補(bǔ)充。

與傳統(tǒng)的胃含物分析結(jié)果相比[23-24],高通量測(cè)序法所檢測(cè)到的黑鯛主要餌料生物種類組成相似,但高通量測(cè)序法具有明顯的樣品需求少、工作量小和檢出物種多的特點(diǎn)。此外,借助于高通量測(cè)序法的靈敏性高的特點(diǎn),本研究從消化程度較高的空胃黑鯛胃部粘液樣品中檢測(cè)鑒定得到石莼、滸苔、日本蟳、熊本牡蠣、胸刺水蚤、毛蚶以及多種藻類餌料生物種類,并鑒定出部分傳統(tǒng)胃含物分析法未能檢測(cè)到的微藻和小球藻等相對(duì)豐度較低的黑鯛餌料生物種類,高通量測(cè)序法在黑鯛等雜食性魚類攝食生態(tài)研究中顯現(xiàn)出較為明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[23]。此外,發(fā)現(xiàn)18S rDNA的保守性以及目前按照97%的序列相似度進(jìn)行歸并的分析標(biāo)準(zhǔn)也會(huì)影響到高通量測(cè)序?qū)δ承┪锓N鑒別的精準(zhǔn)度,對(duì)此可考慮將克隆測(cè)序法與之相結(jié)合以達(dá)到更優(yōu)的鑒定結(jié)果；而本次研究過程中基于已有的象山港海區(qū)資源調(diào)查名錄,將序列比對(duì)所得的注釋物種加以人工校對(duì)也顯著地提高了所鑒定物種的準(zhǔn)確性。相信隨著測(cè)序技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析技術(shù)的快速發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)在魚類食性研究中將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)果顯示,黑鯛攝食種類范圍較廣,僅本次分析就在黑鯛胃含物中鑒定出9個(gè)門類中的62種餌料生物,這些餌料生物分屬于大型藻類、貝類、浮游動(dòng)物、浮游植物、底棲動(dòng)物、魚類和蟹類等多個(gè)海洋生物類群,黑鯛展現(xiàn)了較為典型的雜食性特征。石莼、熊本牡蠣、胸刺水蚤、日本蟳、毛蚶和褐菖鲉是象山港黑鯛優(yōu)勢(shì)餌料生物種類,其中石莼、熊本牡蠣和褐菖鲉均為典型的巖相生境分布物種,其對(duì)應(yīng)的分布水域與黑鯛(礁棲魚類)基本一致,是象山港黑鯛的主要餌料供給對(duì)象[30]。

早期黑鯛調(diào)查發(fā)現(xiàn),黑鯛幼魚和成魚食性存在差異,其中幼魚以環(huán)節(jié)動(dòng)物和蝦類為主要食物類群,而成魚以藻類、環(huán)節(jié)動(dòng)物、甲殼類和貝類為主[20]。結(jié)果表明,1齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為胸刺水蚤、石莼和日本蟳；2齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為日本蟳、銼蛤和石莼；3齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為褐菖鮋、毛蚶和石莼；4齡黑鯛個(gè)體優(yōu)勢(shì)餌料生物為熊本牡蠣、石莼和褐菖鮋。由此可見,其主要餌料物種組成與之前調(diào)查結(jié)果相似。由于本次研究所捕捉黑鯛個(gè)體均為1年齡以上的成魚,故未能對(duì)幼魚食性進(jìn)行分析比較。而對(duì)本次不同年齡組之間的比較發(fā)現(xiàn)1至4齡黑鯛個(gè)體的攝食食性有所差別,其中1齡和2齡個(gè)體中優(yōu)勢(shì)餌料生物相似性較高,而3齡和4齡個(gè)體中的優(yōu)勢(shì)餌料生物相似性較高。同時(shí),我們結(jié)合黑鯛年齡和體長特征,利用相似性分析檢驗(yàn)(ANOSIM)檢驗(yàn)了不同年齡組黑鯛成魚個(gè)體的餌料物種分布特征,但結(jié)果顯示不同年齡組黑鯛餌料物種組成并無顯著性差異?？紤]到本次研究分析所用的黑鯛個(gè)體數(shù)量有限,這可能會(huì)影響到黑鯛不同齡組間的餌料物種差異分析；同時(shí),由于魚類攝食受自身生長和環(huán)境餌料生物組成等諸多因素的影響,黑鯛樣品所處的具體生活環(huán)境也可對(duì)餌料物種組成造成影響,如本次檢出物種中蝦類和螺類樣品較少,且部分其他食物種類也與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果存在一定的差異。鑒于上述情況,建議在后續(xù)研究中適當(dāng)擴(kuò)充黑鯛樣品采集范圍(包括取樣季節(jié)、樣品規(guī)格、采集區(qū)域和樣品數(shù)量等),并結(jié)合樣品采集水樣的生物和環(huán)境信息,系統(tǒng)分析黑鯛攝食對(duì)象、攝食策略等營養(yǎng)生態(tài)特征,以期為科學(xué)制定黑鯛增殖養(yǎng)護(hù)措施、保持黑鯛物種種群穩(wěn)定性提供科學(xué)依據(jù)。