有機(jī)污染物芘脅迫下白菜生理特性變化規(guī)律

杜志偉,楊肖松, 劉月仙,*,解小凡,張瑞麗,張 萌,王 偉

1 中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 北京 100049 2 中國礦業(yè)大學(xué)化學(xué)(北京)與環(huán)境工程學(xué)院, 北京 100083 3 煤炭開采水資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102211 4 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一類具有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的芳香烴,其中有16 種被美國環(huán)保署確定為優(yōu)先控制的有機(jī)污染物質(zhì)[1],是典型的持久性有機(jī)污染物,具有潛在致癌性、致突變性和毒性的特點(diǎn)[2],近幾十年來備受關(guān)注。PAHs主要由不完全燃燒的過程形成,如化石燃料燃燒、生物質(zhì)燃燒和石油泄漏等[3]。多環(huán)芳烴釋放到環(huán)境中后,可通過干濕大氣沉降和直接空氣-土壤交換的方式沉積到土壤中[4],土壤作為重要的環(huán)境介質(zhì),承擔(dān)著90%以上的PAHs環(huán)境負(fù)荷[5]。近些年來,土壤污染問題日益嚴(yán)重,對(duì)人體健康以及生態(tài)環(huán)境都造成了一定的威脅,根據(jù)全國2005- 2013年全國土壤污染普查結(jié)果顯示,我國部分地區(qū)土壤污染嚴(yán)重,全國現(xiàn)有近1/5耕地受到不同程度的污染,多環(huán)芳烴類有機(jī)物污染點(diǎn)位超標(biāo)率為1.4%[6]。與低分子量PAHs(≤ 3個(gè)苯環(huán))相比,高分子量PAHs(≥4個(gè)苯環(huán))更難被降解而在土壤環(huán)境中長期存在[7]。而芘是有4個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的多環(huán)芳烴,與PAHs有良好的相關(guān)性,是高分子量多環(huán)芳烴的典型代表,常作為監(jiān)測(cè)的指示化合物[7- 8]。Peng等[9]測(cè)得北京土壤中的芘濃度范圍在6.9—1560.8 μg/kg,平均值為127.3 μg/kg；朱媛媛等[10]對(duì)天津市土壤的多環(huán)芳烴進(jìn)行分析,芘含量在12.5—183 μg/kg之間；李靜雅等[11]在長江三角洲區(qū)域11個(gè)行政市測(cè)定表層土壤中16種優(yōu)控PAHs濃度范圍10.1—3058.6 μg/kg。

目前,已有不少針對(duì)多環(huán)芳烴對(duì)不同植物生長影響的研究,不同植物對(duì)有機(jī)污染物的毒性響應(yīng)具有明顯差異[12]。較高濃度的PAHs對(duì)植物生長具有抑制作用,高濃度多環(huán)芳烴脅迫下的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、辣椒(CapsicumannuumL.)、小麥(Triticumacstivnm)、白菜(Brassicapekimensis)、西紅柿(Solanumlycopersicum)、玉米(ZeamaysL.)和紅豆(Vignaangularis)都出現(xiàn)了生長受抑制的現(xiàn)象[13]；蔡順香[14]研究發(fā)現(xiàn):50—200 mg/kg施芘水平下菠菜幼苗葉片的各項(xiàng)葉綠體色素含量與對(duì)照無顯著差異,施芘濃度大于50 mg/kg時(shí)株高、根和莖葉的鮮重顯著降低,且丙二醛積累量提高；而Maliszewska-Kordybach等[15]研究發(fā)現(xiàn),玉米、燕麥等作物在低于10 mg/L的PAHs質(zhì)量濃度的土壤中時(shí),具有刺激其生長發(fā)育的作用。白菜是我國主要種植的蔬菜,也是大量食用的蔬菜,目前針對(duì)不同品種的白菜在多環(huán)芳烴脅迫下的生理特征研究較少,以華北地區(qū)常見的11種白菜為研究對(duì)象,探究有機(jī)污染物芘對(duì)白菜的生理指標(biāo)影響具有重要意義,旨在為PAHs對(duì)植物的毒害機(jī)理研究和蔬菜的安全生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 研究材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取我國華北地區(qū)常見的11個(gè)不同品種的白菜作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象：京翠60(JC- 60),京秋65(JQ- 65),京春娃2號(hào)(JCW- 2),京春白(JCB),京翠70(JC- 70),京春綠(JCL),北京桔紅二號(hào)(JH- 2),中白50(ZB- 50),吉紅308(JH- 308),菊心(JX)和快菜1號(hào)(KC- 1),均購自北京市農(nóng)林科學(xué)院京研益農(nóng)種業(yè)科技有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。芘(>95%,GC)購自上海阿拉丁生化股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)土壤取自北京市懷柔區(qū)中國科學(xué)院大學(xué)后山,自然風(fēng)干后挑出碎石枝葉過3 mm篩,儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)土壤有機(jī)質(zhì)含量為5%,pH為8.42；土壤中芘的濃度為0.09 mg/kg,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[16],土壤中的芘含量<0.4 mg/kg時(shí),可以忽略不記。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)楊肖松等[7]進(jìn)行的芘對(duì)白菜生長預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)置5、15、45、135、405 mg/kg以及對(duì)照組共六個(gè)芘濃度處理水平。土壤毒性配置方法參照孫鐵珩[17]推薦的方法,具體為：稱取35 g芘于適量的丙酮中溶解,加入到10 kg的土壤中,即芘濃度為3500 mg/kg的土壤,置于通風(fēng)櫥中過夜,待丙酮完全揮發(fā)后攪拌均勻。在上述土壤中分別加入不同質(zhì)量且未被芘污染的土壤,進(jìn)行稀釋攪拌,配置成不同處理濃度的土壤。分別稱取六種芘處理濃度的土壤各7 kg于高18 cm、上口徑為23 cm、下口徑為21 cm的花盆中。為了確保白菜有足夠的養(yǎng)分進(jìn)行正常的生長,每個(gè)花盆中加入氮(CO(NH2)2)、磷(KH2PO4)、鉀(KCl)肥各2.24、3.07、0.32 g,同時(shí)澆水至田間持水量平衡一周。白菜種子需預(yù)先進(jìn)行消毒處理,在75%酒精中浸泡5 min后,用蒸餾水洗凈,再置于55°C的水中攪拌浸泡。

將11種白菜種子在每個(gè)花盆中播種15粒,置于溫室中培養(yǎng),平均低溫24℃,平均高溫32℃。待長出四片真葉后,每盆中留一株白菜幼苗,每個(gè)品種進(jìn)行3次重復(fù)。白菜從播種到成熟收獲共歷時(shí)80 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)生物量(鮮重)的測(cè)定

白菜整株收獲后用自來水沖洗掉表面的土及灰塵,再用去離子水沖洗三遍,濾紙擦干表面水分后,用天秤稱取植株的重量。

(2)丙二醛(MDA)的測(cè)定

丙二醛的含量采用植物MDA檢測(cè)試劑盒(TBA比色法)測(cè)定,購自北京雷根生物科技有限公司。具體步驟為稱取0.4 g樣品剪碎后,加入4 mL組織勻漿液充分研磨,經(jīng)4000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,先后分別加入0.005 mL抗氧化劑、TBA工作液,測(cè)定其在450、532、600 nm處的吸光度值。

(2)葉綠素的測(cè)定

葉綠素a和葉綠素b的含量測(cè)定根據(jù)Gitelson等[18]采用的方法,稱取待測(cè)白菜葉片0.1 g置于研缽中,加入少量95%乙醇和少量的CaCO3,研磨成白色勻漿,過濾至25 mL比色管中,用95%的乙醇定容后,于波長665、649、470 nm處測(cè)定吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2016、SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和多因素方差分析,采用最小顯著性差異法(LSD,P<0.05)進(jìn)行多重比較；利用Origin 2018進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量(鮮重)

白菜的生物量在不同濃度芘作用下以及不同種類之間的雙因素方差分析表明,白菜的種類和芘濃度均對(duì)生物量有顯著影響(P<0.001),且白菜種類和芘濃度存在交互作用。表1顯示的是11種白菜生物量在不同濃度芘作用下的變化情況,總體呈現(xiàn)兩種規(guī)律：一是倒“U”型,二是隨著芘濃度的增加,白菜生物量降低。其中,京春娃2號(hào)、京春白、京翠70、京春綠、北京桔紅二號(hào)、中白50、吉紅308、菊心、快菜1號(hào)這9種白菜品種的生物量隨著芘濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),即倒“U”型。與對(duì)照組相比,9種白菜在中低濃度芘脅迫下,快菜一號(hào)的生物量變化最大,在添加芘濃度為45 mg/kg時(shí),生物量顯著升高了178.62%,而品種京翠70是這9種白菜品種變化最小的,在添加芘濃度為15 mg/kg時(shí)生物量僅升高16.12%,其他7種白菜生物量上升的變化范圍為17.57%—158.40%。京翠60、京秋65這兩種白菜品種的生物量隨著芘濃度升高而逐漸降低；其中,在405 mg/kg芘濃度的脅迫下生物量顯著降低,京翠60的生物量降低率(59.25%)高于京秋65生物量降低率(47.96%)。

2.2 丙二醛(MDA)

根據(jù)雙因素方差分析,不同白菜品種的丙二醛(MDA)含量存在顯著性差異(P<0.001)。丙二醛是反映植物脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo),是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,能夠間接的反映植物在受到外界的脅迫時(shí),細(xì)胞的受損程度,MDA含量越大,膜受損程度越大[19]。如圖1所示,華北地區(qū)11種白菜在不同濃度土壤芘脅迫下的MDA含量呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律：一是不同濃度芘脅迫下,白菜MDA含量無顯著性變化,以京春娃、京春白和中白50這3種白菜品種為代表,與對(duì)照組相比,京春娃的MDA下降率最高(26.35%),京春白上升率最高(19.9%)；二是白菜MDA含量隨芘濃度的增加而呈上升趨勢(shì),如京翠60、京秋65、吉紅308和快菜一號(hào)這四種白菜品種,與對(duì)照相比,MDA含量升高率為0.18%—98.13%,且在高濃度405 mg/kg芘處理時(shí),MDA含量顯著性升高。三是白菜MDA含量在不同芘脅迫下均低于對(duì)照組,如京翠70、京春綠和北京桔紅二號(hào)這3個(gè)白菜品種的MDA在低濃度芘脅迫時(shí)(5 mg/kg)顯著降低,降低率分別為25.72%、60.38%、26.8%；高濃度芘脅迫(135、405 mg/kg)下與對(duì)照組相比,京翠70的 MDA含量顯著降低(41.51%),京春綠和北京桔紅二號(hào)略有下降但不顯著。

表1 芘脅迫對(duì)白菜生物量的影響

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母代表在0.05水平上差異顯著

圖1 芘脅迫對(duì)白菜丙二醛(MDA)的影響Fig.1 Effect of pyrene stress on Malondialdehyde content of Chinese cabbage圖中同一品種白菜小寫字母相同表示濃度間無顯著性差異;京翠60(JC-60);京秋65(JQ-65);京春娃2號(hào)(JCW-2);京春白(JCB);京翠70(JC-70);京春綠(JCL);桔紅2號(hào)(JH-2);中白50(ZB-50);吉紅308(JH-308);菊心(JX);快菜1號(hào)(KC-1)

2.3 葉綠素

對(duì)葉綠素a和葉綠素b進(jìn)行雙因素方差分析,結(jié)果顯示白菜的品種和芘的濃度都會(huì)顯著影響白菜葉綠素a和葉綠素b的含量(P<0.001)。葉綠素是高等植物進(jìn)行光合作用的重要色素,直接影響到植物的光合作用,葉綠素含量的變化可以作為衡量葉片衰老的重要生理指標(biāo)[20],也能在一定程度上反映植物的代謝情況和抗逆性[21]。如圖2和圖3所示,同種白菜的葉綠素a和葉綠素b含量隨著土壤芘濃度的增加呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。而11種白菜的葉綠素含量在芘脅迫下存在不同的變化規(guī)律：一是葉綠素含量在低濃度芘脅迫下(5 mg/kg)有上升趨勢(shì),如京翠60、京秋65和菊心三種白菜,其中京翠60的葉綠素a和葉綠素b含量顯著升高,分別升高106.9%和102.8%；在中低濃度芘處理(15、45 mg/kg)下,葉綠素含量略有下降趨勢(shì),相比對(duì)照組,葉綠素a和葉綠素b分別降低了9.86%—12.34%和8.25%—20.21%；在高濃度(135、405 mg/kg)脅迫下與對(duì)照組相比,京翠60的葉綠素a含量顯著升高136.32%,京秋65的葉綠素b含量顯著增加157.53%。二是中低濃度芘脅迫下下降,高濃度上升的變化規(guī)律,如京春娃、北京桔紅、中白50和快菜一號(hào)四種白菜在5 mg/kg芘濃度下葉綠素a含量降低了7.83%—23.71%,葉綠素b含量降低了16.9%—39.74%；在中高濃度(45、135、405 mg/kg)的芘脅迫下呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),葉綠素a和b的增加率分別為1.53%—21.34%和2.51%—18.86%。三是葉綠素含量隨著脅迫濃度的增加而逐漸升高,如京春白、京翠70、京春綠和吉紅308四種白菜,在405 mg/kg濃度芘脅迫下,4種白菜的葉綠素a和葉綠素b分別升高了84.1%—122.53%和77.37%—120.29%。

圖2 芘脅迫對(duì)白菜葉綠素a的影響Fig.2 Effect of pyrene stress on chlorophyll a content of Chinese cabbage圖中同一品種白菜小寫字母相同表示濃度間無顯著性差異

圖3 芘脅迫對(duì)白菜葉綠素b的影響Fig.3 Effect of pyrene stress on chlorophyll b content of Chinese cabbage圖中同一品種白菜小寫字母相同表示濃度間無顯著性差異

3 討論

3.1 芘脅迫對(duì)生物量的影響

植物的生物量變化是植物在受到脅迫時(shí)最直觀的表現(xiàn)指標(biāo),通常植物對(duì)多環(huán)芳烴的脅迫有一定的耐受閾值,閾值內(nèi)植物生物量變化不明顯,閾值以外則生長受到抑制[22]。在本研究中,生物量在芘脅迫下表現(xiàn)兩種變化規(guī)律,京翠60和京秋65這兩種白菜品種隨著芘濃度的增加,生物量有逐漸下降趨勢(shì),可能是PAHs阻礙植物根系從被污染土壤中吸收養(yǎng)分和水,進(jìn)而影響植物的生長和生理特性[23]。而另外9種白菜生物量呈現(xiàn)“倒U型”變化趨勢(shì),在芘脅迫下生物量表現(xiàn)為低濃度升高,高濃度降低,這與尹東雪等[24]采用芘對(duì)擬南芥毒性效應(yīng)的研究以及陸志強(qiáng)[25]、洪有為等[26]對(duì)秋茄在芘脅迫下的生長情況研究結(jié)果是一致的。高濃度的多環(huán)芳烴對(duì)植物的生長具有抑制的作用,使植物的根毛減少、葉片發(fā)黃、株高下降、生物量顯著降低[13]。而在低濃度的多環(huán)芳烴脅迫時(shí),對(duì)植物起到了刺激作用,目前大多認(rèn)為低濃度的刺激作用可能是因?yàn)镻AHs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與植物體內(nèi)的生長素等內(nèi)源激素具有相似性,使其具有與生長素相似的作用[27],促進(jìn)植物生長。

3.2 芘脅迫對(duì)MDA的影響

多環(huán)芳烴會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生氧化脅迫,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),造成細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率增大,丙二醛(MDA)含量可以一定程度上反應(yīng)細(xì)胞受傷害和對(duì)逆境的反應(yīng)程度[28]。白菜在不同芘的濃度條件下,丙二醛含量存在不同的變化規(guī)律。在本研究中部分白菜品種在中低濃度的芘處理下MDA含量無顯著變化,在高濃度芘脅迫下,白菜MDA含量均顯著升高,這與蔡順香等[29]人和朱燦等[30]人的研究結(jié)果一致,說明這些白菜品種在中低濃度芘脅迫下細(xì)胞受到的損害較小,而高濃度的芘會(huì)對(duì)植物造成一定程度的損傷。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)部分白菜品種在受到芘脅迫時(shí),MDA含量均顯著降低,在脅迫濃度范圍內(nèi)均未高于對(duì)照組,推測(cè)多環(huán)芳烴在一定的濃度下會(huì)對(duì)植物的正常應(yīng)激性機(jī)制造成傷害[21,23],長時(shí)間暴露在多環(huán)芳烴脅迫下抗氧化酶的酶活力會(huì)被誘導(dǎo)[32- 33],導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的MDA含量降低。也存在植物在多環(huán)芳烴脅迫下代謝失衡產(chǎn)生活性氧,作為信號(hào)分子傳導(dǎo)到植物體內(nèi)后觸發(fā)抗氧化系統(tǒng)的防御機(jī)制,進(jìn)而適應(yīng)環(huán)境[34- 35]。

3.3 芘脅迫對(duì)葉綠素含量的影響

一般認(rèn)為土壤有機(jī)物污染會(huì)破壞植物體內(nèi)的葉綠素合成酶,或者激活葉綠素降解酶,導(dǎo)致葉綠素含量下降[20],但也存在抗逆性較強(qiáng)的植物,在有機(jī)物脅迫下葉綠素含量上升[36]。我們研究發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴芘的添加量會(huì)對(duì)白菜葉綠素含量產(chǎn)生一定的影響,如京翠60、京秋65等這些白菜品種中的葉綠素含量在低濃度芘處理下有上升的趨勢(shì),在中濃度的脅迫下略有下降的趨勢(shì),變化不顯著,在高濃度脅迫下與對(duì)照組相比葉綠素含量顯著升高。唐璇[37]研究發(fā)現(xiàn),中濃度的多環(huán)芳烴脅迫蘿卜幼苗,葉綠素b的合成受到抑制,高濃度脅迫下促進(jìn)葉綠素a的合成,同時(shí)尹東雪等[24]用芘對(duì)擬南芥生物毒性的研究中,葉片的葉綠素呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),與本實(shí)驗(yàn)在中低濃度下的反應(yīng)相似,可能是在低濃度的污染下,相關(guān)的酶活性未受到抑制,植物可以充分自我調(diào)節(jié)。同時(shí),京春白等4種白菜隨著芘濃度的增加,葉綠素含量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì),在高濃度芘脅迫下與對(duì)照組相比顯著升高。與蔡順香等[38]用芘對(duì)小白菜(日本華京冠菜)幼苗脅迫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反,而孫成芬等[39]在土壤萘對(duì)玉米苗期的生理影響的研究中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)3周后,葉片中的葉綠素含量大于對(duì)照組,陸志強(qiáng)[40]也通過芘和萘對(duì)秋茄幼苗的脅迫中發(fā)現(xiàn)了對(duì)葉綠素的促進(jìn)效應(yīng),在與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。京春娃等白菜品種中的葉綠素含量呈現(xiàn)中低濃度芘脅迫下降,高濃度上升的變化趨勢(shì),變化不顯著。楊志峰等[41]通過芘對(duì)辣椒的脅迫實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)芘濃度為50 mg/kg時(shí)葉綠素含量達(dá)到最小值,而中高濃度脅迫下葉綠素略有增加,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。賴聞玲等[42]研究菖蒲在萘脅迫下的生理影響時(shí)發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間推移菖蒲逐漸適應(yīng)萘污染,葉綠素恢復(fù)正常水平,推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中白菜在高濃度芘脅迫下生長能夠逐漸適應(yīng),葉綠素開始升高。有研究[43]表明,脯氨酸是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),會(huì)隨著芘濃度的增加而急劇增長,能夠緩解芘脅迫下對(duì)細(xì)胞的傷害使葉綠素含量升高。

4 結(jié)論

(1)華北地區(qū)11種白菜在中低濃度(5、15、45 mg/kg)的芘脅迫下,生物量未顯著下降甚至出現(xiàn)升高的現(xiàn)象,說明白菜在中低濃度芘污染的土壤中對(duì)其生長抑制作用較小,而在高濃度(135、405 mg/kg)脅迫時(shí)不能夠正常的生長。

(2)除京翠60、京翠70和京春綠外,其余8種白菜MDA含量在中低濃度的脅迫下變化無顯著性差異,也說明白菜在中低濃度下受到細(xì)胞損害較小,其中京春娃二號(hào)、京春白和中白50即使在高濃度芘脅迫下與對(duì)照組相比,MDA含量也未有顯著增加,推測(cè)其對(duì)芘的耐受性較好。

(3)11種白菜中葉綠素a含量均大于葉綠素b含量,且在不同芘濃度的脅迫下兩種葉綠素具有相似的變化規(guī)律和顯著性,即芘對(duì)白菜葉綠素a和b的脅迫作用相似。在中低濃度芘脅迫下,京翠60、京翠70和京春綠葉綠素含量顯著升高,京春娃二號(hào)葉綠素含量顯著降低。其余7種白菜品種均變化不顯著,且在高濃度脅迫中有升高的趨勢(shì),與植物自身抗性的閾值有關(guān)[41],具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

大部分白菜在中低濃度的土壤芘脅迫下受到影響較小,高濃度脅迫下受到損傷無法正常生長。其中,京春白和中白50對(duì)芘的脅迫具有良好的耐受性,生理指標(biāo)變化較?。痪┐?0和京春綠對(duì)于中低濃度芘脅迫下較為敏感,生理指標(biāo)變化較大,可以作為中低濃度芘污染土壤的指示作物；高濃度芘處理下,京秋65、吉紅308的生理指標(biāo)變化顯著,可以作為高濃度芘污染土壤的指示作物。